먼저 냉동 된 Naegleria gruberi trophozoites를 섭씨 37도에서 3 분 동안 두십시오. 약 80%confluent까지 섭씨 25도에서 PYNFH 매체의 trophozoites를 배양합니다. 합류 플라스크를 얼음 위에 5-10분 동안 올려 플라스틱에서 부착된 영양류석을 제거합니다.
그런 다음 플라스크를 부드럽게 휘저어 남아 있는 부착 세포를 제거합니다. 배지를 멸균 encystment 배지로 교체하여 Naegleria gruberi 세포를 encyst합니다. 48시간 후 플라스크에서 낭종을 제거합니다.
섭씨 4도에서 10분 동안 600 x g에서 낭종을 원심분리합니다. 원심분리 후 10% 태아 종아리 혈청으로 2ml의 PYNFH 배지에 낭종을 재현탁시켜 세포를 배설합니다. 영양 영양체가 나타나 80 % 밀도에 도달 할 때까지 섭씨 25도에서 72 시간 동안 낭종을 배양합니다.
trophozoites를 transfection하려면 먼저 trophozoites 1 mliter를 6웰의 평평한 바닥 조직 배양 플레이트에 플레이트합니다. 다음으로, plasmid transfection 시약 혼합물을 실온에서 10분 동안 배양합니다. transfection 직전에 trophozoites 단층에서 약 800 마이크로리터의 배지를 피펫팅합니다.
그런 다음 200 마이크로리터의 플라스미드 transfection 시약 혼합물을 영양류생물에 첨가합니다. 미디어가 플레이트 가장자리에 뭉쳐 건조되는 것을 방지하기 위해 15분마다 플레이트를 부드럽게 휘젓습니다. 한 시간 후, 10X DNase 완충액 1밀리리터에 DNase 10 단위를 넣고 웰에 넣습니다.
플레이트를 섭씨 37도에서 15분 동안 배양하여 잔류 플라스미드 DNA를 제거합니다. 이제 1 밀리리터의 성장 배지로 플레이트를 한 번 씻은 다음 2 밀리리터의 신선한 배지를 추가하십시오. 접시를 섭씨 25도에서 24-36시간 동안 배양합니다.
배양이 완료되면 웰의 내용물을 1:2 비율로 새 플레이트에 나눕니다. 그런 다음 추가 분석을 위해 나머지 우물에서 영양류를 수집합니다. Naegleria gruberi trophozoites는 아메바이드였으며 표준 배양 조건에서 배양 플라스크를 고수했습니다.
얼음 위에서 부화한 결과 둥글고 부착되지 않는 영양류가 생성되었습니다. 엔시스트먼트 미디어에서 trophozoites를 배양하는 것은 그들을 엔시스테드(encysted)로 만들었다.
