먼저, 500밀리몰의 염화나트륨 운동성 완충액에 들어 있는 정제된 인간 미오신 -7a 단백질의 챔버 부피 1개를 플로우 챔버에 추가하고 실온에서 5분 동안 배양합니다. 150 밀리몰 염화나트륨 운동성 완충액에서 1밀리리터당 1밀리그램 BSA의 3개 챔버 부피로 플로우 챔버를 세척합니다. 그런 다음 배출구를 깨끗한 물티슈로 닦아 액체를 끌어내어 과도한 액체를 흡수합니다.
그런 다음 150 밀리몰 염화나트륨 운동성 완충액에 10 나노몰 로다민-팔로이딘 표지된 F-액틴의 한 챔버 부피를 유동 챔버를 통해 흐릅니다. 100x 대물렌즈를 사용하여 형광 현미경으로 액틴 필라멘트가 표면에 결합하는 것을 모니터링합니다. 시야에 충분한 필라멘트가 있지만 겹침을 방지할 수 있을 만큼 충분히 희박하여 추적을 위한 최적의 액틴 필라멘트 밀도를 보장합니다.
다음으로, 150밀리몰 염화나트륨 운동성 완충액으로 구성된 3개의 챔버 부피로 플로우 챔버를 세척하여 결합되지 않은 액틴 필라멘트와 과도한 로다민-팔로이딘을 제거합니다. 운동성을 시작하려면 최종 완충액의 챔버 부피 하나를 유동 챔버에 추가합니다. 그런 다음 561나노미터 여기(excitation)를 사용하여 형광 현미경에 이미지를 기록하여 로다민-팔로이딘 표지 액틴을 시각화합니다.
슬라이드에서 원하는 액틴 밀도를 가진 영역을 찾아 30분 동안 30초마다 이미지를 캡처합니다. 그런 다음 GitHub 리포지토리에서 Fast 프로그램을 다운로드하여 설치합니다. ND2 파일 변환을 위한 추가 모듈이 있는 Python 3 호환 버전인지 확인합니다.
공차 값 33을 사용하여 고속 프로그램을 실행하여 부드럽게 움직이는 필라멘트만 유지합니다. 그런 다음 Fast 프로그램을 사용하여 새로 생성된 TIFF 이미지를 분석합니다. x 최대값을 20, 000나노미터로 설정하고 y 최대값을 초당 20나노미터로 설정하여 가장 긴 필라멘트 길이와 최대 필라멘트 속도를 나타냅니다.
그런 다음 px를 사용하여 획득한 이미지의 픽셀 크기를 65나노미터로 설정합니다. minV를 초당 0.1나노미터로 설정하여 분석에 필라멘트를 포함하는 데 필요한 최소 속도를 지정합니다. 필라멘트가 연결될 프레임 사이에 허용되는 최대 거리를 설정하려면 maxD를 사용하여 프레임 간에 별도의 필라멘트가 연결되지 않도록 합니다.
pt를 사용하여 움직임이 부드러운 필라멘트만 포함하는 필라멘트 속도의 변동에 대한 허용오차를 설정합니다. 마지막으로 d를 사용하여 분석을 위한 TIFF 스택이 포함된 폴더를 나타냅니다. 액틴 필라멘트 글라이딩 분석은 미오신 -7a의 느린 운동성을 보여주었으며, 움직임을 시각화하기 위해 비디오 재생 속도를 500배 높였습니다.
미오신-7a의 속도 분포는 초당 5나노미터 미만의 피크를 보였으며, 이는 느린 운동성을 확인시켜주었다.
