시작하려면 열 인큐베이터를 섭씨 42도에서 예열합니다. 마그네슘 아세테이트와 칼륨 아세테이트 용액 혼합물 1마이크로리터를 동결건조되고 사전 혼합된 RTRPA 펠릿이 들어 있는 튜브 측면에 추가합니다. RNA 샘플의 12.4 마이크로리터에 펠릿을 재현탁시킵니다.
RTRPA 반응을 시작하려면 실온에서 스핀다운 미니 원심분리기를 사용하여 추가된 용액을 3초 동안 잠시 스핀다운합니다. 튜브를 조심스럽게 두드려 내용물을 완전히 섞고 다시 회전시킵니다. 섭씨 42도에서 예열된 열 진탕 인큐베이터에서 60분 동안 반응을 배양합니다.
반응이 종료된 후 CRISPR-Cas 검출을 진행하기 전에 반응 튜브를 제거하고 얼음 위에 놓습니다. 핵산 검출을 위해 형광 마이크로플레이트 리더를 켭니다. 마이크로플레이트 리더를 섭씨 37도로 설정 및 예열하고 프로그램을 선택합니다.
그런 다음 384 웰 플레이트를 얼음 위에 놓습니다. 동결건조된 CRISPR-Cas pre-mixed 검출 반응을 재현탁시키려면 17마이크로리터의 8밀리몰 염화마그네슘 용액을 추가합니다. 튜브를 조심스럽게 두드려 섞는다.
튜브를 얼음 위에 놓기 전에 3초 동안 잠시 회전시킵니다. 재현탁 반응 혼합물 18 마이크로리터를 얼음 위에 사전 냉각된 384웰 플레이트의 각 웰로 이송합니다. 각 반응 웰에 준비된 RPA 제품 2마이크로리터를 추가합니다.
얼음에서 접시를 제거합니다. 예열된 형광 마이크로플레이트 리더에 빠르게 넣고 시작을 누릅니다. 동결 건조되고 사전 혼합된 Cas13a 기반 반응의 경우 6% 트레할로스 또는 2% 자당은 동결 건조 후에도 반응 효율을 잘 보존합니다.
RTRPA 및 Cas13 기반 반응을 위한 동결건조된 사전 혼합 시약은 섭씨 20도에서 최소 8개월 동안 안정적입니다.
