만능줄기세포(Pluripotent stem cell) 또는 PSC를 6웰 배양 플레이트(six-well culture plate)에서 유지하고 현미경으로 세포 밀도를 확인합니다. 심근세포 또는 CM 분화를 위해 PSC 준비 배지의 96웰 배양 플레이트에 PSC를 시드합니다. 심장 분화의 첫 번째 단계에서 PSC가 80-90%의 밀도에 도달하면 배지를 2-20 마이크로몰 CHIR이 있는 CM 분화 배지로 전환합니다.
CHIR 처리 24-48시간 후, 배지를 새로운 CM 분화 배지로 변경한다. 2단계 또는 3일째에 배지를 5일째까지 배양에서 5마이크로몰 IWR1이 보충된 CM 분화 배지로 교체합니다. 그런 다음 배지를 CM 분화 배지로 변경하고 PSC가 심장 전구 세포 또는 CPC로 분화하는 6-7일까지 유지합니다.
10일 또는 12일째에 실온에서 15분 동안 PBS에 4% 파라포름알데히드로 세포를 고정합니다. 염색시 세포를 투과성 용액으로 실온에서 30 분 동안 처리하십시오. CTNT 1차 항체로 검체를 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다.
그런 다음 1% 소 혈청 알부민을 함유한 PBS의 2차 항체로 샘플을 섭씨 37도에서 1시간 동안 처리합니다. 세포에서 2차 항체를 제거한 후 실온에서 5분 동안 Hoechst에 의해 핵을 염색합니다. 그런 다음 건조를 방지하기 위해 웰당 100마이크로리터의 PBS를 추가하기 전에 PBS를 사용하여 세포를 세 번 헹굽니다.
살아있는 세포 배양을 지원하는 자동 현미경을 사용하여 다양한 분화 단계의 명시야 및 CTNT 면역형광 이미지를 수집하려면 소프트웨어를 열고 새로운 실험 설계를 생성하십시오. 이미징을 위해 5X 대물렌즈와 2X2 블렌드를 선택하십시오. 채널 메뉴에서 명시야를 위한 TL 명시야 채널과 면역형광 이미징을 위한 AF 488 및 H 33 42 채널을 추가합니다.
이미징 설정에서 광 경로를 수정합니다. Z 스택 메뉴에서 스캔할 때 슬라이스 수와 간격을 설정합니다. 탐색 및 타일 창에서 캐리어별로 타일 영역을 설정하고 25개의 타일 5개 열을 하나의 웰에 대해 5개의 행으로 설정합니다.
이미지를 획득하려면 먼저 세포 배양 플레이트를 샘플 트레이에 넣고 트레이를 현미경 내부에 로드합니다. 샘플이 살아있는 세포로 구성된 경우 가열 시스템과 이산화탄소 펌프를 열어 배양에 적합한 조건을 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 유지합니다. 사전 설정된 실험 프로젝트를 엽니다.
타일 메뉴를 열고 플레이트의 위치를 수동으로 보정합니다. navigation and tiles 창에서 필요한 웰을 선택하고 create를 클릭하여 이러한 웰에 대한 타일 영역을 구성합니다. 타일 메뉴에서 타일 영역 확인을 클릭하고 자동 초점을 실행하여 모든 웰을 확인합니다.
그런 다음 각 웰의 초점을 수동으로 수정합니다. 실험 시작 버튼을 클릭하고 자동 이미징을 기다립니다. 일반적으로 전체 96웰 배양 플레이트를 스캔하는 데 약 1.2시간이 걸립니다.
처리 프레임워크에서 이미지 내보내기를 선택하고 압축되지 않은 TIFF 형식 또는 PNG 형식의 파일 형식을 선택하고 적용합니다.
