대장균 BL21 DE3 세포의 형질전환을 시작하려면 유능한 세포 현탁액 50마이크로리터를 얼음에서 해동합니다. pET 28a Sumo TRF2 플라스미드의 DNA 1 마이크로리터를 competent cell suspension에 첨가하고, 튜브를 부드럽게 휘저어 현탁액을 섞는다. 형질전환 후, 100 마이크로리터의 세포 현탁액을 밀리리터당 50마이크로그램의 카나마이신을 함유하는 루리아 베르타니(luria bertani) 또는 LB, 한천 플레이트에 펴 바릅니다.
섭씨 37도에서 밤새 세포를 배양합니다. 다음 날, 형질전환된 세포의 콜로니를 선택하고 밀리리터당 50마이크로그램의 카나마이신이 보충된 5밀리리터의 LB 배지에서 배양합니다. 섭씨 37도에서 220RPM으로 흔드는 상태에서 18시간 동안 배양합니다.
배양 후 최종 농도로 1밀리몰 IPTG로 배양을 유도합니다. 단백질 발현을 촉진하기 위해 섭씨 20도에서 17시간 동안 배양합니다. 조단백질 추출물을 로딩 버퍼와 함께 SDS-PAGE 겔에 로드합니다.
샘플을 처음에 30분 동안 100볼트로 실행한 다음 트리스-글리신 버퍼에서 50분 동안 120볼트를 실행합니다. 그런 다음 단백질 발현을 시각화하기 위해 Coomassie blue로 염색합니다. 단백질 정화를 위해, 38에 조단백질 추출물을 분리하십시오, 4 섭씨 온도에 40 분 동안 000 G는, 0.22 마이크로미터 주사통 여과기를 통해서 상층액을 거른다.
여과된 상층액을 결합 완충액의 사전 평형화된 니켈 컬럼에 로드합니다. 결합 완충액으로 컬럼을 세척하고 준비된 이미다졸 그래디언트로 단백질을 용리하여 각각 1mL의 분획 12개를 수집합니다. 저장을 위해 농축 및 완충액 교환 단백질에 50%의 최종 농도로 글리세롤을 첨가합니다.
대장균에서 TRF2의 발현은 SDS-PAGE에 의해 보여진 바와 같이 성공적으로 입증되었으며, TRF2에 해당하는 뚜렷한 띠가 유도 전후에 나타났습니다.
