먼저 Transwell 인서트에 42마이크로리터의 0.05%Matrigel을 코팅합니다. Matrigel이 굳을 때까지 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. 여분의 매체를 흡입하고 Transwells를 덮지 않은 상태에서 30분 동안 건조시킵니다.
그런 다음 각 인서트에 200마이크로리터의 DMEM F12 매체를 추가하고 사용할 때까지 섭씨 37도에서 보관합니다. 오가노이드가 들어있는 Matrigel 패티를 PBS로 세척합니다. 얼음 위에서 500 마이크로리터의 세포 회수에 노출시키고 혼합물을 반복적으로 피펫팅하여 15 밀리리터 튜브에 세포가 완전히 모이도록 합니다.
그런 다음 300g에서 튜브를 섭씨 4도에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 세포 펠릿을 장 상피 줄기 세포 또는 IESC 배지의 목표 부피에 재현탁시킵니다. 이제 1밀리리터 주사기를 IESC 배지에 사전 코팅하고 16게이지 바늘을 통해 세포 현탁액을 흡입합니다.
그런 다음 16 게이지 바늘을 28 게이지 바늘로 교체하고 현탁액을 배출하여 오가노이드의 분리를 촉진합니다. 다음으로, 생성된 셀 현탁액 200마이크로리터를 코팅된 Transwell의 정점 쪽에 놓습니다. 500 마이크로리터의 IESC 배지 및 성장 인자를 기저 쪽에 추가합니다.
이중 전극 TEER 측정 챔버를 사용하여 단층에서 TEER를 정량화합니다. 배양 컵에 1.5밀리리터의 IESC 배지를 채우고 Transwell 인서트에 정확히 200마이크로리터의 매체가 있는지 확인하여 측정 중에 유체 레벨이 일치하도록 합니다. Transwell 삽입물의 기저측 측면을 인터루킨-1 베타의 염증성 사이토카인 또는 인터루킨-1 베타에 노출된 배양액의 신경교세포제에 노출시킵니다.
각 Transwell을 문화 컵에 넣어 10-15분마다 45분 동안 TEER를 측정합니다. 10 및 25 나노그램의 인터루킨-1 베타로 처리된 신경교세포(glial) 배양에서 배지에 대한 기저측 노출은 상피장벽 투과성을 크게 증가시켰습니다. 다양한 농도에서 말 인터루킨-6에 노출된 후 상피 투과성의 유의한 증가는 관찰되지 않았습니다.
