먼저, 냉동 열 스트레스 및 처리되지 않은 5일 된 Columbia-0 애기장대 묘목을 액체 질소 용기에 수집합니다. 균질기를 사용하여 묘목을 1 분 동안 가루로 갈아줍니다. 그런 다음 500 마이크로리터의 폴리좀 추출 완충액을 튜브에 추가합니다.
튜브를 반전시키고 소용돌이치게 하여 샘플을 혼합합니다. 12, 4개의 섭씨 온도에 10 분 동안 000G에 적출 해결책을 분리한다. 그런 다음 100마이크로미터 세포 여과기를 통해 상층액을 여과하여 투명하고 입자가 없는 추출 용액을 얻습니다.
여과된 상층액을 미리 준비된 자당 그래디언트에 로드하고 평형에 도달할 때까지 기다립니다. 그 후에, 210에 진동 물통 회전자를 사용하여 ultracentrifuge , 최대 가속도 및 감속 비율을 가진 4 섭씨 온도에 3.5 시간 동안 000G. 비-폴리솜 및 폴리솜 RNA는 해당 슈크로스 그래디언트 용액에서의 밀도에 기초하여 분리됩니다.
70% 자당, 10% 글리세롤 및 0.02% 브로모페놀 블루로 구성된 마이크로 볼륨 주사기 펌프용 체이스 용액을 준비합니다. 용액을 30-40분 동안 철저히 섞습니다. 쫓는 용액을 그래디언트에 주입한 후 소프트웨어를 사용하여 밀도 그래디언트 분별기를 제어합니다.
그런 다음 탈이온수로 기계를 보정합니다. 초원심분리 후 튜브를 밀도 구배 분획기에 놓습니다. 튜브 피어싱 시스템을 사용하여 튜브를 주사기 펌프와 자외선 감지기에 연결합니다.
밀도 그래디언트 분별기를 소프트웨어 제어 모드 원격으로 전환합니다. 마이크로 볼륨 시린지 펌프의 주입 유량을 분당 3밀리리터로 설정합니다. fractionator를 사용하여 254나노미터에서 광학 밀도를 측정하여 폴리솜 프로파일 그래프를 얻는 프로세스를 시작합니다.
폴리솜 프로파일 측정에 따라 비폴리솜 및 폴리솜 RNA 분획을 별도로 수집합니다. 수집된 RNA 분획을 사전 저온 2배 고염 용액과 철저히 혼합합니다. 그런 다음 키트에서 희석된 진핵생물 poly-A RNA 제어 스톡 8마이크로리터를 추가합니다.
450에 진동 물통 회전자와 높 소금 해결책에 의하여 섞인 RNA를 분리하십시오, 4 섭씨 온도에 5 시간 동안 000G. 상층액을 조심스럽게 붓고 500마이크로리터의 사전 냉각수 DEPC 처리수로 RNA 펠릿을 세 번 세척합니다. 마지막 세척 후 RNA 샘플에 500마이크로리터의 RNA 추출 시약을 추가합니다.
섞어서 10분 동안 배양합니다. 클로로포름 100마이크로리터를 넣고 잘 섞는다. 상 분리를 위해 10분 동안 배양합니다.
12, 4 섭씨 온도에 10 분 동안 000G에 혼합물을 분리한다. RNA를 포함하는 상부의 투명한 수성층을 새 튜브로 옮기고 동일한 부피의 이소프로판올과 부드럽게 혼합합니다. RNA를 침전시키기 위해 혼합물을 섭씨 영하 20도에서 2시간 동안 배양합니다.
침전 후 다시 원심분리하고 상층액을 버리고 RNA 펠릿을 바닥에 남겨둡니다. RNA 펠릿을 사전 냉각 75% 에탄올 1밀리리터로 세척합니다. 12, 4 섭씨 온도에 10 분 동안 000G에 분리하고 RNA 펠릿을 공기 건조하십시오.
건조 후 펠릿을 DEPC 처리수 30마이크로리터에 재현탁시킵니다. 220 - 750 나노미터에서 전체 스펙트럼 분광 광도계를 사용하여 RNA 농도를 측정하고 260에서 광학 밀도에 초점을 맞춥니다. 폴리솜 프로파일링은 정상적인 조건에서 비폴리솜 분획과 폴리솜 분획 사이의 뚜렷한 분리를 보여주었습니다.
섭씨 40도에서의 열 스트레스는 폴리솜 분획의 신호 강도를 크게 감소시켰고, 이 효과는 섭씨 22도에서 2시간 동안 회복된 후 역전되어 신호를 제어 수준으로 되돌렸습니다. RNA 추출 결과는 열 스트레스가 폴리솜 분획에서 RNA의 비율을 감소시켰으며, 이는 섭씨 22도에서 회복 후 복원되었습니다.
