시작하려면 겔 전기영동 준비에 필요한 시약을 작업 플랫폼에 놓습니다. 트리스/붕산염/EDTA 또는 TBE를 아가로스에 넣고 용액을 전자레인지에서 가열합니다. 그런 다음 0.4-0.5% 아가로스를 주조 트레이에 붓어 1차원 아가로스 겔을 준비하고 1시간 동안 응고시킵니다.
응고 후 겔의 가장 왼쪽 가장자리를 기준으로 처음 3cm 이내로 사다리를 로드합니다. 그런 다음 제한 효소로 절단한 DNA 샘플을 로드하여 각 쌍 사이에 3cm의 거리를 확보합니다. TBE에서 겔을 센티미터당 0.85볼트로 19-24시간 동안 실행하여 중간체를 크기별로 분리합니다.
다음 날, 완충액에서 겔을 제거합니다. 사다리가 들어있는 젤의 처음 3cm를 절제합니다. 에티듐 브로마이드 밀리리터당 0.3마이크로그램을 함유한 TBE의 겔 세그먼트를 10-15분 동안 염색합니다.
그런 다음 겔 문서화 시스템을 사용하여 사다리를 시각화합니다. 아가로스 겔에서 예상 위치에 1.3cm를 추가하여 A의 값을 산출합니다.그런 다음 값 A에서 7.5cm를 빼서 값 B를 얻습니다. 눈금자를 1차원 겔에 맞추고 값 A와 B에서 가로로 자른 다음 각 샘플에 대해 예약된 3cm 공간을 세로로 자릅니다. 새 주조 트레이에서 세그먼트를 시계 방향으로 회전하여 샘플 웰의 위치에 놓습니다.
에티듐 브로마이드 밀리리터당 0.3마이크로그램을 사용하여 TBE에서 1-1.3%의 농도로 2차원 아가로스 겔을 준비합니다. 겔을 가열하고 약 섭씨 55도로 냉각하면 회전된 1차원 세그먼트 위에 붓습니다. 젤을 한 시간 동안 응고시킵니다.
응고 후, 겔을 브롬화 에티듐 밀리리터당 0.3마이크로그램의 TBE가 포함된 챔버로 옮기고 30분 동안 평형화시킨다. 젤을 덮고 섭씨 9도에서 센티미터당 4.23볼트로 10-4시간 동안 작동시킵니다. 챔버에서 2차원 겔을 제거하고 DNA 단편을 0.24몰 염산 용액에서 부드럽게 흔들면서 10분 동안 탈피합니다.
겔을 탈이온수로 헹구고 0.4몰의 수산화나트륨에 10-15분 동안 담그십시오. 그런 다음 유리판을 가로질러 수직으로 두 장의 긴 크로마토그래피 종이를 접어 용기 안으로 확장합니다. 서던 블롯을 조립하려면 1리터의 0.4몰 수산화나트륨을 용기에 채웁니다.
용기를 가로질러 긴 유리 시트를 맞춥니다. 수산화나트륨으로 종이 상단을 적시고 표면 아래의 기포를 조심스럽게 제거합니다. 크로마토그래피 용지 3장에 수산화나트륨을 적시고 폴더 용지 위에 놓습니다.
기포를 제거하십시오. 2차원 겔을 거꾸로 뒤집어 크로마토그래피 종이 위에 놓습니다. 양전하를 띤 나일론 멤브레인을 탈이온수로 적시고 젤 위에 놓습니다.
그런 다음 탈이온수로 적신 3개의 크로마토그래피 시트를 멤브레인 위에 놓습니다. 용기에 노출된 수산화나트륨을 플라스틱 랩으로 덮어 증발을 방지합니다. 0.3-0.5 미터 높이의 냅킨 또는 종이 타월 더미를 블롯 위에 놓습니다.
단단한 모세관 작용을 촉진하기 위해 전체 블롯을 무게로 압축하고 DNA가 막으로 전달될 수 있도록 2일 동안 그대로 두십시오.
