먼저 트립신화된 Sf1Ep 세포 배양과 6웰 플레이트를 작업 플랫폼에 놓습니다. 적절한 수의 Sf1Ep 세포와 Sf1Ep 배지를 6웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 섭씨 37도에서 밤새 이산화탄소 5%로 접시를 배양합니다.
TpCM-2의 성분을 멸균 용기에 넣고 디티오트레이톨을 건조 분말로 마지막으로 첨가합니다. 부드럽게 혼합하고 여과하여 0.22마이크로미터 필터 장치를 사용하여 매체를 살균합니다. 혐기성 항아리에 매체를 사전 평형화하고 집 진공을 사용하여 챔버를 비우고 95% 질소와 5% 이산화탄소 혼합물을 세 번 다시 채웁니다.
그런 다음 1.5% 산소, 5% 이산화탄소로 다시 채우고 질소 가스 혼합물의 균형을 맞춥니다. 배지를 섭씨 34도에서 설정된 삼중 가스 인큐베이터로 빠르게 옮기고 밤새 배양합니다. 하룻밤 배양 후 Sf1Ep 배양물에서 배지를 제거하고 소량의 사전 평형 TpCM-2로 세포를 헹굽니다.
린스를 제거한 후 적당량의 TpCM-2를 추가하고 플레이트를 1.5%의 산소, 5%의 이산화탄소로 평형화하고 섭씨 34도에서 3-4시간 동안 질소 분위기의 균형을 맞춥니다. 저산소 인큐베이터에서 기존 T.pallidum 배양액을 제거하고 각 웰의 Sf1Ep 세포층을 검사합니다. 세포 밀도와 모양을 기록한 후 각 웰의 배지를 피펫팅하여 멸균된 15밀리리터 원뿔형 튜브에 넣습니다.
미리 데워진 트립신-EDTA 0.35ml로 각각을 잘 헹구고 15ml의 튜브에 헹굼을 추가합니다. 각 웰에 0.35ml의 트립신-EDTA를 더 추가하고 섭씨 37도에서 5분 동안 배양하여 플레이트에서 Sf1Ep 세포를 제거하고 Sf1Ep 세포에서 T.pallidum을 제거합니다. 분리 후 해리된 T.pallidum 및 Sf1Ep 세포를 15밀리리터 원뿔형 튜브에 수집된 예비 배지와 결합하고 배양당 수율 계산을 위해 검색된 총 부피를 기록합니다.
이전에 준비된 Sf1Ep 세포 플레이트에 수확된 T.pallidum의 정해진 부피를 접종합니다. 플레이트에서 분위기를 교환한 후 섭씨 34도에서 브루어 용기 또는 삼중 가스 인큐베이터에서 배양합니다. 접종 후에는 보조 계수 챔버를 사용하여 암시야 현미경 검사에서 T.pallidum을 계수합니다.
T.pallidum 배양액에 최종 농도 10%까지 50%glycerol을 첨가하고 부드러운 피펫팅 또는 반전을 통해 글리세롤을 분산시킵니다. 1-2 밀리리터의 분취액으로 제제를 스크류 캡이 있는 냉동고 바이알에 분배하고 즉시 바이알을 섭씨 80도의 냉동고 또는 액체 질소 냉동고에 넣습니다. 웰당 1000개의 Sf1Ep 세포와 200마이크로리터의 TpCM-2로 2개의 96웰 플레이트를 준비하고 사전 평형화하고 조직 배양 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양합니다.
다음 날, 앞에서 설명한 대로 Sf1Ep 배지를 TpCM-2로 교체합니다. 정량 분석 후 T.pallidum을 TpCM-2에 희석하여 밀리리터당 10 및 40 세포 농도의 두 가지 제제를 생산합니다. 50 T.pallidum / 밀리리터 제제의 웰 당 10 마이크로 리터를 준비된 96 엘 플레이트 중 하나에 접종합니다.
각 플레이트에 있는 두 개의 대조 웰에서 2 x 10을 밀리리터 희석액당 3개의 T.pallidum의 힘으로 접종합니다. 저산소 가스 혼합물로 플레이트를 평형화하고 섭씨 34도의 브루어 용기 또는 트라이 가스 인큐베이터에서 배양합니다. 일곱째 날에 배지의 절반을 제거하고 새로운 평형 TpCM-2로 교체합니다.
암시야 현미경으로 positive well이 식별되면 positive well을 trypsingize하고 세포 현탁액을 이전에 준비된 24-well plate로 옮겨 추가 팽창을 합니다. T.pallidum은 전형적으로 90% 이상의 운동성을 유지하고 정지 단계에 들어가기 전에 대략 7일 동안 33-45시간의 배가적인 시간으로 대수적으로 증식합니다. 일주일 동안, 스피로헤테스는 대략 4-5번의 더블링을 겪었다.
