1. 써모 과학 솔라리스 qPCR 분석 설계 알고리즘 <ol><li> 솔라리스 qPCR 프로브 / 프라이머 쌍 설계에 사용되는 알고리즘은이를 보편적인 사이클링 조건을 사용 각 구성 요소의 TM을 조정합니다. MGB의 결합, 또는 사소한 홈 바인딩, 탐사선의 잔기가 TM을 증가하고 큰 분석 유연성과 성능을 위해 설계되고 짧은 프로브를 허용합니다. 그들의 이름에서 알 수 있듯이, MGBs는 DNA의 나선형의 작은 홈에 끼워 넣을 수 항생제의 수업입니다. MGBs는 DNA 프로브의 3 또는 5 끝에 붙어 있습니다. 솔루션에서 프로브의 식구들 기자의 형광은 이클립스 다크 끄는로 침묵이다. 탐사선이 대상 시퀀스에 바인딩하면 프로브의 3 - D 형태의 결과 변화는 강한 형광 신호를 수 있습니다. 대상 순서로 DNA 프로브의 바인딩은 PCR에 적합한 용융 온도를 유지하는 동시에 매우 구체적이고 짧은 프로브의 사용을 허용하는 MGB에 의해 안정화됩니다. 따라서, 신호 감지 대상 증폭의 어닐링 단계에서 발생합니다. 확장 단계 동안, MGB 프로브 disassociates 및 형광 다시 침묵합니다. 탐사선이 disassociates 때문에 PCR의 효율에 영향을주지 않습니다. </li><li> 솔라리스 알고리즘의 또 다른 특징은 Superbases를 사용하는 것입니다. Superbases는 채권 AT의 안정성을 개선하고 GG 구아닌 풍부한 시퀀스에서 자체 연결을 제거하는 바인딩 능력을 강화해야 기지를 수정하고 있습니다. 또한, 그들은 5 종착역에 연결된 인접 fluorophores를 끄지 마십시오. 이러한 기반은 선택 대상 시퀀스의 가용성을 확장하는 알고리즘에 따라 배치됩니다. 이렇게하면 별도 primers와 프로브를 설계 피해야 될 같은 GC 풍부한 지역으로 시퀀스를 사용 수 있습니다. </li><li> 가능하면 솔라리스 알고리즘은 대상 사이트의 엑손 접합부까지의 영역을 포함합니다. 이것은 오염 물질의 게놈 DNA의 증폭을 피하고하여 특이성을 증가시킵니다. </li><li> 중요한 알고리즘은 또한이 단일 프로브 / 프라이머 세트에 포함되는 등 알려진 모든 변종 스플 라이스에 대한 합의 순서를 식별합니다. 그래서, 하나의 분석은 관심의 특정 유전자를 위해 필요합니다. </li><li> 마지막으로, 솔라리스 qPCR 분석 설계 알고리즘은 GC 콘텐츠, 길이, TM, 그리고 동질적인 세포핵의 펼쳐진 포함하여 중요한 설계 고려 사항에 대해 매우 엄격한 매개 변수를 사용합니다. 게놈, 성적 증명서, 그리고 pseudogene : 결과 시퀀스는 3 개의 데이터베이스를 사용하는 특이성에 대한 분석 BLAST 있습니다. </li></ol> 2. 솔라리스 시약 구하기 <ol><li> 해당 솔라리스 시약을 얻으려면 다음 사이트를 방문 <a href="http://dharmacon.com">www.thermo.com / 솔라리스</a> </li><li> 일단 웹사이트에서 &quot;GENEius 제품 검색&quot;을 클릭합니다. GENEius 제품 검색로 바로 이동하려면 이동 <a href="http://www.dharmacon.com/catalogsearch/consolidatedsearch.aspx">www.thermo.com / SolarisSearch</a> </li><li> 검색 메세지 상자를 클릭하고 해당 대상 생물을 선택합니다. </li><li> GENEius 제품 검색은 다양한 유전자 식별자를 처리할 수 있습니다. 여기, 심판 Seq 가입, 유전자 ID, 진 심볼, 유전자 설명, 생거 ID 또는 가입 번호 또는 카탈로그 번호 등 관심의 유전자를 찾기 위해 제안된 검색어 중 하나를 입력합니다. 그런 다음, &quot;검색&quot;을 클릭하십시오. </li><li> 관심있는 유전자를 확인하고 왼쪽에있는 &#39;선택&#39;을 클릭하십시오. 이것은 관심의 유전자에 사용할 수있는 다양한 써모 과학 제품을 보여주는 창이 열립니다. &quot;제품&quot;아래에있는 &quot;qPCR 감지&quot;탭을 선택합니다. </li><li> 제목은 &quot;솔라리스 유전자 발현 분석&quot;에서, 당신은 하나가 최적 솔라리스 프로브 / 프라이머 분석 설계 볼 수 있습니다. 이 분석은 유전자 타겟의 모든 알려진 스플 라이스 변종을 커버합니다. 원하는 수량을 선택합니다. 그들은 100, 200, 400에서 사용할 수 있으며, 1,000 X 25 μl 반응 (분석이 만들어 주문으로 확인된 경우, 100 팩 크기는 사용할 수 없습니다.) &quot;장바구니에 추가 &#39;를 클릭하십시오. </li><li> 다음 사용될 것입니다 열 자전거 타는 사람에 해당하는 마스터 믹스를 선택합니다. 마스터 믹스가 사용할 수있는 기계와 최고의 작품할지 결정하려면 클릭하십시오 &#39;마스터 믹스가 PCR의 자전거 타는 사람과 가장 적합한 알아보십시오! &quot; </li><li> 사용하는 혼합 결정하기 위해 메뉴에서 사용됩니다 qPCR의 자전거 타는 사람을 찾습니다. </li><li> GENEius 제품 검색 창으로 돌아가기하고, 적절한 마스터 믹스를 선택합니다. 마스터 믹스 100, 200, 400, 1000 반응 사이즈된다. &quot;장바구니에 추가&quot;를 클릭하세요. </li><li> 제안 참조 유전자와 뒷면 cDNA 합성 키트는 또한 완전한 qRT - PCR 분석을 위해 주문하실 수 있습니다. </li><li> 솔라리스 qPCR의 시약이 도착하면, 사용할 준비가 때까지 -20 ° C에 그들을 저장할 수 있습니다. 다음 시약이 접수되어야합니다 : 800 200 NM NM, sequ에서 제공 각각 하나의 유전자 특정 프로브에서 제공이 primers을 포함 20X 솔루션을프로브 및 primers, 그리고 배 농도에서 솔라리스 qPCR의 유전자 발현 마스터 믹스 모두에 대한 정보를 줬어. 솔라리스 qPCR 진 표현 Assays은 12 개월의 최소 안정됩니다. 반복 동결은 해동하지 마십시오. </li></ol> 3. qPCR 설정 <ol><li> cDNA와 qPCR 프로토콜을 시작합니다. 총 RNA는 스핀 열 방법을 사용하여 추출해야합니다. 써모 과학 뒷면 cDNA 합성 키트 cDNA를 생성하기 위해 역방향 전송을 권장합니다. </li><li> primers, 프로브, 그리고 얼음 마스터 믹스를 해동하여 qPCR 준비. 또한 손으로에서 PCR 등급 물과 실시간 PCR의 감도를 향상시킬 수 있습니다 불투명 흰색 qPCR 접시를합니다. </li><li> 1) 온습 시작의 DNA 중합 효소, DNA Thermoprime 효소의 핫 시작 버전 : 마스터 혼합을 포함한 실시간 PCR에 대한 모든 구성 요소가 포함되어 있습니다. 효소의이 유형은 최대 반응 설정된 기간 동안 불특정 증폭을 방지하기 위해 사용하고 95에서 활성화 단계 ° C 15 분 필요합니다. 2) 솔라리스 마스터 믹스의 dNTPs는 dTTP는 솔라리스 입문서 / 프로브 assays와 함께 작동하도록 최적화된 독점적 반응 버퍼 증폭 효율 3), 최대화하기 위해 dUTP 대체합니다. 이 반응 버퍼 시약 및 플라스틱 사이의 대비를 증가 파란색 염료가 포함되어 있습니다. 4) ROX하여 qPCR 기기가 필요한 경우 ROX. </li><li> 솔루션 해동 후에는 튜브를 (와동하지 않음) flicking하여 섞는다. 시약의 손실을 방지하기 위해 그들을 스핀. </li><li> 다음 샘플의 숫자에 따라 스케일링을 관심의 유전자, 플러스 참조 유전자 하나에 대한 반응 믹스를 설정하는 15 ML 살균 팰컨 튜브를 준비합니다. 세 표준 곡선 방법은 분석에 사용되는 경우 템플릿 컨트롤 (NTC)와 표준 곡선 샘플도를 포함하지, 각 샘플을 준비할 수 복제 등 충분히 준비합니다. </li><li> 96 잘 접시에 실행하는 각 샘플은 다음을 혼합 : 2X 솔라리스 qPCR 마스터 믹스 5 μL, 솔라리스 프리머 / 프로브 세트 (20X)의 0.5 μl, 그리고 PCR 학년 물을 같은 것을 최종 반응 부피 한번 cDNA 25 μL 것입 추가됩니다. 384 잘 접시에 실행하는 각 샘플에 대해 다음을 혼합 : 2X 솔라리스 qPCR 마스터 믹스의 12.5 μL, 솔라리스 프리머 / 프로브 세트 (20X)의 1.25 μl, 그리고 PCR 학년 물을 최종 반응 부피, 한 번 cDNA 것을 추가은 10 μL 것입니다. </li><li> 멀티 채널 pipettor 사용하여 접시의 적절한 우물에 마스터 믹스를 전송할 수 있습니다. 마스터 믹스에 포함된 파란색 염료가 하얀 접시에 추적 pipetting 진행에 도움이됩니다. 그런 다음, 1-5 μL cDNA 템플릿 (96 잘 플레이트의 경우) 또는 cDNA 템플릿 1-2 μL를 (384 자 접시) 추가합니다. 믹스로 최대 피펫합니다. 원심 분리기에 접시를 놓고 이들은 형광 신호 방해하므로 모든 거품을 제거하는 스핀 다운. </li><li> 프로그램 열 자전거 타는 사람 : 효소가 함께 활성화되어 있어야합니다 95 ° C 15 분 (1 사이클). 그렇다면 95의 40주기 ° C, 15 초 동안 변성 및 소둔 및 60 ° C 확장 60 초 동안. </li><li> qPCR 장비에서 접시를 놓습니다. 프로그램을 시작합니다. </li></ol> 솔라리스를 사용하는 대표 qPCR 결과 <img src="/files/ftp_upload/1700/1700fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. PCR 효율과 R2의 값을 기준으로 판단으로 솔라리스 assays, 심지어 매우 낮은 입력 농도에서 안정적인 검색을 제공합니다. 합성 RNA의 amplicon 시퀀스 또는 DNA의 amplicon 시퀀스에서 합성된 cDNA의 열 10 배 dilutions는 각각 F2RL1 또는 CDC20에 대한 솔라리스 qPCR의 유전자 발현 분석을 사용하여 ABI 7900HT 악기에서 증폭되었다. 로그 스케일 증폭 곡선 및 표준 곡선은 효율성, R2 값, 10 log10 dilutions 밖으로 동적 범위 및 검출의 하한선을 포함하여 각 분석의 성능과 함께 표시됩니다. <img src="/files/ftp_upload/1700/1700fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. 솔라리스 Assays도 다른 연구자 및 연구소 간의 일관성있는 결과를 제공합니다. ALDOA 및 PPIB뿐만​​ 아니라 비 타겟팅 제어 (NTC)를 대상으로 s​​iRNAs는, 100, 10, 1, 0.1 nm의 최종 농도에서 헬라 세포로 transfected했다. 세포 수확 및 총 RNA는 48 시간 후 치료를 격리했다. cDNA는 써모 과학 뒷면 cDNA 합성 키트를 사용하여 합성되었다. cDNA의 나누어지는은 로체 LightCycler 480 (384 자) 플랫폼에서 ALDOA, PPIB, 그리고 GAPDH의 검출을위한 솔라리스 qPCR 진 표현 Assays를 사용하여 두 지리적으로 분리된 실험실에서 증폭되었다. 최저는 ΔΔCq 방법 (GAPDH 참조 유전자와 NTC - 처리 세포 정상화)를 사용하여 계산되었다. 최저의 동일한 수준이 두 사이트에서 두 연구자 사이의 유전자 목표를 모두 증명되었다.

이 문서의 저자는 써모 과학의 직원입니다.

써모 과학 솔라리스 qPCR의 Assays는 qPCR 분석을 수행하기위한 간단하고 향상된 방법을 제공합니다. MGB 기술과 Superbases을 도입, 높은 엄중 알고리즘을 사용하여 이러한 프라이머 및 프로브 세트 qPCR 실험의 충실도 및 견고성이 극대화할 수 있습니다. 하나 프라이머 및 프로브 집합은 주어진 유전자의 모든 알려진 스플 라이스 변종을 인식합니다. 대상 사이트는 가능한 그 게놈 DNA가 증폭되지 않도록하기 위해 엑슨 걸치는 지역을 포함합니다. 이러한 기능은 가능한 크게 복잡한 실험을 수행하기 위해 필요한 시간을 줄이는 동시에 여러 샘플을 실행합니다. 마스터 혼합은 파란색 때문에 pipetting 추적을 잃지 않고, qPCR의 감도를 향상 백색 불투명 접시를 사용할 수 있습니다. 모두 합쳐 놓으면, 솔라리스 qPCR 분석의 설계 기능이 소설 qPCR 분석 구체적이고 강력한 모두있는 고성능 아직 단순하고 분석합니다.

quantitative real-time pcr using the thermo scientific solaris qpcr assay

솔라리스 qPCR의 유전자 발현 분석은 분석의 감도와 정확성을 유지하면서 qPCR 프로세스를 단순화하도록 설계된 프라이머 / 프로브 집합의 소설 형식입니다. 이러한 프라이머 / 프로브 세트는 이전에 다음 ID로 사용 가능한 기술에서 인간과 마우스 genomes과 기능 크게 향상&gt; 98% 사전 설계되었습니다. 이러한 개선은 써모 과학 생물 정보학 전문가에 의해 개발된 새로운 설계 알고리즘의 미덕으로 가능하게되었다. 몇 가지 편리한 기능이 양적 실시간 PCR을 수행하는 과정을 간소화하기 위해 솔라리스 qPCR 분석에 통합되었습니다. 첫째, 프로토콜은 일반적으로 고용 대안과 유사하므로 qPCR하는 동안 사용되는 방법은 알고 있어야 할 것 같다. 둘째, 마스터 믹스 트랙에 qPCR 반응을 쉽게 설정하게하는 파란색입니다. 셋째, 열 사이클링 조건은 가능한 한 번에 많은 샘플을 실행 만들고 오류의 가능성을 감소 (유전자) 모든 assays에 대해 동일합니다. 마지막으로, 프로브 및 프라이머 서열 정보는 출판 프로세스를 단순화 제공됩니다. 여기, 우리는 주문 웹 사이트 (www.thermo.com / 솔라리스)와 어떻게 표준 곡선 방법을 사용하여 qPCR을 수행하기위한 솔라리스 시약을 사용하여 발견 GENEius 제품 검색 기능을 사용하여 적절한 솔라리스 시약을 얻는 방법을 보여줍니다.

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Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

솔라리스 qPCR 진 표현 Assays은 분석의 특이성과 견고을 희생하지 않고 qPCR 프로세스를 단순화하기위한 새로운 사전 설계 qPCR 뇌관 / 프로브 조합입니다.

써모 과학 솔라리스 qPCR 어세를 사용하여 정량 실시간 PCR

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

quantitative-real-time-pcr-using-thermo-scientific-solaris-qpcr

Research

JoVE Journal

Biology

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비디오: Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often used for protein analysis. The Thermo Scientific NanoDrop 2000c Spectrophotometer solves this issue with an innovative sample retention system that holds microvolume samples between two measurement surfaces using the surface tension properties of liquids, enabling the quantification of samples in volumes as low as 0.5-2 &mu;L. The elimination of cuvettes or capillaries allows real time changes in path length, which reduces the measurement time while greatly increasing the dynamic range of protein concentrations that can be measured. The need for dilutions is also eliminated, and preparations for sample quantification are relatively easy as the measurement surfaces can be simply wiped with laboratory wipe. This video article presents modifications to traditional protein concentration determination methods for quantification of microvolume amounts of protein using A280 absorbance readings or the BCA colorimetric assay.

Microvolume samples are quantified by a spectrophotometer system that uses natural surface tension to retain samples without the use of cuvettes or capillaries. The dynamic range of protein concentrations and speed by which they can be measured are greatly increased with this method.

NanoDrop 2000c 분광을 사용 Microvolume 단백질 농도 결정

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

연구

생물학

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB continues to spread rapidly and attacks ash trees of different ages, from saplings to mature trees. However, to date very little or no molecular knowledge exists for EAB. We are interested in deciphering the molecular-based physiological processes at the tissue level that aid EAB in successful colonization of ash trees. In this report we show the effective use of quantitative real-time PCR (qRT-PCR) to ascertain mRNA levels in different larval tissues (including midgut, fat bodies and cuticle) and different developmental stages (including 1st-, 2nd-, 3rd-, 4th-instars, prepupae and adults) of EAB. As an example, a peritrophin gene (herein named, AP-PERI1) is exemplified as the gene of interest and a ribosomal protein (AP-RP1) as the internal control. Peritrophins are important components of the peritrophic membrane/matrix (PM), which is the lining of the insect gut. The PM has diverse functions including digestion and mechanical protection to the midgut epithelium.

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) is an effective tool to diagnose mRNA levels in different insect tissues and developmental stages. In this report we show the use of qRT-PCR to ascertain mRNA levels in different larval tissues and developmental stages of the invasive insect species, emerald ash borer.

에메랄드 애쉬 보러에서 유전자 발현 분석 ( Agrilus planipennis)를 사용하여 정량 리얼 타임 PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower detection limit compared to other methods of gene expression profiling while using smaller amounts of input for each assay.  Automated qPCR setup has improved this field by allowing for greater reproducibility.  Its convenient and rapid setup allows for high-throughput experiments, enabling the profiling of many different genes simultaneously in each experiment.  This method along with internal plate controls also reduces experimental variables common to other techniques.  
We recently developed a qPCR assay for profiling of pre-microRNAs  (pre-miRNAs) using a set of 186 primer pairs.  MicroRNAs have emerged as a novel class of small, non-coding RNAs with the ability to regulate many mRNA targets at the post-transcriptional level.  These small RNAs are first transcribed by RNA polymerase II as a primary miRNA (pri-miRNA) transcript, which is then cleaved into the precursor miRNA (pre-miRNA).  Pre-miRNAs are exported to the cytoplasm where Dicer cleaves the hairpin loop to yield mature miRNAs.  Increases in miRNA levels can be observed at both the precursor and mature miRNA levels and profiling of both of these forms can be useful.  There are several commercially available assays for mature miRNAs; however, their high cost may deter researchers from this profiling technique.  Here, we discuss a cost-effective, reliable, SYBR-based qPCR method of profiling pre-miRNAs.  Changes in pre-miRNA levels often reflect mature miRNA changes and can be a useful indicator of mature miRNA expression.  However, simultaneous profiling of both pre-miRNAs and mature miRNAs may be optimal as they can contribute nonredundant information and provide insight into microRNA processing.  Furthermore, the technique described here can be expanded to encompass the profiling of other library sets for specific pathways or pathogens.

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

We will demonstrate the setup and analysis of pre-microRNA 96-well arrays for QPCR using a robot as well as by hand with a Thermo Scientific Matrix multichannel pipette.

정량 실시간 PCR (qPCR) 배열을 사용하여 사전 마이크로 RNAS과 microRNAs의 프로 파일링

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional cuvette-based instruments for nucleic acid quantitation for those that can perform microvolume quantitation.
The NanoDrop microvolume sample retention system (Thermo Scientific NanoDrop Products) functions by combining fiber optic technology and natural surface tension properties to capture and retain minute amounts of sample independent of traditional containment apparatus such as cuvettes or capillaries. Furthermore, the system employs shorter path lengths, which result in a broad range of nucleic acid concentration measurements, essentially eliminating the need to perform dilutions. Reducing the volume of sample required for spectroscopic analysis also facilitates the inclusion of additional quality control steps throughout many molecular workflows, increasing efficiency and ultimately leading to greater confidence in downstream results.
The need for high-sensitivity fluorescent analysis of limited mass has also emerged with recent experimental advances. Using the same microvolume sample retention technology, fluorescent measurements may be performed with 2 &mu;L of material, allowing fluorescent assays volume requirements to be significantly reduced. Such microreactions of 10 &mu;L or less are now possible using a dedicated microvolume fluorospectrometer.
Two microvolume nucleic acid quantitation protocols will be demonstrated that use integrated sample retention systems as practical alternatives to traditional cuvette-based protocols. First, a direct A260 absorbance method using a microvolume spectrophotometer is described. This is followed by a demonstration of a fluorescence-based method that enables reduced-volume fluorescence reactions with a microvolume fluorospectrometer. These novel techniques enable the assessment of nucleic acid concentrations ranging from 1 pg/ &mu;L to 15,000 ng/ &mu;L with minimal consumption of sample.

The use of NanoDrop microvolume systems as practical and efficient alternatives to traditional nucleic acid quantitation methodology is described through the demonstration of two microvolume nucleic acid quantitation protocols.

핵산의 NanoDrop Microvolume의 Quantitation

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, messages are carried by neurotransmitters released from presynaptic terminals and received by receptors on postsynaptic cells. Our previous research in Caenorhabditis elegans has shown that VSM-1 negatively regulates exocytosis. Additionally, analysis of synapses in vsm-1 mutants showed that animals lacking a fully functional VSM-1 have increased synaptic connectivity. Based on these preliminary findings, we hypothesized that C. elegans VSM-1 may play a crucial role in synaptogenesis. To test this hypothesis, double-labeled microarray analysis was performed, and gene expression profiles were determined. First, total RNA was isolated, reversely transcribed to cDNA, and hybridized to the DNA microarrays. Then, in-silico analysis of fluorescent probe hybridization revealed significant induction of many genes coding for members of the major sperm protein family (MSP) in mutants with enhanced synaptogenesis. MSPs are the major component of sperm in C. elegans and appear to signal nematode oocyte maturation and ovulation . In fruit flies, Chai and colleagues 1 demonstrated that MSP-like molecules regulate presynaptic bouton number and size at the neuromuscular junction. Moreover, analysis performed by Tsuda and coworkers 2 suggested that MSPs may act as ligands for Eph receptors and trigger receptor tyrosine kinase signaling cascades. Lastly, real time PCR analysis corroborated that the gene coding for MSP-32 is induced in vsm-1(ok1468) mutants. Taken together, research performed by our laboratory has shown that vsm-1 mutants have a significant increase in synaptic density, which could be mediated by MSP-32 signaling.

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray analysis was conducted to determine genetic expression profiles in C. elegans, and real-time PCR was used to validate and quantify microarray data.

의 유전자 표현 프로필 결정 C. 엘레간스 Microarray 및 실시간 PCR을 사용하여

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

Genotyping of Plant and Animal Samples without Prior DNA Purification

The Direct PCR approach facilitates PCR amplification directly from small amounts of unpurified samples, and is demonstrated here for several plant and animal tissues (Figure 1). Direct PCR is based on specially engineered Thermo Scientific Phusion and Phire DNA Polymerases, which include a double-stranded DNA binding domain that gives them unique properties such as high tolerance of inhibitors.
PCR-based target DNA detection has numerous applications in plant research, including plant genotype analysis and verification of transgenes. PCR from plant tissues traditionally involves an initial DNA isolation step, which may require expensive or toxic reagents. The process is time consuming and increases the risk of cross contamination1, 2. Conversely, by using Thermo Scientific Phire Plant Direct PCR Kit the target DNA can be easily detected, without prior DNA extraction. In the model demonstrated here, an example of derived cleaved amplified polymorphic sequence analysis (dCAPS)3,4 is performed directly from Arabidopsis plant leaves. dCAPS genotyping assays can be used to identify single nucleotide polymorphisms (SNPs) by SNP allele-specific restriction endonuclease digestion3. 
Some plant samples tend to be more challenging when using Direct PCR methods as they contain components that interfere with PCR, such as phenolic compounds. In these cases, an additional step to remove the compounds is traditionally required2,5. Here, this problem is overcome by using a quick and easy dilution protocol followed by Direct PCR amplification (Figure 1). Fifteen year-old oak leaves are used as a model for challenging plants as the specimen contains high amounts of phenolic compounds including tannins. 
Gene transfer into mice is broadly used to study the roles of genes in development, physiology and human disease. The use of these animals requires screening for the presence of the transgene, usually with PCR. Traditionally, this involves a time consuming DNA isolation step, during which DNA for PCR analysis is purified from ear, tail or toe tissues6,7. However, with the Thermo Scientific Phire Animal Tissue Direct PCR Kit transgenic mice can be genotyped without prior DNA purification. In this protocol transgenic mouse genotyping is achieved directly from mouse ear tissues, as demonstrated here for a challenging example where only one primer set is used for amplification of two fragments differing greatly in size.

The Direct PCR approach presented here facilitates PCR amplification directly from small amounts of unpurified plant and animal tissue.

이전 DNA의 정제없이 식물과 동물 샘플의 Genotyping

The Direct PCR approach facilitates PCR amplification directly from small amounts of unpurified samples, and is demonstrated here for several plant and ...

Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base excision repair (BER) molecular beacons. The substrate (beacon) is comprised of a deoxyoligonucleotide containing a single base lesion with a 6-Carboxyfluorescein (6-FAM) moiety conjugated to the 5'end and a Dabcyl moiety conjugated to the 3' end of the oligonucleotide. The BER molecular beacon is 43 bases in length and the sequence is designed to promote the formation of a stem-loop structure with 13 nucleotides in the loop and 15 base pairs in the stem1,2. When folded in this configuration the 6-FAM moiety is quenched by Dabcyl in a non-fluorescent manner via F&ouml;rster Resonance Energy Transfer (FRET)3,4. The lesion is positioned such that following base lesion removal and strand scission the remaining 5 base oligonucleotide containing the 6-FAM moiety is released from the stem. Release and detachment from the quencher (Dabcyl) results in an increase of fluorescence that is proportionate to the level of DNA repair. By collecting multiple reads of the fluorescence values, real-time assessment of BER activity is possible. The use of standard quantitative real-time PCR instruments allows the simultaneous analysis of numerous samples. The design of these BER molecular beacons, with a single base lesion, is amenable to kinetic analyses, BER quantification and inhibitor validation and is adaptable for quantification of DNA Repair activity in tissue and tumor cell lysates or with purified proteins. The analysis of BER activity in tumor lysates or tissue aspirates using these molecular beacons may be applicable to functional biomarker measurements. Further, the analysis of BER activity with purified proteins using this quantitative assay provides a rapid, high-throughput method for the discovery and validation of BER inhibitors.

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates. The assay yields rates of DNA Repair activity amenable to kinetic analysis and is adaptable for quantification of DNA Repair activity in tissue and tumor lysates or with purified proteins.

병변 특정 분자 비콘을 활용 세포 Lysates의 기본 절단 복구 활동의 양적, 실시간 분석

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed 'ligand') is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the 'analyte') is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method's high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods. 
SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter's cognate substrate binding protein).

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Surface Plasmon Resonance (SPR) is a label-free method for detecting bio-molecular interactions in real time. Herein, a protocol for a membrane protein:receptor interaction experiment is described, while discussing the pros and cons of the technique.

막 단백질의 실시간 측정 : 수용체 상호 작용은 표면 플라즈몬 공명 (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that provides an accurate and reproducible analysis. Probe-based chemistry offers the least background fluorescence as compared to other (dye-based) chemistries. Presently, there are several platforms available that use probe-based chemistry to quantitate transcript abundance. qPCR in a 96 well plate is the most routinely used method, however only a maximum of 96 samples or miRNAs can be tested in a single run. This is time-consuming and tedious if a large number of samples/miRNAs are to be analyzed. High-throughput probe-based platforms such as microfluidics (e.g. TaqMan Array Card) and nanofluidics arrays (e.g. OpenArray) offer ease to reproducibly and efficiently detect the abundance of multiple microRNAs in a large number of samples in a short time. Here, we demonstrate the experimental setup and protocol for miRNA quantitation from serum or plasma-EDTA samples, using probe-based chemistry and three different platforms (96 well plate, microfluidics and nanofluidics arrays) offering increasing levels of throughput.

Circulating microRNAs have recently emerged as promising and novel biomarkers for various cancers and other diseases. The goal of this article is to discuss three different probe-based real-time PCR platforms and methods that are available to quantify and determine the abundance of circulating microRNAs.

프로브 기반의 실시간 PCR은 마이크로 RNA의 정량 측정을위한 접근 방법

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

qPCRTag 분석 - 높은 처리량, Sc2.0 유전형에 대한 실시간 PCR 분석

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...