매튜 오설리번 및 페이 만주국은 호주 국립 보건 의학 연구위원회 대학원 의학 연구 장학금을받는 수 있습니다.

신중한 검토가 프라이머 및 프로브 디자인에 부여해야합니다. 같은 GenBank와 같은 데이터베이스에서 관심의 대상의 가능한 모든 시퀀스는 적합한 목표물 보존 영역을 식별하는 데 활용해야합니다. 목표의 많은 수의 단일 mPCR 분석에 증폭되고 어디에, 각 증폭 시퀀스와 비슷한 길이 있어야하고, 경쟁을 피하기 위해 300 기본 쌍을 초과해서는 안됩니다. 방법의 대안 응용 프로그램은 보존 지역에 대한 primers를 사용하여 하나 이상 목표를 증폭하고 amplicon 내에서 순서 변화를 식별하는 여러 개의 프로브를 사용하는 것입니다. 이 인스턴스에서 증폭된 PCR 제품은 더 이상있을 수 있습니다. 프라이머 어닐링 온도는 적절하게 조정 PCR 조건과 비슷한해야합니다. 강력한 보조 구조 또는 프라이머의 이합체 형성 Primers은 피해야한다. 시그마 알드리치 DNA 계산기 ( <a href="http://www.sigma-genosys.com/calc/DNACalc.asp">http://www.sigma-genosys.com/calc/DNACalc.asp는</a> ) 안정적으로 이러한 기능을 예측하는 데 사용할 수 있습니다. DNA 프로브은 60에 가까운 온도 ° C.를 어닐링되도록 설계되어야 특이성을 극대화하기 위해, 관심있는 각 대상의 두 가지 프로브는 분석, 반대 뇌관 바인딩 사이트에 인접한 앞으로의 DNA 가닥을 hybridizing 하나 그리고 앞으로 뇌관 바인딩 사이트에 인접한 반대 스트랜드에 다른 포함될 수 있습니다. 이 경우에 모두 순방향 및 역방향 primers은 비오틴 - 수정해야합니다. 증폭 대상마다 하나의 프로브가 사용되는 경우, 하나의 뇌관이 비오틴은 변경될 수 필요합니다. primers 및 mPCR / RLB 분석을위한 프로브를 디자인할 때 그것은 강력하게 체외 결과와 연관시키는 것은 PCR 제품 및 프로브 하이브 리다이 제이션을 예측하는 silico 방법에 사용하는 것이 좋습니다. 이상적으로 이것은 전체 게놈 시퀀스를 사용할 수있는 격리를 사용하여 수행됩니다. 이러한 FastPCR (http://primerdigital.com/fastpcr.html보실 수 있습니다)와 같은 소프트웨어는 이러한 목적으로 사용할 수 있습니다. silico 분석에 낮은 온도 프로브 어닐링의 결과로 기본 쌍의 불일치를 나타냅니다 약하거나 부재 프로브 신호가 예측할 수 있습니다. DNA 추출 기술은 테스트중인 샘플에 따라 달라질 수 및 PCR 조건은 프라이머 설계에 의존합니다. 독자들은 DNA 추출 및 PCR 시약의 조건 1-19에 대한 자세한 내용은 개별 assays에 간행물라고합니다. 각각의 분석은 적어도 한 멤브레인 각 프로브에 대한 긍정적인 하나의 부정적인 프로브 신호뿐만 아니라 DNA없는 제어를 제공하기 위해 적절한 컨트롤로 실행됩니다. 또한 그것은 모든 샘플 (미생물의 경우에는 동물 또는 속 특정 프로브 등)에 대한 긍정적인 것으로 예상되는 멤브레인 상단의 프로브를 포함하는 유용합니다. 이것은 긍정적인 제어 프로브 역할뿐만 아니라, 결과를 쉽게 방향을 수 있습니다. 1. 분리막의 준비 <ol><li> 다음과 같은 솔루션을 준비 : <ul><li> 100ml 0.5M NaHCO3 (산도 8.4) </li><li> 100 ML 0.5M NaHCO 3 </li><li> 20 ML 16 % EDAC </li><li> 250 ML 0.1 M NaOH </li><li> 250 ML 2xSSPE </li><li> 250 ML 2xSSPE/0.1 % SDS - 60 ° C에서 waterbath에서 개최 </li><li> 250 ML 20 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산). </li></ul></li><li> 60 ° C. 미리 가열 오븐 </li><li> 70 % 에탄올로 Immunetics의 Miniblotter를 청소합니다. </li><li> 2 pmol / μl의 최종 농도와 200 μl의 볼륨에 0.5 M NaHCO 3의 oligonucleotide 프로브를 희석. </li><li> 15x15 cm에 BiodyneC 나일론 막 컷. 연필과 통치자를 사용하여 막의 맨 위에 0.5 cm 공간을 지배하고 여기에 세부 사항을 작성합니다. </li><li> 20 ML과 비닐 봉투에 밀봉 막 갓 10 분 실온에서 16 % EDAC 솔루션과 바위했다. </li><li> 30 초 동안 deionised 물에 막 씻으십시오. </li><li> 멤브레인 (연필 라인에 평행)에 걸쳐 실행 채널 miniblotter에 넣어 막. 장소와 가까운 블로터에서 지원 쿠션을 넣어. 채널에서 유체 대기음. </li><li> 150 μl 0.5 M NaHCO 3 차선 1 45 채웁니다. 공기 방울을 피하기 위해주의되는, 차선 순서에 2-44을 채우기 위해 각 프로브 솔루션 150 μl를 사용하십시오. 공기 방울이 자리에 피펫을 유지, 채널에 나타나지 않는 경우, 신속하게 공기 방울은 피펫의 상단에 부동 수 있도록 솔루션을 대기음 후 다시 시도하십시오. 5 분 실온에서 알을 품다. </li><li> 프로브 솔루션을 기음, 멤브레인을 제거하고 구분을 위해 상온에서 250 ML 0.1 M NaOH로 씻으십시오. </li><li> 30 초 동안 250 ML 2xSSPE에서 막 씻으십시오. </li><li> 60 오븐에 250 ML 미리 예열 2xSSPE/0.1 % SDS에서 막 씻으 ° C 5 분. </li><li> 즉시 하이브 리다이 제이션을 위해 사용하지 않는 경우, 20 분 (나머지 10ml를 예약)에 상온에서 240 ML 20 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)에서 막을 세척 후, 나머지 10 ML 20 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 스터와 비닐 봉투에 막을 인감4 냉장고에 E ° C. </li><li> 세제와 브러쉬 Pyroneg와 miniblotter 씻으십시오. 린스 건조 수 있습니다. </li></ol> 2. 하이브 리다이 제이션 및 감지 <ol><li> 다음과 같은 솔루션을 준비 : <ul><li> 250 ML 2xSSPE/0.1 % SDS - 60 물 목욕에 저장 ° C. </li><li> 500 ML 2xSSPE/0.5 % SDS - 60 물 목욕에 저장 ° C </li><li> 500 ML 2xSSPE/0.5 % SDS - 42에서 오븐에 저장 ° C </li><li> 500 ML 2xSSPE - 실온에서 보관 </li><li> 500 ML 1퍼센트 SDS - 60 물 목욕에 저장 ° C 초기 (3 단계) </li><li> 250 ML 20 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - 상온에서 저장 (3 단계). </li></ul></li><li> 60 한 오븐 켜고 ° C 한 오븐 42 ° C. 열판에 큰 비커에 넣어 익히지 물을 가져와. </li><li> 70 % 에탄올로 Miniblotter 클린 Immunetics. </li><li> 작은 용기에 2xSSPE/0.1 % SDS의 나누어지는 10 ML. 번호 튜브 150 μl 2xSSPE/0.1 % SDS 각 PCR 제품의 20 μl를 추가합니다. </li><li> 100 10 분에 대한 PCR 제품을 삶아 ° C 스티로폼 홀더를 사용하여. 적어도 5 분 즉시 얼음에 놓습니다. </li><li> 60 240 ML 2xSSPE/0.1 % SDS를 나머지에 막 씻으 5 분 ° C 오븐. </li><li> 배경 쿠션과 miniblotter에 넣어 막. 동쪽을 향하게하므로 채널 (수직 연필 선)를 수직으로 실행합니다. </li><li> miniblotter 채널에서 흡입 초과 액체. </li><li> 처음이자 마지막 채널 남은 150 μl 2xSSPE/0.1 % SDS를 추가합니다. 공기 방울을 피하기 위해주의하고, 시퀀스에 남아 채널 (2-44)에 삶은 PCR 제품을 추가합니다. </li><li> 60 평면 플레이스 miniblotter 하이브리드화가 이루어지는 수 있도록 1 시간 ° C 오븐. </li><li> 각 채널에서 대기음 액체 다음 miniblotter에서 막을 제거합니다. </li><li> 10 분 60 ° C의 오븐에 prewarmed 250 ML 2xSSPE/0.5 % SDS 두 번 씻으십시오. </li><li> 42 2xSSPE/0.5 % SDS와 나일론 메쉬 분리를 축축하게하다 ° C와 멤브레인을 올리고 그것을 사용합니다. </li><li> 장소는 롤러 튜브로 막을 올리고, 그리고 멤브레인은 내부 표면을 맞닿아 있죠 있도록 펴다. 42 15 ML 2xSSPE/0.5 % SDS 3 μl streptavidin - 퍼옥시데이즈의 공액 (로체 응용 과학)를 추가 ° C와 롤러 튜브에 추가합니다. 단단히에서 뚜껑을 비할 42 롤러 오븐에 품어 ° C를 60 분. 롤 방향 멤브레인가 강화하지 않는 등한지 확인하십시오. 누출 주기적으로 확인합니다. </li><li> 세제와 물을 Pyroneg에 miniblotter 씻으십시오, 린스와 건조 수 있습니다. </li><li> 롤러 튜브에서 막을 제거합니다. 42 2xSSPE/0.5 % SDS를 남은 ° C를 10 분 동안 두 번 씻으십시오. </li><li> 5 분 상온에서 두 번 2xSSPE에 씻으십시오. </li><li> 80까지 오븐 미리 따뜻하게 ° C 및 장소 500ml 1% SDS 오븐 인치 턴 </li><li> 15 ML 아머샴 ECL 탐지 솔루션 (솔루션의 7.5 ML를 및 솔루션 B의 7.5 ML)까지합니다. 2xSSPE 및 검색 솔루션을 추가 폐기하십시오. 솔루션을 막의 완전한 범위를 보장 2 분 동안 손으로 부드럽게 록. chemiluminescent 솔루션을 폐기하십시오. </li><li> 노출 카트리지에 맞게 플라스틱 투명 두 시트를 자르고. 두 시트 및 노출 카트리지에 장소 사이 막. </li><li> 암실로 진행합니다. 빨간 불빛 아래 카트리지에 ECL 검출 필름을 추가하고 5 분 노출. 볼 때 올바른 방향을 수 있도록 제거시 필름의 강아지 귀 오른쪽 아래 모퉁이. </li><li> 마다 제조 업체의 지시로 자동 개발자 또는 화학 욕조와 필름을 개발. </li><li> 필요한 경우 길거나 짧게 노출 시간과 노출을 반복합니다. </li></ol> 3. 분리막의 재생 <ol><li> ° C 30 분 동안 두 번 80 250 ML 1% SDS에서 막 씻으십시오. </li><li> 15 분 동안 상온에서 240 ML 20 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)에서 막 씻으십시오. </li><li> 시일 10 ML 20 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 함께 비닐 봉지에 막과 ° C 향후 다시 사용할 수 있도록 4 냉장. </li></ol> 4. 대표 결과 : 결과는 최고의 인쇄된 격자를 통해 영화를 배치하거나,​​ 다른 이미지를 스캔과 같은 BioNumerics (응용 수학, 신트 - 마틴스 - Latem, 벨기에)와 같은 소프트웨어로 가져와서 볼 수 있습니다. 각 프로브 결과는 긍정적이고 부정적인 제어 프로브 참조로 해석해야합니다. 결과는 최고 부정적 약하거나 긍정적으로 등급입니다. 신호가처럼 강한하거나 긍정적인 제어 프로브보다 강한 어디에 긍정적인 결과입니다. 신호가 없거나 부정적인 제어 (배경 신호의 경우)에 동일한 어디에 부정적인 결과입니다. 약한 결과는 신호가 긍정적인 제어 프로브보다 약해요하지만, 대조군보다 강한 어디에 있습니다. 약한 결과는 약한 프로브 구속력이나 뇌관의 이합체 형성 이외의 특정 신호로 인해 이어지는 점 돌연변이의 결과 수 있습니다. 관심 대상마다이 프로브를 사용하면 하나의 약한 결과가 안전하지 않은 특정 신호로 해석될 수있는 특이성을 향상시킬 수 있습니다. 의심이 남아있을 경우, 단일 플렉스 PCR 반응은 어떤 A의 젤 기반 감지 및 시퀀싱과 함께 수행할 수결과가 정말 긍정적인 있는지 확인하기 위해 제품을 lified. 대표 결과는 그림 2에 표시됩니다. <img src="/files/ftp_upload/2781/2781fig1.jpg" alt="그림 1"/> 그림 1. mPCR / RLB 원칙 (P1)은 1.9 단계. 아민 수정 프로브는 나일론 막에 covalently 바운드 있습니다. (P2) 단계 2.10. 비오틴 수정 PCR 제품은 프로브에 hybridized입니다. (P3) 단계 2.14. 퍼옥시데이즈으로 표시 Streptavidin은, 멤브레인와 incubated과 비오틴에 바인딩됩니다. (P4) 2.19-2.21 단계를 반복합니다. 퍼옥시데이즈는 빛이있는 조명 민감한 필름을 노출하기 위해 생산, ECL 검색 시약의 반응을 catalyses. 막 그런 다음 다시 사용하는 세탁 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2781/2781fig2.jpg" alt="그림 2"/> 그림 2. 대표 mPCR / RLB 결과. 1-6 샘플 1 긍정적인 컨트롤을 나타냅니다 - 그들 사이의 43 프로브 각각에 대해 적어도 하나의 긍정적인 프로브 신호가 있습니다. 각 대상 시퀀스 (U를 통해 A) 특이성을 최대화하기 위해 두 가지 프로브와 함께 발견됩니다. 프로브 A1과 A2는 각 샘플에 대해 긍정하고 필름을 orienting 도와 것으로 예상되는 종의 특정 프로브를 나타냅니다. 프로브 A1은 막의 하단에 반복됩니다. 샘플 7 8 부정적인 컨트롤입니다. 프로브 Q1이 Q2, T1과 T2가 primers 또는 뇌관 이합체의 제품의 가능성이 특이 현상이 바인딩을 나타내는 부정적인 컨트롤에 신호를 가지고 있습니다. 이러한 프로브 또는 primers의 다시 설계해야 할 것입니다. 프로브 C1, D1과 streptavidin - 퍼옥시데이즈의 공액 또는 chemiluminescent 기판의 일부가 아닌 구체적인 이해로 인해 가능성 멤브레인 전체 줄이 F1 쇼, 그러나 이것은 쉽게 진정한 긍정적인 프로브 신호를 구분할 수 있습니다. 프로브 D1과 D2는 다른 프로브에 비해 상대적으로 약한 신호를 가지고이 덜 효율적으로 증폭에 이르는 큰 amplicons 때문일 수 있습니다. 프로브 J2는 부정적인 것은 프로브 J1가 좋은 몇 가지 샘플 (1, 3, 4, 6, 39)입니다. 이것은 대부분이 샘플에 대한 J2 바인딩 사이트에서 돌연변을 나타냅니다.

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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+and+identification+of+common+cell+culture+contaminant+and+pathogenic+mollicutes+strains+by+reverse+line+blot+hybridization.">Simultaneous detection and identification of common cell culture contaminant and pathogenic mollicutes strains by reverse line blot hybridization.</a> Appl Environ Microbiol. 70, 1483-1486 (2004).</li><li>Kong, F., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+PCR-based+reverse+line+blot+hybridization+assay+(mPCR/RLB)+-+a+practical+epidemiological+and+diagnostic+tool.">Multiplex PCR-based reverse line blot hybridization assay (mPCR/RLB) - a practical epidemiological and diagnostic tool.</a> Nat Protoc. 1, 2668-2680 (2006).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

mPCR / RLB 방법은 PCR의 amplicons 다수의 동시 감지를 허용합니다. 때문에 chemiluminescent 프로브 기반 탐지의 높은 감도의 프라이머 쌍 다수와 함께 하나의 멀티 플렉스 PCR 반응은 DNA 템플릿을 증폭하는 데 사용할 수 있습니다. 더 프로브 신호가 남아있는 PCR 제품과 겔 전기 영동을 수행하는 하나 이상의 샘플과 취득이 없으면 문제가 PCR의 증폭이나 프로브 하이브 리다이 제이션과 함께인지 여부를 구별할 수 있습니다. 멤브레인 모든 프로브 신호가 약하거나 부재하지만, 겔 전기 영동이 성공적으로 PCR 증폭을 나타냅니다 어디에, 가능성은 멤브레인의 상표 문제, 이전에 사용 후 막의 잘못된 재생, 하이브리드화 또는 streptavidin 부화하는 동안 잘못된 온도, 또는 결함이 포함 streptavidin을 퍼옥시데이즈의 공액 또는 검출 시약. 컨트롤 샘플 개별 프로브가 거짓 부정적인 신호, 젤 기반 감지 및 이후의 시퀀싱과 함께 하나의 PCR은 PCR 제품의 증폭을 확인하고 프로브 바인딩 사이트에서 순서 변화를 찾는 수행할 수 있습니다 생산있을 수 나타내는 경우. 약하거나 부재 프로브 신호는 대형 amplicon 크기 때문일 수 있습니다 : 가능하면 모든 amplicons 비슷한 길이 미만 300 BP의해야합니다. amplicons의 보조 DNA 구조는 또한 가난한 프로브 바인딩을 생산 수 있으며, primers의 다시 디자인을 할거 수 있습니다. 개인 프라이머 또는 프로브 농도는 신호의 강도를 최적화하기 위해 다양한 수 있습니다. nonamplified primers 또는 뇌관 이합체 - 제품의 바인딩 프로브에 의한 거짓 긍정적인 신호는 젤 기반 감지 및 이후의 시퀀싱과 함께 하나의 PCR를 수행하여 조사 수 있습니다. 이런 경우, necessitated 수있는 프로브의 재설계. 프로브 구속력이 사이트에 포인트 돌연변이 약하거나 결석 신호가 발생할 수 있습니다. 각각의 증폭 제품의 두 가지 프로브를 허용하면 검색이 쉽습니다. 이 특성은 신중 뇌관 및 대상 DNA의 작은 시퀀스 변화를 감지 프로브 디자인으로 악용될 수 있습니다. 사용 가능한 제품 검색 다음의 멀티 플렉스 PCR 반응의 많은 방법이 있지만 요약, mPCR / RLB 낮은 설정 - 비용으로 높은 처리량과 저렴한되는 장점이 있습니다. 방법의 유연성은 어플 리케이션의 광범위한에서의 사용을 허용합니다.

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 </th></tr><tr><td> 5 &#39;아민 C6는 oligonucleotide 프로브를 수정 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> S - 8875 </td><td> 0.5 M 솔루션은 산도 8.4까지 만들어 </td></tr><tr><td> NaOH </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> S5881 </td><td> 0.1M 용액 </td></tr><tr><td> 20xSSPE 버퍼 </td><td> Amresco </td><td> 0810 - 4L </td><td></td></tr><tr><td> 나트륨 dodecyl 황산 (SDS) </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> L - 4390 </td><td> 10 % 주식 솔루션을 만들고 압력솥하지, 사용하기 전에 1 주 최대 보관해야합니다 </td></tr><tr><td> Ethylenediaminetetraacetic 산성 (EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)) </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> E9884 </td><td> 산도 8.0 압력솥 조정 0.5 M 솔루션을 확인하십시오 </td></tr><tr><td> N - (3 - 디메틸 아미노) - N &#39;- ethylcarbodiimide 하이드로 클로라이드 (EDAC) </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> E7750 </td><td> 3.2 g의 EDAC 18 ML Millipore 물을 이용하여 사용하기 직전 20 ML 16 % 용액을 만들어 </td></tr><tr><td> BiodyneC 0.45 μm의 나일론 막 20x20 cm </td><td> 팔 생명 과학 </td><td> 74480C </td><td></td></tr><tr><td> Deionised, 정화 물 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 액체 Pyroneg 세제 </td><td> 존슨 다이버시 </td><td> HH12291 </td><td></td></tr><tr><td> Streptavidin - 퍼옥시데이즈의 공액 </td><td> 로체 </td><td> 11 089 153 001 </td><td></td></tr><tr><td> 아머샴 ECL 검출 시약 </td><td> GE 헬스케어 </td><td> RPN2105 </td><td></td></tr><tr><td> 아머샴 ECL 검출 시약 </td><td> GE 헬스케어 </td><td> RPN2105 </td><td></td></tr><tr><td> OHP 투명 필름 </td><td> 기업 익스프레스 </td><td> EXP 504 OHP </td><td></td></tr><tr><td> 아머샴 hyperfilm ECL 고성능 chemiluminescent 필름 18x24 cm의 </td><td> GE 헬스케어 </td><td> 28906837 </td><td></td></tr><tr><td> 얼음 </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> mPCR / RLB 분석에 사용되는 표 1. 소모품. <table border="1"><tbody><tr><th> 장비 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 </th></tr><tr><td> Hybaid Shake&#39;n&#39;Stack 오븐즈 (2) 압연 병 나일론 메쉬 분리 </td><td> 써모 과학 </td><td> HBSNSRS220 </td><td> 방법은 42 솔루션을 유지하기위한 시설이있는만큼 단일 오븐과 함께 수행할 수 있습니다 ° C 60 ° C 사용하기 전에 </td></tr><tr><td> 벨리 댄서 락을 플랫폼 </td><td> 스토벌 생명 과학 </td><td> 유로 BDbo </td><td></td></tr><tr><td> Miniblotter </td><td> Immunetics </td><td> MN100 - 45 </td><td></td></tr><tr><td> 열탕 목욕 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 흡입관 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 핫 플레이트 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 노출 카트리지 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> Z36 ,009 - 0 </td><td></td></tr><tr><td> X - 선 필름 개발자 </td><td></td><td></td><td> 또한 어두운 방에 대신 자동화의 트레이에있는 개발자, 해결사과 물을 사용할 수개발자. Lumino - 영상기는 Xray 필름 대신 사용할 수 있습니다 </td></tr></tbody></table> 표 2. 장비 mPCR / RLB 분석을 위해 필요합니다.

multiplex pcr and reverse line blot hybridization assay (mpcr/rlb)

멀티 플렉스 PCR / 역방향 라인 얼룩 하이브리드화 분석을 다시 사용할 수있는 나일론 막에 프로브 하이브 리다이 제이션 다음 한 멀티 플렉스 PCR 반응을 사용하여 43 샘플 43 분자 타겟까지 검색하실 수 있습니다. 프로브는 세포막에 고정을 허용하도록 수정 5 &#39;아민 있습니다. Primers은 streptavidin - 퍼옥시데이즈 및 감광성의 영화를 통해 chemiluminescent 기판을 사용하여 hybridized PCR 제품의 검출을 허용 5 &#39;비오틴 수정됩니다. 낮은 설치 및 소모품 비용이 기술은 저렴 (약 미국 2달러 샘플 당), 높은 처리량 (여러 세포막을 동시에 처리할 수)과 짧은 처리 시간 (약 10 시간)입니다. 기술은 여러 가지 방법으로 활용하실 수 있습니다. 여러 프로브는 단일 증폭 제품 내에 순서 변화를 감지하기위한 수 또는 여러 개의 제품은 후속 검색에 사용 하나 (혹은 이상) 프로브로 동시에 증폭하실 수 있습니다. 두 방법의 조합은 하나의 분석 시간에도 사용할 수 있습니다. 단일 대상 시퀀스에 대해 여러 프로브를 포함하는 능력은 분석은 매우 구체적인 수 있습니다. mPCR / RLB의 게시 응용 프로그램 methicillin - 내성 포도상 구균 3-5과 살모넬라균 SP 6, 연쇄상 구균 pneumoniae 7,8, 연쇄상 구균 agalactiae 9 enteroviruses 10,11, 신분의 분자 serotyping의 타이핑, 항생제 저항 유전자의 1,2의 탐지를 포함 Mycobacterium SP 12, 생식기 및 호흡기 13-15 16 기타 17 병원체 및 감지 및 mollicutes 18 신분의 감지. 그러나, 기술의 융통성은 응용 프로그램이 거의 무한하고 미생물의 분자 분석에 국한되지 않습니다 것을 의미합니다. mPCR / RLB에서 5 단계) 프리머 및 프로브 디자인, B) DNA 추출 및 PCR 증폭 C) 막의 작성, D) 하이브 리다이 제이션 및 감지되며, 분리막의 E) 리제.

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Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay mPCR/RLB

43 분자 타겟까지 동시 검출을위한 저렴, 높은 처리량 방법을 설명합니다. mPCR / RLB의 응용은 미생물 입력 및 임상 샘플에서 여러 병원균의 감지를 포함합니다.

멀티 플렉스 PCR 및 역방향 라인 얼룩 하이브리드화 분석 (mPCR / RLB)

Multiplex PCR/Reverse Line Blot Hybridization assay allows the detection of up to 43 molecular targets in 43 samples using one multiplex PCR reaction ...

multiplex-pcr-and-reverse-line-blot-hybridization-assay-mpcrrlb

Research

JoVE Journal

Biology

Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay (mPCR/RLB)

43.3K 조회수.  University of Sydney. 43 분자 타겟까지 동시 검출을위한 저렴, 높은 처리량 방법을 설명합니다. mPCR / RLB의 응용은 미생물 입력 및 임상 샘플에서 여러 병원균의 감지를 포함합니다.

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Cellular Toxicity of Nanogenomedicine in MCF-7 Cell Line: MTT assay

Cytotoxicity of the futuristic nanogenomedicine (e.g., short interfering RNA and antisense) may hamper its clinical development. Of these, the gene-based medicine and/or its carrier may elicit cellular toxicity. For assessment of such cytotoxicity, a common methodology is largely dependent upon utilization of the 3-(4, 5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2, 5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay which has been widely used as a colorimetric approach based on the activity of mitochondrial dehydrogenase enzymes in cells. In this current investigation, MCF-7 cells were inoculated in 96-well plate and at 50% confluency they were treated with different nanopolyplexes and subjected to MTT assay after 24 hours. Water soluble yellow MTT is metabolized by the metabolically active cells to the water insoluble purple formazan, which is further dissolved in dimethylsulfoxide and Sornson s buffer pH 10.5. The resultant product can be quantified by spectrophotometry using a plate reader at 570 nm.

The MTT assay is an easy and reproducible colorimetric assay for evaluation of cell viability based on reduction of yellow MTT and production of water insoluble purple formazan. Here, the viability of MCF-7 cells upon treatment of nanogenomedicine has been evaluated.

MCF - 7 세포주에서 세포 독성 Nanogenomedicine의 : MTT 분석

Cytotoxicity of the futuristic nanogenomedicine (e.g., short interfering RNA and antisense) may hamper its clinical development. Of these, the gene-based ...

연구

생물학

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and accuracy of the assay. These primer/probe sets are pre-designed to &gt;98% of the human and mouse genomes and feature significant improvements from previously available technologies. These improvements were made possible by virtue of a novel design algorithm, developed by Thermo Scientific bioinformatics experts.
Several convenient features have been incorporated into the Solaris qPCR Assay to streamline the process of performing quantitative real-time PCR. First, the protocol is similar to commonly employed alternatives, so the methods used during qPCR are likely to be familiar. Second, the master mix is blue, which makes setting the qPCR reactions easier to track. Third, the thermal cycling conditions are the same for all assays (genes), making it possible to run many samples at a time and reducing the potential for error. Finally, the probe and primer sequence information are provided, simplifying the publication process.
Here, we demonstrate how to obtain the appropriate Solaris reagents using the GENEius product search feature found on the ordering web site (www.thermo.com/solaris) and how to use the Solaris reagents for performing qPCR using the standard curve method.

The Solaris qPCR Gene Expression Assays are novel pre-designed qPCR primer/probe combinations designed to simplify the qPCR process without sacrificing the specificity and robustness of the assay.

써모 과학 솔라리스 qPCR 어세를 사용하여 정량 실시간 PCR

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

DNA Microarrays: Sample Quality Control, Array Hybridization and Scanning

Microarray expression profiling of the nervous system provides a powerful approach to identifying gene activities in different stages of development, different physiological or pathological states, response to therapy, and, in general, any condition that is being experimentally tested1. Expression profiling of neural tissues requires isolation of high quality RNA, amplification of the isolated RNA and hybridization to DNA microarrays. In this article we describe protocols for reproducible microarray experiments from brain tumor tissue2. We will start by performing a quality control analysis of isolated RNA samples with Agilent's 2100 Bioanalyzer "lab-on-a-chip" technology. High quality RNA samples are critical for the success of any microarray experiment, and the 2100 Bioanalyzer provides a quick, quantitative measurement of the sample quality. RNA samples are then amplified and labeled by performing reverse transcription to obtain cDNA, followed by in vitro transcription in the presence of labeled nucleotides to produce labeled cRNA. By using a dual-color labeling kit, we will label our experimental sample with Cy3 and a reference sample with Cy5. Both samples will then be combined and hybridized to Agilent's 4x44 K arrays. Dual-color arrays offer the advantage of a direct comparison between two RNA samples, thereby increasing the accuracy of the measurements, in particular for small changes in expression levels, because the two RNA samples are hybridized competitively to a single microarray. The arrays will be scanned at the two corresponding wavelengths, and the ratio of Cy3 to Cy5 signal for each feature will be used as a direct measurement of the relative abundance of the corresponding mRNA. This analysis identifies genes that are differentially expressed in response to the experimental conditions being tested.

We demonstrate the use of DNA microarrays for expression profiling of the nervous system. We describe RNA quality control, sample labeling, and array hybridization and scanning.

의 DNA Microarrays : 샘플 품질 제어, 배열 하이브 리다이 제이션 및 스캔

Microarray expression profiling of the nervous system provides a powerful approach to identifying gene activities in different stages of development, ...

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life science research and clinical diagnostics. However, ELISA has limitations. It is typically performed in a 96-well microplate, and the wells are coated with capture antibody, requiring a relatively large amount of sample to capture an antigen of interest . The large surface area of the wells and the hydrophobic binding of capture antibody can also lead to non-specific binding and increased background. Additionally, most ELISAs rely upon enzyme-mediated amplification of signal in order to achieve reasonable sensitivity. Such amplification is not always linear and can thus skew results.
In the past 15 years, a new technology has emerged that offers the benefits of the ELISA, but also enables higher throughput, increased flexibility, reduced sample volume, and lower cost, with a similar workflow 1, 2. Luminex xMAP Technology is a microsphere (bead) array platform enabling both monoplex and multiplex assays that can be applied to both protein and nucleic acid applications 3-5. The beads have the capture antibody covalently immobilized on a smaller surface area, requiring less capture antibody and smaller sample volumes, compared to ELISA, and non-specific binding is significantly reduced. Smaller sample volumes are important when working with limiting samples such as cerebrospinal fluid, synovial fluid, etc. 6. Multiplexing the assay further reduces sample volume requirements, enabling multiple results from a single sample.
Recent improvements by Luminex include: the new MAGPIX system, a smaller, less expensive, easier-to-use analyzer; Low-Concentration Magnetic MagPlex Microspheres which eliminate the need for expensive filter plates and come in a working concentration better suited for assay development and low-throughput applications; and the xMAP Antibody Coupling (AbC) Kit, which includes a protocol, reagents, and consumables necessary for coupling beads to the capture antibody of interest. (See Materials section for a detailed list of kit contents.)
In this experiment, we convert a pre-optimized ELISA assay for TNF-alpha cytokine to the xMAP platform and compare the performance of the two methods 7-11. TNF-alpha is a biomarker used in the measurement of inflammatory responses in patients with autoimmune disorders.
We begin by coupling four candidate capture antibodies to four different microsphere sets or regions. When mixed together, these four sets allow for the simultaneous testing of all four candidates with four separate detection antibodies to determine the best antibody pair, saving reagents, sample and time. Two xMAP assays are then constructed with the two most optimal antibody pairs and their performance is compared to that of the original ELISA assay in regards to signal strength, dynamic range, and sensitivity.

An ELISA can be easily converted to a Luminex xMAP assay and, through the benefits of multiplexing, several antibodies can be screened simultaneously to identify an optimum antibody pair, resulting in increased sensitivity and dynamic range, while reducing assay cost.

멀티 플렉스 항체 검사 방법을 사용하여 Luminex xMAP 분석에 캡처 엘리사의 전환

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

An Assay for Lateral Line Regeneration in Adult Zebrafish

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line development and regeneration. The zebrafish is particularly attractive for such studies because of its rapid development time and its high regenerative capacity. To date, zebrafish studies of lateral line regeneration have mainly utilized fish of the embryonic and larval stages because of the lower number of neuromasts at these stages. This has made quantitative analysis of lateral line regeneration/and or development easier in the earlier developmental stages. Because many zebrafish models of neurological and non-neurological diseases are studied in the adult fish and not in the embryo/larvae, we focused on developing a quantitative lateral line regenerative assay in adult zebrafish so that an assay was available that could be applied to current adult zebrafish disease models. Building on previous studies by Van Trump et al.17&#160;that described procedures for ablation of hair cells in adult Mexican blind cave fish and zebrafish (Danio rerio), our assay was designed to allow quantitative comparison between control and experimental groups. This was accomplished by developing a regenerative neuromast standard curve based on the percent of neuromast reappearance over a 24 hr time period following gentamicin-induced necrosis of hair cells in a defined region of the lateral line. The assay was also designed to allow extension of the analysis to the individual hair cell level when a higher level of resolution is required.

Because many zebrafish models of neurological and non-neurological diseases are studied in the adult fish rather than the embryo/larvae, we developed a quantitative lateral line regenerative assay that can be applied to adult zebrafish disease models. The assay involved resolution at the 1) neuromast and 2) individual hair cell levels.

성인 Zebrafish의의 측면 라인 재생을위한 분석

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line ...

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular biology has been greatly fueled by the discovery of noncoding RNAs as major players in post-transcriptional regulation. Such a revolutionary perspective has been accompanied and triggered by the development of powerful technologies for profiling short RNAs expression, both at the high-throughput level (genome-wide identification) or as single-candidate analysis (steady state accumulation of specific species). Although several state-of-art strategies are currently available for dosing or visualizing such fleeing molecules, Northern Blot assay remains the eligible approach in molecular biology for immediate and accurate evaluation of RNA expression. It represents a first step toward the application of more sophisticated, costly technologies and, in many cases, remains a preferential method to easily gain insights into RNA biology. Here we overview an efficient protocol (Enhanced Northern Blot) for detecting weakly expressed microRNAs (or other small regulatory RNA species) from Drosophila melanogaster whole embryos, manually dissected larval/adult tissues or in vitro cultured cells. A very limited amount of RNA is required and the use of material from flow cytometry-isolated cells can be also envisaged.

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

The aim of this publication is to visualize and discuss the operative steps of an Enhanced Northern Blot protocol on RNA extracted from Drosophila melanogaster embryos, cells, and tissues. This protocol is particularly useful for the efficient detection of small RNA species.

작은 RNA 종의 북부 오 탐지의 향상된<em&gt; 초파리 Melanogaster</em

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

qPCRTag 분석 - 높은 처리량, Sc2.0 유전형에 대한 실시간 PCR 분석

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

A Quantitative Dot Blot Assay for AAV Titration and Its Use for Functional Assessment of the Adeno-associated Virus Assembly-activating Proteins

While adeno-associated virus (AAV) is widely accepted as an attractive vector for gene therapy, it also serves as a model virus for understanding virus biology. In the latter respect, the recent discovery of a non-structural AAV protein, termed assembly-activating protein (AAP), has shed new light on the processes involved in assembly of the viral capsid VP proteins into a capsid. Although many AAV serotypes require AAP for assembly, we have recently reported that AAV4, 5, and 11 are exceptions to this rule. Furthermore, we demonstrated that AAPs and assembled capsids of different serotypes localize to different subcellular compartments. This unexpected heterogeneity in the biological properties and functional roles of AAPs among different AAV serotypes underscores the importance of studies on AAPs derived from diverse serotypes. This manuscript details a straightforward dot blot assay for AAV quantitation and its application to assess AAP dependency and serotype specificity in capsid assembly. To demonstrate the utility of this dot blot assay, we set out to characterize capsid assembly and AAP dependency of Snake AAV, a previously uncharacterized reptile AAV, as well as AAV5 and AAV9, which have previously been shown to be AAP-independent and AAP-dependent serotypes, respectively. The assay revealed that Snake AAV capsid assembly requires Snake AAP and cannot be promoted by AAPs from AAV5 and AAV9. The assay also showed that, unlike many of the common serotype AAPs that promote heterologous capsid assembly by cross-complementation, Snake AAP does not promote assembly of AAV9 capsids. In addition, we show that the choice of nuclease significantly affects the readout of the dot blot assay, and thus, choosing an optimal enzyme is critical for successful assessment of AAV titers.

This manuscript details a straightforward dot blot assay for quantitation of adeno-associated virus (AAV) titers and its application to study the role of assembly-activating proteins (AAPs), a novel class of non-structural viral proteins found in all AAV serotypes, in promoting the assembly of capsids derived from cognate and heterologous AAV serotypes.

AAV 적정 및 Adeno 관련 바이러스 어셈블리 활성화의 기능 평가 대 한 그것의 사용에 대 한 양적 점 오 점 분석 결과 단백질

While adeno-associated virus (AAV) is widely accepted as an attractive vector for gene therapy, it also serves as a model virus for understanding virus ...

Absolute Quantification of Plasma MicroRNA Levels in Cynomolgus Monkeys, Using Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR

RT-qPCR is one of the most common methods to assess individual target miRNAs. MiRNAs levels are generally measured relative to a reference sample. This approach is appropriate for examining physiological changes in target gene expression levels. However, absolute quantification using better statistical analysis is preferable for a comprehensive assessment of gene expression levels. Absolute quantification is still not in common use. This report describes a protocol for measuring the absolute levels of plasma miRNA, using RT-qPCR with or without pre-amplification.
A fixed volume (200 &#181;L) of EDTA-plasma was prepared from the blood collected from the femoral vein of conscious cynomolgus monkeys (n = 50). Total RNA was extracted using commercially available system. Plasma miRNAs were quantified by probe-based RT-qPCR assays which contains miRNA-specific forward/reverse PCR primer and probe. Standard curves for absolute quantification were generated using commercially available synthetic RNA oligonucleotides. A synthetic cel-miR-238 was used as an external control for normalization and quality assessment. The miRNAs that showed quantification cycle (Cq) values above 35 were pre-amplified prior to the qPCR step.
Among the 8 miRNAs examined, miR-122, miR-133a, and miR-192 were detectable without pre-amplification, whereas miR-1, miR-206, and miR-499a required pre-amplification because of their low expression levels. MiR-208a and miR-208b were not detectable even after pre-amplification. Sample processing efficiency was evaluated by the Cq values of the spiked cel-miR-238. In this assay method, technical variation was estimated to be less than 3-fold and the lower limit of quantification (LLOQ) was 102 copy/&#181;L, for most of the examined miRNAs.
This protocol provides a better estimate of the quantity of plasma miRNAs, and allows quality assessment of corresponding data from different studies. Considering the low number of miRNAs in body fluids, pre-amplification is useful to enhance detection of poorly expressed miRNAs.

This report describes a protocol for measuring the absolute levels of plasma miRNA, using quantitative real-time reverse transcription PCR with or without pre-amplification. This protocol affords better understanding of the quantity of plasma miRNAs and allows qualitative assessment of corresponding data from different studies or laboratories.

Cynomolgus 원숭이, 양적 실시간 반전 녹음 방송 PCR를 사용 하 여 플라즈마 예측에 관한 레벨의 절대 정량화

RT-qPCR is one of the most common methods to assess individual target miRNAs. MiRNAs levels are generally measured relative to a reference sample. This ...

Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay

Because precision medicine is highly dependent on the accurate detection of biomarkers, there is an increasing need for standardized and robust technologies that measure RNA biomarkers in situ in clinical specimens. While grind-and-bind assays like RNAseq and quantitative RT-PCR enable highly sensitive gene expression measurements, they also require RNA extraction and thus prevent valuable expression analysis within the morphological tissue context. The in situ hybridization (ISH) assay described here can detect RNA target sequences as short as 50 nucleotides at single-nucleotide resolution and at the single-cell level. This assay is complementary to the previously developed commercial assay and enables sensitive and specific in situ detection of splice variants, short targets, and point mutations within the tissue. In this protocol, probes were designed to target unique exon junctions for two clinically important splice variants, EGFRvIII and MET&#916;14. The detection of short target sequences was demonstrated by the specific detection of CDR3 sequences of T-cell receptors &#945; and &#946; in the Jurkat T-cell line. Also shown is the utility of this ISH assay for the distinction of RNA target sequences at single-nucleotide resolution (point mutations) through the visualization of EGFR L858R and KRAS G12A single-nucleotide variations in cell lines using automated staining platforms. In summary, the protocol shows a specialized RNA ISH assay that enables the detection of splice variants, short sequences, and mutations in situ for manual performance and on automated stainers.

Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay

Here, we describe an in situ hybridization assay which enables sensitive and specific detection of sequences as short as 50 nucleotides with single-nucleotide resolution at the single-cell level. The assay, which can be performed manually or automatically, can enable visualization of splice variants, short sequences, and mutations within the tissue context.