In vitro 혈관신생 조사를 위한 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)의 회전 타원체 발아 분석

먼저 8ml의 내피 성장 배지가 들어 있는 10ml의 Falcon 튜브에 HUVEC을 추가합니다. METHOCEL 원액 2ml를 튜브에 넣고 잘 흔듭니다. 다음으로, 혼합물 25마이크로리터를 큰 정사각형 페트리 접시의 거꾸로 된 내부 표면에 옮깁니다.

뚜껑을 180도 부드럽게 회전시켜 세포 배양 용기 바닥에 놓고 밤새 배양합니다. 다음 날, 10X Medium 199 0.28ml가 들어있는 바이알에 2.3ml의 쥐 꼬리 콜라겐 Type I을 추가합니다. 이 혼합물을 얼음 위에 놓고 고르게 노랗게 될 때까지 섞는다.

수산화나트륨에 대해 혼합물을 주황색으로 변할 때까지 적정합니다. 그런 다음 최종 제품에 50마이크로리터의 HEPES 완충액을 추가합니다. 매달려 있는 배양 세포를 20ml의 PBS가 있는 50ml의 Falcon 튜브에 수집한 다음 원심분리기합니다.

상층액을 버린 후 0.1 밀리리터의 FBS와 0.4 밀리리터의 내피 기저 배지를 스페로이드 펠릿에 첨가합니다. 튜브를 부드럽게 두드려 펠릿을 재현탁합니다. 이제 METHOCEL 원액 2ml를 피펫팅하고 잘 섞습니다.

그런 다음 준비된 콜라겐 혼합물 2ml를 재현탁 스페로이드에 첨가합니다. 생성 된 혼합물 0.5 밀리리터를 24 웰 플레이트의 웰에 분배하고 배양합니다. 다음으로, 희석된 재조합 인간 혈관 내피 성장 인자 100마이크로리터를 플레이트의 웰에 피펫팅합니다.

섭씨 37도에서 5% 이산화탄소 보충 하에 12시간 동안 세포 배양을 배양합니다. 다음 날, 도립 현미경으로 웰 테두리와 접촉하지 않거나 서로 접촉하지 않거나 손상 징후가 보이는 스페로이드의 이미지를 캡처합니다. 기저 배지 또는 재조합 인간 혈관 내피 성장 인자만으로 자극된 스페로이드는 명확하게 구별할 수 있었습니다.

저품질 겔의 스페로이드는 땅에 떨어져 흩어지는 것처럼 보였다. 음성 대조군은 중간 정도의 기준선 발아 속도를 보인 반면, 인간 혈관 내피 성장 인자는 상대적 발아 길이의 두 배 또는 세 배였습니다. 새싹의 수는 비슷한 역학 범위를 보여주었습니다.