먼저 세포 배양 후드에서 채취한 리포아스피레이트를 50밀리리터 원심분리 튜브에 넣습니다. lipoaspirate를 멸균 20 밀리리터 Luer lock 주사기로 옮깁니다. 그런 다음 1.4mm 커넥터를 주사기에 연결합니다.
이제 두 번째 20밀리리터 루어 잠금 주사기를 커넥터의 반대쪽에 부착합니다. 한 주사기에서 다른 주사기로 지방 조직을 약 30회 밀어 넣습니다. 그런 다음 유화 된 지방을 새 50 밀리리터 원심 분리기 튜브로 옮깁니다.
500G에서 10분 동안 지방을 원심분리합니다. 그런 다음 기름진 최상층을 버리십시오. 분리된 기질 혈관층을 포함하는 중앙 정제층을 수집하여 새로운 50mL 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
이제 원심분리기 튜브에 최대 40밀리리터 표시까지 보충된 DMEM을 채웁니다. 튜브를 500G에서 5분 동안 다시 원심분리합니다. 생성된 mSVF 층을 수집하여 새로운 50밀리리터 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
멸균된 1.5밀리리터 튜브에 분리된 기질 혈관 분획 100마이크로리터를 피펫팅합니다. 여기에 10 마이크로 리터의 트롬빈을 추가 한 다음 10 마이크로 리터의 염화칼슘을 피펫팅합니다. 마지막으로 혼합물에 70마이크로리터의 트라넥삼산을 추가합니다.
새 피펫 팁을 사용하여 적용 직전에 10마이크로리터의 피브리노겐을 튜브에 추가합니다. mSVF 하이드로겔 혼합물의 중합 후 분석 목적으로 200마이크로리터의 하이드로겔을 12웰 플레이트에 피펫팅합니다. 이제 100 마이크로리터의 피브린 하이드로겔을 음성 대조군과 하나의 웰에 추가합니다.
12-well plate를 섭씨 37도에서 이산화탄소 5% 미만으로 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 각 웰에 미리 예열된 배양 배지 1m리터를 추가합니다. 12웰 플레이트를 다시 인큐베이터에 넣고 4시간 동안 기다립니다.
24시간 동안 다시 배양하기 전에 각 웰에 1mL의 레자주린을 추가합니다. resazurin 샘플을 96웰 플레이트에 피펫팅합니다. 다음 날, 세포 이미징 다중 모드 마이크로플레이트 리더를 사용하여 첫 번째 형광 강도를 측정합니다.
1일, 3일, 7일에 대한 조직학적 분석을 위해 피브린 하이드로겔을 4% 파라포름알데히드 0.5mL에 배양합니다. 이제 접시에 1 % PBS를 추가하고 섭씨 4도에서 보관하십시오. resazurin assay는 vascular fraction 및 hydrogel의 시험관 내 세포 생존력을 정량화하기 위해 수행되었습니다.
혈관 분획은 3일째에 생존력이 감소한 반면, mSVF-피브린 하이드로겔 조합은 기준선에 가깝게 유지되었습니다. 7일째까지 mSVF의 생존력은 감소한 반면 mSVF-피브린 하이드로겔 조합은 증가했습니다. 조직학적 분석 결과 3일째와 7일째에 세포핵 수가 감소하지 않았습니다.
피브린 하이드로겔은 고르게 분포된 가시적 세포 클러스터로 최소한의 분해를 나타냈습니다.
