시작하려면 추출한 쥐 조직을 50% 얼음 냉식 식염수와 50% 메탄올이 들어 있는 조직 분쇄기 튜브에 넣습니다. 유봉을 그라인더 튜브에 삽입하고 부드럽게 5번 회전시켜 조직을 균질화합니다. 균질화된 조직을 즉시 15밀리리터 튜브에 옮깁니다.
2ml의 메탄올과 1ml의 0.1몰 하이드록실아민을 균질화된 샘플에 추가합니다. 혼합물을 실온에서 15분 동안 그대로 두십시오. 레티노이드 추출을 위해 균질액에 10mL의 헥산을 추가하고 튜브를 최소 10초 동안 수평으로 소용돌이칩니다.
균질한 헥산 혼합물을 1000 x g에서 3분 동안 원심분리하여 상을 분리합니다. 피펫을 사용하여 헥산 층을 별도의 15밀리리터 유리관에 옮기고 샘플을 진공 원심분리기에 넣어 추출된 샘플에서 헥산을 완전히 증발시킵니다. 건조된 레티노이드를 15밀리리터 튜브에 100마이크로리터의 헥산과 와류와 함께 잘 재현탁시켜 모든 레티노이드가 용해되도록 합니다.
헥산 100마이크로리터 전체를 두 번째 유리관에 피펫팅하고 튜브를 소용돌이치게 하여 레티노이드를 용해시킵니다. 그런 다음 HPLC 분석을 위해 100마이크로리터의 헥산 전체를 단일 유리 불활성으로 피펫팅합니다. 적절한 조건을 사용하여 HPLC 실행을 설정합니다.
표준물질에 따라 관심 있는 각 레티노이드에 대한 머무름 시간 및 UV 스펙트럼을 사용하여 피크를 식별합니다. 크로마토그래피 데이터 시스템을 사용하여 식별된 피크를 적분하고 외부 표준 곡선을 참조하여 분석물을 정량화합니다. 생체 조직 크로마토그램의 경우, 머무름 시간의 변동성을 설명하기 위해 피크를 수동으로 적분합니다.
대조군 마우스 눈의 크로마토그램에서 13-cis-retinal, 11-cis-retinal, all-trans-retinal, 11-cis-retinol 및 all-trans-retinol이 확인되었습니다. 하이드록실아민으로 처리한 쥐 눈의 크로마토그램에서 머무름 시간이 증가했습니다. 이러한 레틴알데히드의 Syn 및 항 이성질체도 존재했습니다.
생쥐 간 조직의 크로마토그램에서 레티닐 팔미테이트와 올-트랜스-레티놀은 비타민 A의 주요 형태로 확인되었으며, 생쥐 혈액에서는 트랜스-레티놀 피크를 보였습니다. UV 흡수 스펙트럼은 크로마토그램 피크에서 레티노이드 동형의 존재를 확인했습니다.
