먼저, 생후 10일 된 새끼 쥐에서 채취한 잘게 잘린 소뇌 조직을 기저 매체 독수리에서 배양합니다. DNA 손상 화학 물질을 적절한 최종 농도의 배양 배지에 직접 첨가합니다. 노출 기간이 끝나면 배지를 DNA 손상 화학 물질과 poly ADP ribose glycohydrolase 억제제가 포함된 신선하게 준비된 혼합 배지로 교체하고 30분 동안 배양합니다.
30분 후 실온에서 0.1몰 인산염 완충액으로 슬라이스를 세척하고 즉시 사전 냉각된 아세톤과 메탄올 혼합물로 고정합니다. 섭씨 영하 20도에서 20분 동안 접시를 배양합니다. 그런 다음 고정 용액을 제거하고 0.4 몰 인산염 완충액으로 세척합니다.
100마이크로리터의 0.1몰 인산염 완충액을 48웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 그런 다음 메스와 도마를 사용하여 인서트의 여백을 제거하고 조직 조각 주위를 자릅니다. 슬라이스를 48웰 플레이트의 웰에 놓습니다.
완충액을 흡입한 후 1%Triton X100을 함유한 0.1몰 인산염 완충액 100마이크로리터로 인서트를 배양합니다. 용액을 흡인하고 적절한 양의 차단 용액을 넣은 후 2차 항체에서 1차 용액을 넣은 후 셰이커의 각 웰에 삽입물을 순차적으로 배양합니다. 2 차 항체로 2 시간의 배양이 끝나기 20 분 전에 최종 DAPI 용액 20 마이크로 리터를 각 웰에 추가하고 20 분 동안 계속 흔듭니다.
장착하려면 조직이 위를 향하게 하여 현미경 유리 슬라이드에 조직을 놓습니다. 장착 매체를 추가하고 커버 유리로 덮습니다. 슬라이드를 평평한 표면에 놓고 섭씨 4도의 어두운 곳에서 밤새 말리십시오.
소뇌 잎은 배양에서 유지되었습니다. Purkinje 세포는 Calbindin D-28K에 대해 염색하고 신경핵은 NeuN에 대해 염색했습니다. Purkinje 세포의 성상세포는 GFAP에 대해 염색되었습니다.
브롬산칼륨 및 파라콰트에 노출된 후 처리된 Purkinje 세포에서 PAR 염색이 증가하여 DNA 손상을 나타냅니다.
