먼저 이식을 위한 최적의 조건에서 성장한 백혈병 세포를 얻습니다. 세포를 세는 후 300g에서 실온에서 5분 동안 펠릿화하고 상층액을 버립니다. CM-Dil 염색의 경우 작업 용액에 세포를 재현탁시켜 100마이크로리터에서 6개 세포의 10배의 10을 얻고 섭씨 37도에서 10분 동안 배양합니다.
실온에서 10mL의 1X HBSS로 세포를 두 번 세척합니다. 5 분 동안 300g에 세포를 펠릿 한 후에, 40의 조밀도를 달성하기 위하여 1%FBS를 포함하는 PBS에서 그(것)들을 현탁시키십시오, 마이크로리터 당 000 세포. 그런 다음 마이크로 인젝터와 펌프를 켭니다.
사출 압력을 제곱인치당 9-11파운드로 설정하고 주입 시간을 0.5초로 설정하여 바늘을 자르고 오리피스를 설정합니다. 약 5 마이크로리터의 종양 세포 현탁 라인을 기포가 형성되지 않도록 한 번에 조심스럽게 마이크로니들에 로드합니다. Dumont 5 겸자를 사용하여 바늘 끝을 잘라 배출을 지지할 수 있는 구멍을 만듭니다.
그런 다음 현미경으로 건강한 제브라피시 배아를 선택하고 발달 이상이 있는 배아를 제거합니다. 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 마취된 배아를 집어 들고 1.5% 아가로스 플레이트에 10-15개를 측면 위치에 배열합니다. 배아 생존을 위한 최소한의 양을 남기기 위해 과도한 물을 제거하십시오.
그런 다음 광학 현미경으로 바늘이 잘 잘리고 세포가 있는지 확인합니다. 400 내지 600개의 세포에 해당하는 10 내지 15 나노리터를 배아의 난황에 0.2 내지 0.3초 동안 주입한다. 모든 배아를 주입한 후 신선한 배아 물에 모으십시오.
주입 1시간 후, 세포의 볼루스를 모니터링하여 최적의 염색 또는 양호한 볼루스를 가진 배아와 열등한 염색 또는 열등한 볼루스를 가진 배아를 분리합니다. CM-Dil 염색 및 형광 단백질 마킹을 통해 현미경으로 질병 진행을 모니터링할 수 있었습니다. 그리고 배아의 생존율은 유전적으로 구별되는 두 개의 백혈병 계통을 가진 주사 후 감소했다.
