먼저, 안락사된 쥐의 안구를 적출하고 얼음처럼 차가운 완충액에서 눈을 균질화합니다. 16, 4 섭씨 온도에 15 분 동안 000 G에 균질액을 분리한다. 수용성 단백질 및 기타 오염 물질이 포함된 상층액을 폐기하십시오.
그런 다음 펠릿 멤브레인 및 멤브레인 단백질을 회전 플랫폼에서 섭씨 4도에서 1시간 동안 완충액에 재현탁시키고 용해시킵니다. 그 후에, 16, 4개의 섭씨 온도에 000 G에 1 시간 동안 재용해한 막 분획을 분리한다. 상층액을 30-50 마이크로리터의 Rho1D4 항체 비드 및 빈 면역글로불린 G 항체 비드와 두 개의 독립된 개별 샘플에 혼합하고 회전 플랫폼에서 섭씨 4도에서 1시간 동안 배양합니다.
마그네틱 스탠드를 사용하여 비드를 모아 풀다운을 분리합니다. 상층액을 버리고 비스-트리스 프로판, 염화나트륨 및 N-도데실-베타-D-말토사이드를 함유한 고염 및 저염 완충액으로 비드를 세척합니다. 로돕신 단백질을 용리하려면 주어진 조성의 65 마이크로리터 완충액을 사용하여 실온에서 5-10분 동안 비드를 배양합니다.
그런 다음 조리개가 2mm이고 경로 길이가 10mm인 직사각형 서브 마이크로 50마이크로리터 석영 큐빗을 사용하여 분광 광도계를 사용한 빠른 스캔 설정에서 200나노미터에서 800나노미터까지의 흡광도에 대해 용리액을 분석합니다. 품질을 검증하고 결정하려면 용리액을 1분 동안 밝은 빛에 노출시킵니다. 그런 다음 흡광도 측정을 반복합니다.
빈 흡광도를 빼고 분석된 흡수 스펙트럼의 비율을 계산합니다. 그런 다음 빈 Subtracted Subtract Absorbent 스펙트럼을 플로팅하고 자유 opsin 값을 계산합니다. 그 후, Beer-Lambert 법칙을 사용하여 로돕신의 농도를 계산한 다음 리간드가 없는 옵신의 농도를 계산하고 아포옵신과 리간드가 없는 옵신의 농도 차이를 양과 백분율로 추정합니다.
