Selenoprotein O의 분자 상호 작용을 밝히기 위한 열 이동 분석

시작하려면 열 이동 분석 또는 TSA 완충액을 사용하여 Selenoprotein 용액을 준비합니다. 단백질, 소분자 및 SYPRO 오렌지 염료를 384웰 플레이트의 적절한 웰에 디스펜싱합니다. 광학적으로 명확한 접착성 필름을 가진 격판덮개를 덮고 1개에 판, 분리기에서 1 분 동안 000 g를 짧게 회전시킨다.

그런 다음 플레이트를 Real-Time PCR 기계에 넣고 샘플을 섭씨 20도에서 2분 동안 유지한 다음 분당 온도를 0.5도 증가시켜 섭씨 95도까지 높이도록 프로그래밍합니다. 온도에 대한 상대 형광 단위 또는 RFU에 대한 RT PCR 기계에서 데이터를 내보냅니다. 선택한 소프트웨어를 사용하여 각 용융 곡선에 대해 측정된 최고 강도까지 데이터 포인트를 추출하고 플롯합니다.

용융 온도 또는 Tm.The 열 변성 곡선을 결정하기 위해 데이터에 적합한 Boltzmann 시그모이드로 용융 온도를 결정하고, 마그네슘 이온을 가진 ATP의 존재 하에서 대장균 SelO의 열 안정성에서 섭씨 4도 상승을 나타내고, 망간 이온을 가진 ATP에 대해 동일한 온도에서 섭씨 12도 상승을 나타냈다. 그러나 UTP로 배양할 때 열적 안정성에는 변화가 없었으며, 이는 Escherichia coli SelO가 UTP에 대해 검출 가능한 결합을 나타내지 않을 수 있음을 나타냅니다. 단백질이 없는 대조군과 염료가 없는 대조군은 형광 신호가 낮아 온도 상승에 반응하지 않았습니다.