살모넬라 배양균을 박테리아 파지로 감염시키려면 살모넬라 엔테리카의 야간 배양액을 최종 부피 5밀리리터의 LB로 희석하고 이전에 준비된 박테리아 파지 용해물 0.1밀리리터를 첨가합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 200RPM으로 24시간 동안 배양합니다. 50밀리리터 원뿔형 원심분리기 튜브에서 파지가 포함된 박테리아 배양액을 0.22미크론 여과된 LB 5밀리리터에 100배 희석합니다. 2, 377g에서 10분 동안 현탁액을 원심분리합니다.
상층액을 조심스럽게 디캔팅하고 세포가 있는지 확인하기 위해 바닥에 약간의 부피를 남겨 둡니다. 0.22미크론 여과된 LB 배지 10mL로 박테리아 세포를 세척합니다. 원심분리와 세척을 세 번 반복한 후 여과된 LB 5밀리리터에 펠릿을 재현탁시킵니다. 진공 여과 시스템을 사용하여 멸균 0.45미크론 필터를 통해 얻은 박테리아 현탁액 50마이크로리터를 여과합니다.
박테리아 세포에서 파지 방출을 촉진하기 위해 여과 된 LB.To 100 밀리리터로 필터를 헹구고 시스템을 분해하지 않고 세포가 들어있는 필터를 배양합니다. 앞에서 설명한 대로 진공 여과 시스템을 사용하여 필터를 다시 헹굽니다. 멸균 겸자를 사용하여 필터에서 박테리아 세포를 회수하려면 필터를 플라스크로 옮깁니다.
그런 다음 필터와 피펫에 2x LB 2ml를 여러 번 추가하여 필터에서 세포를 분리합니다. 이 현탁액 1밀리리터를 10, 354g에서 2분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버린 후 여과된 LB 배지 1밀리리터로 세포를 세 번 세척합니다.
그런 다음 2x LB의 1밀리리터로 세포를 재현탁시킵니다. 다음으로, 상업용 살모넬라 엔테리카 지질다당류(LPS)를 여과된 LB 1밀리리터에 20마이크로리터의 박테리아 현탁액과 혼합합니다. 박테리아 파지 재감염을 방지하기 위해 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양하고 200RPM에서 흔들어 혼합물을 배양합니다. 그 후, 배양액 1 밀리리터를 마이크로 원심 분리기 튜브에 옮기고 10, 354g에서 2 분 동안 현탁액을 원심 분리합니다. 여과된 LB 매체 1밀리리터로 펠릿을 세 번 세척합니다.
세척 후 펠릿을 2x LB 1밀리리터에 재현탁시킵니다. 이 혼합물 20마이크로리터를 상업용 LPS당 밀리리터당 0.8밀리그램을 함유한 여과된 LB 1밀리리터에 첨가합니다. 그리고 혼합물을 섭씨 37도, 200RPM에서 2시간 동안 배양합니다. 다음으로, 10, 354g에서 2분 동안 원심분리에 의해 마이크로 원심분리 튜브에서 배양액 1밀리리터를 펠릿화합니다.
여과된 LB로 세포를 세 번 세척한 후 여과된 LB 1밀리리터에 다시 현탁시킵니다. 진공 여과 시스템을 사용하여 1밀리리터의 박테리아 현탁액을 제균 0.45미크론 필터에 통과시키고 100밀리리터의 여과된 LB를 사용하여 필터를 헹굽니다. 멸균 겸자를 사용하여 필터를 플라스크로 옮깁니다. 필터와 피펫에 2x LB 2ml를 여러 번 추가하여 필터에서 세포를 분리합니다. 여과된 LB로 3번 세척하기 전에 10, 354g에서 2분 동안 세포의 1밀리리터를 원심분리합니다. 수집된 세포를 1밀리리터의 2x에 재현탁시키 LB.To 파지가 없는 접종물을 준비하고, 박테리아 현탁액에서 100마이크로리터의 세포를 밀리리터당 0.45밀리그램/LPS를 포함하는 900마이크로리터의 LB에 추가합니다.
섭씨 37도에서 24시간 동안 200RPM으로 흔들어 배양합니다. 이를 파지 재감염이 없는지 확인하기 위한 부분 표본으로 사용하십시오. 프로토콜의 여러 단계에서 적정을 수행함으로써 반복적인 세척 및 여과가 배양에서 박테리아 파지를 제거하기에 충분하지 않다는 것이 관찰되었습니다.
그러나, 파지의 수는 상업용 LPS를 사용한 배양 단계가 사용되자마자 감소하였다. 박테리아 배양에서 박테리아 파지를 완전히 제거하기 위한 중요한 단계는 상업용 LPS를 사용한 두 번째 배양이었습니다.
