먼저, 텔로머 제한 단편 DNA를 함유한 7개의 HeLa 세포주를 1, 000g에서 3분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버리고 펠릿을 200마이크로리터의 PBS에 재현탁시킵니다. SDS proteinase K와 염화나트륨 처리 후에, 16, 10 분 동안 900g에 세포 현탁액을 분리한다.
상층액을 새 원심분리기 튜브로 옮기고 부유 지질이나 침전물을 피하면서 동일한 부피의 이소프로판올을 추가합니다. 고속으로 원심 분리하고 펠릿을 500 % 에탄올 70 마이크로 리터로 세척합니다. DNA 펠릿을 건조시킨 후 475마이크로리터의 TE 완충액에 조심스럽게 재현탁시키고 튜브 바닥을 두드려 부드럽게 혼합합니다.
이제 RNAsay당 10밀리그램의 25마이크로리터를 추가하고 펠릿이 완전히 용해될 때까지 튜브를 두드립니다. 다음으로, 1/10 부피의 3 몰 아세트산 나트륨과 2 부피의 차가운 100 % 에탄올을 넣고 튜브를 섭씨 영하 80도에서 2-3 시간 동안 놓습니다. 원심분리 및 70% 에탄올 세척 후 DNA 펠릿에 100마이크로리터의 TE 버퍼를 추가하고 튜브를 두드려 섞은 다음 섭씨 4도에서 2시간 동안 두어 완전히 용해시킵니다.
DNA 분해를 위해 4마이크로그램의 게놈 DNA와 1마이크로리터의 CviAII, 2마이크로리터의 10X 분해 완충액 및 물을 결합하여 총 부피가 20마이크로리터에 도달합니다. 혼합물을 섭씨 25도에서 12시간 동안 배양합니다. 열 순환기에서 혼합물을 섭씨 75도에서 3분 동안 가열합니다.
그런 다음 섭씨 0.1도에 도달할 때까지 30초마다 섭씨 25도씩 온도를 낮춥니다. 세척 및 건조 후 하단 커버 슬립에 0.1%니트로셀룰로오스 20마이크로리터를 코팅하고 참조 비드를 추가합니다. 커버 슬립을 섭씨 100도에서 4 분 동안 굽습니다.
플로우 셀 샌드위치를 조립합니다. 그리고 섭씨 85도에서 가열한 후 두 개의 면봉을 사용하여 파라필름이 채널을 밀봉할 때까지 어셈블리를 마사지합니다. 자석을 사용하여 50마이크로리터의 작업 버퍼로 10마이크로리터의 M-270 비드를 5회 세척합니다.
세척 후 소화된 게놈 DNA 위에 있는 비드를 1.5밀리리터 원심분리기 튜브에 추가합니다. 튜브를 몇 번 부드럽게 튕겨 비드와 DNA 샘플을 혼합합니다. 혼합물을 얼음 위에 한 시간 동안 그대로 두십시오.
배양 후 자석을 사용하여 500 마이크로 리터의 작업 버퍼로 혼합물을 3 번 세척하여 세척 사이에 10 분 간격으로 비드를 아래로 당깁니다. 샘플을 작업 버퍼에 다시 현탁시키고 30마이크로리터의 혼합물을 플로우 셀에 로드합니다. 30분 후에 바인딩되지 않은 마그네틱 비드를 세척합니다.
플로우 셀을 대물렌즈 위에 놓은 후 수직 구성으로 배열된 한 쌍의 5mm 입방체 자석을 선택하고 자석 홀더를 이미징을 위한 자기 핀셋의 광 경로 x축에 맞춥니다. 그래픽 프로그래밍 소프트웨어를 실행하고 자기 핀셋용 컨트롤러를 연결합니다. flow cell의 하단에서 reference bead를 찾도록 시야를 조정하고, reference bead가 명확한 굴절 고리를 보이도록 대물 렌즈를 약간 조정합니다.
MATLAB에서 force ramp 분석을 위한 모터 움직임을 제어하는 스크립트를 작성할 수 있습니다. 스크립트를 그래픽 프로그래밍 소프트웨어로 가져와 단일 분자 실험을 테스트합니다. 느린 유속으로 200마이크로리터의 10나노몰 TRF1을 플로우 셀에 로드합니다.
바인딩 30분 후, 힘 로딩 속도가 초당 1피코네톤을 더하거나 뺀 값으로 힘 램프 실험을 위한 스크립트를 선택합니다. 데이터 파일의 이름을 지정하고 실험을 실행합니다. 게놈 DNA 무결성은 아가로스 겔 전기영동을 사용하여 확인되었으며, 그 결과 TRS는 다양한 인간 세포주에서 일관된 길이를 표시했습니다.
TRS의 텔로메릭 반복 서열은 서던 블로팅(southern blotting)을 통해 감지되었으며, 이는 명확한 혼성화 신호를 보여줍니다. force ramp 분석의 힘 확장 곡선은 스트레칭 중 지그재그 패턴을 보였으며, 이는 단백질 DNA 상호 작용의 끊어짐을 나타냅니다. 텔로머 DNA 단백질 복합체의 해리 역학은 힘과 해리 속도 사이의 선형 관계를 보여주었습니다.
또한, 인간 세포의 텔로머 DNA의 길이 이질성은 다양한 길이의 텔로미어에서 루프 형성 메커니즘을 조사합니다.
