시작하려면 마스터 버퍼를 준비합니다. 0.22마이크로미터의 기공 크기 필터를 사용하여 여과하고 완충액을 섭씨 4도에서 보관합니다. 다음으로, 마스터 완충액에 EDTA-free 프로테아제 억제제 정제 3정, 2mMOL ATP 및 0.1mMOL DTT를 보충하여 75mL의 추출 완충액을 준비합니다.
그런 다음 미오신 VIIA 발현 동결 박테리아 세포 펠릿에 75ml의 추출 완충액을 첨가하고 펠릿을 추출 완충액에 넣어 해동될 때까지 얼음 위에 둡니다. 그 후, 혈청학적 피펫을 사용하여 펠릿을 분해하여 해동 과정을 가속화합니다. 이제 50 초 켜고 5 초 끄기 위해 반 인치 팁을 사용하여 50 % 진폭으로 10 분 동안 얼음에 재 현탁액을 초음파 처리합니다.
33, 746 G에서 총 용해물을 섭씨 4도에서 30 분 동안 원심 분리합니다. 원심 분리하는 동안 anti-FLAG 친화성 수지 3 % 슬러리 50 밀리리터를 PBS 40 밀리리터로 세척하여 1.5 밀리리터의 FLAG 수지를 제조합니다. 그 후, 수지를 800G에서 섭씨 4도에서 2분 동안 원심분리합니다.
레진을 방해하지 않고 PBS를 조심스럽게 제거하십시오. 그런 다음 용해물 원심분리에서 얻은 상층액을 세척된 수지에 첨가하고 섭씨 4도에서 1시간 동안 연속 회전하여 배양합니다. 800G에서 섭씨 4도에서 2분 동안 원심분리하여 수지를 펠릿화합니다.
그리고 수지를 방해하지 않고 상층액을 제거하십시오. 다음으로, 40ml의 마스터 버퍼에 수지를 다시 현탁시키고 섭씨 4도에서 2분 동안 800G의 원심분리기를 사용합니다. 수지를 방해하지 않고 상층액을 조심스럽게 제거하십시오.
이제 세척된 수지를 두 개의 폴리프로필렌 스핀 컬럼으로 옮깁니다. 각 컬럼을 2mL의 마스터 버퍼로 한 번씩 세척합니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 2분 동안 1, 400G에서 컬럼을 원심분리하여 마스터 버퍼를 제거합니다.
용리 완충액을 준비하려면 FLAG 펩타이드 밀리리터당 100마이크로그램을 마스터 완충액에 첨가합니다. 300 마이크로리터의 용출 완충액을 각 컬럼의 패킹된 수지에 추가합니다. 레진이 용출 버퍼에 의해 완전히 수화되도록 피펫팅으로 부드럽게 혼합합니다.
그런 다음 섭씨 4도에서 2분 동안 1, 400G에서 컬럼을 원심분리합니다. 흐름을 깨끗한 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기고 얼음 위에 보관합니다. 이제 용리 분획과 함께 SDS-PAGE를 수행하여 상대 농도를 측정합니다.
겔이 작동하는 동안 주어진 구성으로 투석 완충액을 준비합니다. 그런 다음 가장 농축된 분획을 결합합니다. 표본을 10, 000 분자량 커트오프 투석 카세트에 옮기고 4 섭씨 온도에 밤새 투석한다.
다음 날, 투석 카세트에서 검체를 조심스럽게 꺼냅니다. PCR 튜브당 15마이크로리터를 분취하고 급속 동결을 위해 튜브를 액체 질소 용기에 떨어뜨립니다. 정제된 미오신 VIIA 복합체는 SDS-PAGE에 의해 확인되었으며, 이는 미오신 VIIA 중쇄에 해당하는 200킬로 달톤 마커 위의 밴드와 RLC 칼모듈린 및 칼모듈린 유사 단백질 4을 나타내는 22 킬로 및 14킬로 달톤 마커 사이의 3개의 뚜렷한 밴드를 보여줍니다.
