Isolation of murine embryos during gastrulation for single-cell RNA sequencing(단일 세포 RNA 염기서열분석을 위한 위축시간 중 쥐 배아 분리)

쥐 배아 분리를 시작하기 전에 70% 에탄올로 해당 부위를 철저히 청소하십시오. 모든 해부 도구가 세척 및 멸균되었는지 확인하십시오. 10% FBS가 포함된 멸균 DMEM 5밀리리터와 DPBS 20밀리리터를 구하여 얼음 위에 놓습니다.

다음으로 배아 분리를 수행하기 위해 투과광 스테이지와 카메라가 있는 실체 현미경을 사용하여 적절하게 안락사된 임신 댐을 등에 놓고 질 입구 부근을 에탄올로 소독합니다. 해부 가위와 핀셋을 사용하여 질 입구 근처의 피부 주름을 들어 올리고 임신 한 댐의 자궁을 천천히 드러내는 작은 V 자형으로 절개합니다. 그런 다음 댐의 자궁 뿔의 한쪽 끝을 핀셋으로 잡고 따라 잘라냅니다.

자궁 경부를 제거해야합니다. 얼음 위에 DPBS가 들어 있는 10cm 페트리 접시에 자궁 뿔을 넣습니다. 해부 가위와 핀셋을 사용하여 착상 부위를 따라 자궁 근육을 제거하고 각 착상 부위 또는 내부에 침엽 부종이 들어있는 진주를 자릅니다.

얼음 위에 6cm 페트리 접시에 담긴 신선한 DPBS에 넣습니다. 하나의 이식 부위를 가져 가라. 실체 현미경 스테이지 위에 있는 새로운 6cm 페트리 접시에 놓고 500마이크로리터의 DPBS를 추가합니다.

현미경과 광원의 초점을 조정합니다. 한 손에 핀셋 한 세트로 착상 부위를 누르고 다른 한 쌍으로 자궁 뿔에서 잘라낸 착상 부위 끝에 다른 한 쌍의 집게를 천천히 삽입하여 서서히 낙엽 부종을 드러냅니다. 배아를 드러내려면 한 쌍의 겸자로 고립된 낙막 종기의 반오판 끝부분을 잡고 다른 쌍으로 오심 끝에서 낙엽 팽윤 크기의 약 1/4 크기를 수평으로 천천히 자릅니다.

이제 두 겸자를 사용하여 갓 자른 오심 끝에서 배아가 튀어나올 때까지 부풀어 오른 부분의 반(反)오심 끝에서 천천히 밀어냅니다. 배아가 드러나면 부착된 추가 배아 조직을 제거합니다. 두정엽 내배엽 주머니와 외측 태반 원뿔이 배아에서 자발적으로 떨어지지 않으면 한 쌍의 겸자를 사용하여 관련 모체와 함께 제거합니다.

그런 다음 한 쌍의 겸자로 배아를 누르면서 다른 한 쌍의 겸자를 사용하여 배아에서 내장 난황 주머니를 천천히 벗겨냅니다. 두정엽 내배엽 주머니와 외태반 원뿔을 찾습니다. AP 20 피펫을 사용하여 접시에서 DPBS가 10마이크로리터 이하인 난황낭을 얼음 위의 8스트립 PCR 튜브에 옮깁니다.

갓 분리된 배아의 밝은 필드 사진을 찍어 새끼 짝의 병기가 비슷한지 확인합니다. P200 피펫을 사용하여 10% FBS를 함유한 50마이크로리터의 DMEM이 있는 배아를 얼음 위에 보관된 1.5밀리리터 튜브에 천천히 옮깁니다. 각 격리에 대해 깨끗한 도구와 새 플라스틱을 사용하여 모든 좌부 팽창에 대해 동일한 작업을 반복합니다.