미토콘드리아를 분리하려면 마취된 목이 잘린 쥐를 얼음 위에 엎드린 자세로 눕힙니다. 심장을 노출시킨 후 대동맥을 대동맥 뿌리 위와 경동맥 분지 지점 아래로 약 4-6mm 자릅니다. 관상 동맥에서 혈액이 제거되고 장기가 희게 보일 때까지 중력 의존 압력 헤드를 사용하여 대동맥을 캐뉼러하고 얼음처럼 차가운 심정지 용액으로 심장을 관류합니다.
심방, 연골 판막 조직 및 지방 조직을 절개하여 심실 심근을 격리합니다. 조각이 약 1입방밀리미터가 될 때까지 날카로운 수술용 가위로 조직을 다집니다. 다진 조직을 프로테아제 용액이 포함된 스핀 1과 2로 표시된 사전 냉각된 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
얼음 저온 격리 버퍼를 최종 부피 25ml에 추가합니다. 자동화된 소형 회전자 고정자 균질화기를 사용하여, 18에 조직, 20에서 25 초 동안 얼음에 000 분당 회전수를 이산하십시오. 8, 4개의 섭씨 온도에 10 분 동안 000 G에 균질화된 조직을 분리한다.
상층액을 버리십시오. 그리고 5mL의 분리 완충액으로 펠릿을 부드럽게 헹구어 잔류 프로테아제를 제거합니다. 헹굼을 버린 후 얼음 냉간 격리 완충액을 최종 부피 25ml에 추가합니다.
그런 다음 소용돌이를 일으켜 펠릿을 현탁시킵니다. 조직을 800G에서 섭씨 4도에서 10분 동안 균질화한 조직을 원심분리합니다. 미토콘드리아가 함유된 상층액을 라벨이 부착된 사전 냉각된 50밀리리터 튜브에 부드럽게 붓습니다.
지금 8, 4 섭씨 온도에 10 분 동안 000 G에 상층액을 분리한다. 상층액을 버리고 펠릿을 함유한 미토콘드리아를 유지합니다. 보푸라기가 없는 물티슈를 사용하여 펠릿을 방해하지 않고 튜브 내벽에서 과도한 상청액을 흡수하고 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
튜브 바닥에 80마이크로리터의 얼음 냉간 격리 완충액을 추가하고 마이크로 피펫을 사용하여 미토콘드리아를 부드럽게 재매달아 놓습니다. 재현탁되면 미토콘드리아를 사전 냉각된 라벨이 부착된 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. bison kinetic acid protein assay를 사용하여 미토콘드리아 단백질 농도를 측정합니다.
미리 냉각된 마이크로 원심분리기 튜브에서 분리 완충액을 사용하여 미토콘드리아 스톡을 원하는 작업 농도로 희석합니다. 분리 미토콘드리아 항체의 생존력과 품질을 테스트하려면 2.3ml의 호흡 완충액을 산소그래프 챔버에 로드합니다. 산소 소비 신호가 섭씨 37도에서 약 10분 동안 또는 속도가 0에 가까워질 때까지 평형을 이루도록 합니다.
평형을 이루면 스토퍼를 아래로 누르고 초과 버퍼를 흡입합니다. 10마이크로리터 Hamilton 주사기를 사용하여 1밀리몰 EGTA를 추가하여 Oxygraph의 호흡 완충액에 남아 있는 칼슘을 킬레이트화합니다. 호흡에 연료를 공급하기 위해, 5 밀리몰 소듐 피루브산과 1 밀리몰 알-말레이트를 완충액에 넣으십시오.
그런 다음 희석된 미토콘드리아 덩어리를 추가하고 5분 동안 호흡이 일어나도록 합니다. 5분 표시에서 500마이크로몰 ADP 덩어리를 추가하여 3상태 호흡을 시작합니다. 호흡 조절 비율을 계산하려면 상태 3 동안의 최대 산소 소비량을 상태 2에서 ADP를 추가하기 직전의 산소 소비량으로 나눕니다.
ADP 첨가 직후 산소 소비량의 급격한 증가가 관찰되었으며, 이는 고립된 심장 미토콘드리아에서 산화적 인산화가 성공적으로 시작되었음을 나타냅니다. 기니피그, Sprague-Dawley 쥐 및 Friend 백혈병 바이러스 B 마우스의 심장 미토콘드리아는 높은 호흡 조절 비율을 보여 미토콘드리아 분리 품질이 우수함을 나타냅니다. Sprague-Dawley Rats의 간 및 신장 미토콘드리아도 성공적인 격리를 뒷받침하는 허용 가능한 호흡 조절 비율을 보였습니다.
HEK293 세포는 허용 가능한 임계값 이상의 호흡 조절 비율 값을 나타내어 이러한 세포로부터 미토콘드리아 분리의 품질을 확인했습니다.
