먼저 24개의 웰 플레이트를 코팅 용액으로 코팅하고 섭씨 37도에서 2시간 동안 또는 실온에서 하룻밤 동안 배양합니다. 멸균수로 플레이트를 두 번 세척하고 셀이 도금할 준비가 될 때까지 실온에서 보관합니다. 이제 말 jejunum의 일부를 얼음 위의 차가운 링거 용액에 넣으십시오.
제주눔에서 10cm 부분을 제거하고 장간막성 경계에서 열어 비림프 부위를 중앙에 위치시킵니다. 그런 다음 해당 부분을 약 7 x 7cm 부분으로 자르고 절개하기 전에 조직을 신선한 링거 용액으로 잘 헹굽니다. 이제 점막 쪽이 위로 향하게 하여 실리콘 엘라스토머로 코팅된 페트리 접시(PBS)에 조직을 고정하고 가능한 한 많이 늘립니다.
구부러진 집게를 사용하여 장 융모를 제거한 다음 약 5 x 5cm 크기의 비림프 영역에서 층막(lamina propria)을 제거합니다. 다음으로 미세 해부 가위로 한쪽 모서리를 풀어 한 장의 점막을 제거합니다. 내부 원형 근육층에서 점막하층을 벗겨내는 동안 자연스러운 분리를 관찰합니다.
그런 다음 수집된 점막하층을 2-5mm 조각으로 다집니다. FBS, 콜라겐 분해 효소, 프로테아제 및 BSA가없는 5 밀리리터의 오르고노가 들어있는 50 밀리리터의 원뿔형 튜브에 넣으십시오. 효소 소화를 위해 섭씨 37도에서 2-3시간 동안 조직을 배양합니다.
배양 후 FBS와 함께 실온 오르고노 10ml를 첨가하여 효소 작용을 중지합니다. 10ml의 혈청학적 피펫을 사용하여 조직 혼합물을 위아래로 15회 피펫팅하여 조직에서 세포를 분리합니다. 그런 다음 혼합물을 3000G에서 실온에서 3분 동안 원심분리합니다.
그 후, 상층액을 버리고 10 밀리리터 혈청학적 피펫으로 용액을 위아래로 15회 피펫팅하여 펠릿을 실온 PBS 10밀리리터에 재현탁시킵니다. 원추형 튜브를 3000G에서 실온에서 3분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버린 후 FBS를 사용하여 10회 위아래로 피펫팅하여 펠릿을 실온 오르고노에 15ml 재현탁시킵니다.
다음으로, 100마이크로미터, 70마이크로미터, 40마이크로미터 기공 크기의 세포 여과기를 통해 세포를 순차적으로 여과합니다. 세포를 원심 분리하고 상층액을 버린 후 FBS로 펠릿을 오르고노 1 밀리리터에 재현탁시킵니다. 그런 다음 트리판 블루로 세포를 염색하여 살아있는 세포를 식별하고 혈구계를 사용하여 세포를 계산합니다.
지금 대략 400, 24의 우물 판의 각 우물에 있는 FBS를 가진 orgono의 300 마이크로리터에 있는 000의 세포를 씨를 뿌린다. 각 웰에 5마이크로리터의 N2, 5마이크로리터의 G5, 10마이크로리터의 B27을 추가합니다. 이산화탄소가 37% 함유된 섭씨 5도 인큐베이터에 플레이트를 넣어 세포가 접착될 수 있도록 합니다.
첫 번째 통로의 세포가 70-80% 합류점에 도달하면 웰을 24시간 동안 0, 10 및 25나노그램의 인터루킨-1 베타에 노출시킵니다. 장내 신경교세포(enteric glial morphology)와 일치하는 방추형 세포가 배양에서 관찰되었으며, 다형성(pleomorphism)이 있고 다른 세포 유형으로부터의 오염이 최소화되었습니다.
