시작하려면, 100 밀리몰 염화나트륨 200 마이크로리터를 naegleria gruberi의 형질주입된 영양영양체가 들어있는 튜브에 첨가합니다. 튜브를 600G에서 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거한 후 세포 펠릿을 100밀리몰 EDTA 100마이크로리터에 재현탁시킵니다.
튜브를 섭씨 98도에서 15분 동안 열 블록에 넣어 세포를 용해합니다. 튜브를 섭씨 4도에서 최고 속도로 10분 동안 원심분리하여 파편을 펠릿화합니다. 상층액을 새 튜브로 옮깁니다.
다음으로, 0.5 부피의 아세트산 암모늄, 3 부피의 절대 에탄올 및 1 마이크로 리터의 글리코겐을 상층액에 첨가합니다. 튜브를 여러 번 뒤집어 섞은 후 섭씨 영하 80도에서 30분 동안 또는 밤새 배양합니다. 인큐폼 후에, 16에 10 분 동안 실내 온도에 관을 분리하십시오, 000G.
펠릿을 방해하지 않고 상층액을 제거하고 원심분리하기 전에 200마이크로리터의 70% 에탄올을 추가하여 세척합니다. 메마른 이온을 제거한 물에 있는 10의 trophozoite 조밀도를 달성하기 위하여 펠릿을 현탁시키십시오, 마이크로리터 당 000의 trophozoites. transfection된 DNA에 특이적인 프라이머를 사용한 PCR 및 형질전환된 영양류석을 검출한 후 CERE 샘플에 2마이크로리터의 6X 로딩 염료를 추가합니다.
그런 다음 염색된 샘플을 0.8% 아가로스 겔에 로드합니다. 겔을 1.5-2시간 동안 전기형광을 발한 후, 100밀리리터의 탈이온수에 희석된 DNA 염료에 배양한다. 염색된 겔을 탈이온수에 20분 동안 넣어 탈색합니다.
결과를 문서화하기 위해 자외선 시스템에서 겔을 시각화합니다. PCR 분석 결과, pGRUB는 최소 7개의 통로를 통해 transfection된 trophozoites에서 검출되었습니다. pGEM은 첫 번째 통과 후 손실되었으며, 이는 빈 플라스미드가 아메바에 의해 유지되지 않았음을 나타냅니다.
