이 작품은 제임스 S. 맥도넬 재단 21 세기 수상 프로그램에서 ED 부여, 그리고 NIH 원장의 새로운 이노 수상에 의해 지원되었다. 수다는 재생 의학의 캘리포니아 공과 대학에서 박사 화목에 의해 부분적으로 지원되었다.

1. 2100 Bioanalyzer와 RNA 샘플의 품질 관리 분석 당신이 시작하기 전에 <ol><li> ° C 10 분 70에 사다리와 샘플을 변성. 얼음 즉시 칠. </li><li> 10 초에 대한 RNase가없는 물이어서 1 분 RNaseZAP과 악기 전극을 청소하십시오. 공기 건조에 전극을 허용합니다. </li><li> 키트와 함께 제공된 스핀 필터에 겔 매트릭스의 550 μl를 pipeting하여 겔 매트릭스를 준비합니다. 실온에서 10 분 1,500 RCF에서 원심 분리기. 나누어지는 최대 1 개월 4시 65 μl aliquots하고 저장 ° C로 젤을 필터링. </li><li> 칩 마중물 역 준비하려면, <ol class="lalpha"><li> 클립 통해 luer 잠금 어댑터에 1 - ML 주사기를 삽입합니다. </li><li> , 받침대 아래에있는 나사를 느슨해진 접시를 운반하고 나사를 retightening하여 C를 위치로 기본 플레이트를 조정합니다. </li><li> 최상위 순위에 주사기 클립을 조정합니다. </li></ol></li><li> 상온에 염료 집중 평형. 10 초위한 와동. 필터 젤의 65 μl 나누어지는에 염료 1 μl를 추가합니다. 잘 소용돌이와 실온에서 10 분 13,000 RCF에서 원심 분리기. 하루 만에 사용합니다. 당신이 샘플을 실행할 준비가되면, </li><li> 마중물 역에 칩을 놓습니다. 이 프로토콜에서는 RNA 6000 나노 칩을 사용하고 있습니다. 젤을로드하려면, <ol class="lalpha"><li> 잘 검정색 배경에 흰색 &quot;G&quot;로 표시에서 젤 염색 믹스 피펫 9 μl. 귀하의 팁이 잘의 가장 하단에 위치하고 있는지 확인하십시오. </li><li> 1 ML에서 주사기의 플런저를 놓습니다. 마중물 역을 닫습니다. 그것이 클릭 잠금 있는지 확인하십시오. </li><li> 그것은 클립에 의해 개최 될 때까지 천천히 그러나 꾸준히 플런저를 누르십시오. </li><li> 30 초 기다립니다. 클립을 놓습니다. </li><li> 플런저가 스스로에 의해 가자. 그것이 움직이는 중지 후, 몇 초 동안 기다린 후 제 1 ML 위치로 플런저를 가져옵니다. 마중물 역을 엽니다. </li></ol></li><li> &quot;G&quot;로 표시된 2 개의 우물 각 젤 염색 믹스 피펫 9 μl. </li><li> 12 샘플 우물 각과 잘 사다리에있는 마커의 피펫 5 μl. </li><li> 잘 사다리에서 준비 사다리 피펫 1 μl. </li><li> 샘플 우물에 각 시료의 피펫 1 μl. </li><li> 잘 사용되지 않는 각각의 샘플에있는 마커의 피펫 1 μl. </li><li> 와동 2,400 RPM에서 1 분 칩. </li><li> , 칩을 실행하려면 <ol class="lalpha"><li> 2,100 전문가 소프트웨어를 시작합니다. </li><li> 칩 위치하고 뚜껑을 닫습니다. 악기가 온라인 경우 아이콘이 뚜껑이 열려 있거나 닫혀 그리고 어떤 칩 종류의 삽입 여부가 표시됩니다. 올바른 포트가 선택되어 있는지 확인하십시오. </li><li> 증발을 방지하기 위해 샘플을 로딩 중 5 분 이내에 분석을 실행합니다. </li></ol></li></ol> 2. 증폭 및 라벨 microarray 분석을위한 준비하려면, RNA 샘플은 T7 RNA 중합 효소의 3을 기반으로 반응 일반적으로, 증폭 및 표시됩니다. 더블 리버스 녹음에 의해 생성되는이 cDNA 좌초. cDNA는 cRNA으로 알려진 것을 생성하는 시험 관내 전사 반응에 사용된다. 이 반응은 배열 하이브 리다이 제이션에 대한 분류 RNA의 마이크로 그램 수량을 생산, 레이블 ribonucleotides의 존재에서 수행됩니다. 확대 / 라벨링 방법의 선택은 사용할 이후 microarray 플랫폼에 따라 다릅니다. 이 섹션에서는, 우리는 애질런트의 빠른 앰프 라벨 키트를 사용하여 찬란 분류 RNA의 생성을 설명합니다. <ol><li> 1.5 ML 튜브에 RNA 5 μg을 피펫 50 NG. 볼륨 8.3 μl를 초과해서는 안됩니다. 필요한 경우, 알코올로 진공 원심 분리 또는 석출하여 RNA 샘플을 집중. </li><li> T7 프라이머 1.2 μl를 추가합니다. </li><li> RNase 무료 물로 11.5 μl의 최종 볼륨을 가져와. </li><li> ° C 10 분 RNA를 변성 65에서 알을 품다. 우리는 튜브의 상단에 응축을 방지하기 위해 뜨거운 뚜껑과 thermocycler를 사용하는 것이 좋습니다. </li><li> 10 분 부화, 따뜻한 배 퍼스트 스트랜드 버퍼 동안 80 ° C 5 분. 소용돌이와 스핀 다운. 사용할 때까지 RT에서 계속. </li><li> 10 분 부화 후, 신속하게 얼음 변성 RNA 샘플 시원한 시간을 보내세요. </li><li> cDNA 마스터 믹스를 준비합니다. 반응에 따라 다음을 추가 : <ol class="lalpha"><li> 4 μl 배 퍼스트 스트랜드 버퍼 </li><li> 2 μl 0.1 M DTT </li><li> 1 μl 10 MM의 dNTPs </li><li> 1 μl MMLV - RT 효소 </li><li> 0.5 μl RNase 아웃. </li></ol></li><li> 반전 튜브 4 배로 구성 요소를 섞는다. 와동하지 마십시오. 튜브의 하단에있는 내용을 수집하는 스핀 다운. </li><li> 샘플 당 마스터 믹스의 8.5 μl를 추가합니다. 최대 pipeting 아래로 섞는다. </li><li> 40 2 시간에 대한 품어 ° C, 65 10 분 뒤에 ° C. 우리는 온수 뚜껑이있는 thermocycler를 사용하는 것이 좋습니다. </li><li> 5 분 얼음 튜브를 전송합니다. </li><li> 전사 마스터 믹스를 준비합니다. 반응에 따라 다음을 추가 : <ol class="lalpha"><li> 15.3 μl nuclease없는 물 </li><li> 20 μl4X 전송 버퍼 </li><li> 6 μl 0.1 M DTT </li><li> 8 μl NTPs </li><li> 6.4 μl 50 % PEG (PEG가 40 ° C로 prewarmed 및 resuspension을 보장하기 vortexed해야합니다) </li><li> 0.5 μl RNase 아웃 </li><li> 0.6 μl 무기 pyrophosphatase </li><li> 0.8 μl T7 RNA 효소 </li><li> 2.4 μl Cy3 또는 Cy5 CTP </li></ol></li><li> 간단히 샘플은 튜브의 하단에있는 내용을 수집하는 스핀. </li><li> 샘플 당 전사 마스터 믹스 60 μl를 추가합니다. </li><li> 2 시간 40 ° C에서 알을 품다. </li><li> RNase가없는 물을 20 μl를 추가합니다. </li><li> 비법인 세포핵을 제거하기 위해 표시된 cRNA 정화. 우리는 Qiagen의 RNeasy 미니 컬럼을 사용하는 것이 좋습니다. </li><li> 라벨 cRNA을 수량. 우리는 Microarray 측정 모드에서 NanoDrop2000 분광 광도계를 사용하는 것이 좋습니다. 이 샘플 형식으로 RNA - 40을 선택하십시오. </li><li> 기록 샘플 농도, 이윤율 (볼륨 곱한 농도로 계산) 및 특정 활동 (cRNA 농도 이상의 염색 농도의 배급 곱한 1000로 계산). microarray의 하이브리드화 들어, 적어도 825 NG와 최소한 8 pmol / μg의 특정 활동의 수율을 달성하기 위해 필요합니다. </li></ol> 3. Microarray의 하이브리드화 <ol><li> 65 하이브리드화 스테이션 및 설정를 켭니다 ° 하이브 리다이 제이션이 시작 C 최소한 2 시간 전에. </li><li> 하이브 리다이 제이션 샘플을 준비하려면, 1.5 ML 튜브에 다음을 혼합 : <ol class="lalpha"><li> 825 NG Cy3 - cRNA (이 일반적으로 &quot;취급&quot;예제입니다) </li><li> 825 NG Cy5 - cRNA (이 일반적으로 &quot;참조&quot;예제입니다) </li><li> 11 μl 10X 차단 요원. </li><li> 52.8 μl의 최종 볼륨 RNase 무료 물을 추가 </li><li> 2.2 μl 조각 버퍼를 추가합니다. </li></ol></li><li> 혼합에 낮은 속도로 소용돌이. </li><li> 60 ° C 정확히 30 분 알을 품다. 이것은 배열 하이브 리다이 제이션에 대한 라벨 조각을 생성 cRNA 조각화 단계입니다. 그것은 정확하게 설명 부화 매우 중요합니다. 우리는 온수 뚜껑이있는 thermocycler의 사용을 권장합니다. 그것은 정확하게 올바른 평균 길이의 프로브를 생성하는 설명 부화 매우 중요합니다. 과도하거나 부족 조각은 거짓 제외하거나 잘못 탐지가 발생합니다. </li><li> 조각을 중지 2X 하이브리드화 버퍼 55 μl를 추가합니다. , pipetting 거품을 소개하지 특별한주의를 취하여 섞는다. </li><li> 튜브의 하단에있는 내용을 수집하는 최대 속도에서 1 분 원심 분리기. 거품이 지켜지면, 그들을 제거하는 이상 원심 분리기. </li><li> 빛으로부터 보호 얼음 튜브를 놓으십시오. 최대한 빨리 배열에 샘플을로드합니다. </li><li> 배열을로드하려면 먼저 하이브리드화 챔버를 준비합니다. 이 프로토콜은 로체 - Nimblegen의 하이브리드화 시스템 및 A4의 믹서 챔버와 애질런트의 4x44K 배열의 사용을 설명합니다. <ol class="lalpha"><li> 먼저 조립 / 해체 공구, 바코드 측면에서 microarray 슬라이드를 놓습니다. </li><li> A4 믹서를 열고 접착제를 노출. 배열 및 조립 / 어떤 운동을 방지하기 위해 해체 도구를 개최, 맨 마지막에 시작, 슬라이드에 A4 믹서를 놓습니다. 그것이 제대로 도구에 정렬되어 있는지 확인하십시오. 모든 배열 슬라이드 따라 믹서를 지켜야합니다. </li><li> 슬라이드 / 믹서 어셈블리를 제거하는 믹서의 마지막에서 당겨. </li><li> braying 도구를 사용하여, 그것이 꽉 theslide에 붙어 있는지 확인하기 위해 접착 가스켓 따라 모두를 누르십시오. 접착제과 슬라이드 사이에 갇힌 작은 기포는 어두운 배경을 볼 수 있습니다. braying 도구를 사용하여 이러한 거품을 제거하기 위해 여분의 시간을 가지십시오. 당신의 배열은 지금 읽어 준비가되어 있습니다. </li></ol></li><li> 하이브 리다이 제이션 샘플 100 μl를 로드할 긍정적인 변위 피펫을 사용합니다. 단단히 포트 구멍 안쪽 끝을 밀어, 그 공기가 배열의 영역에 갇혀 아니라고 천천히 그리고 부드럽게 있도록 분배. 백업 예제를 빨아하려고하지 마십시오. 전체 예제가 적절되면 플런저를 발표하지 않고 포트 구멍에 제보를 유지. 예제는 전체 배열을 포함하고 액체 배출구를 나오기 시작하면, 신속하게 피펫을 제거합니다. 끝 멀리 슬라이드 출신 한 번만 플런저를 놓습니다. </li><li> 두 포트에서 조심스럽게 소량 초과 액체. 당신이 챔버 자체의 샘플을 채취하지 않도록합니다. </li><li> 핀셋을 사용하여 스티커와 포트 구멍을 커버. </li><li> 하이브 리다이 제이션 역에 덮개를 씌우고, 그리고 방광 구멍이 올바르게 O - 링을 통해 위치가 결정됩니다 있는지 확인합니다. 이것은 하이브리드화하는 동안 적절한 혼합되도록합니다. </li><li> 슬라이드 커버와 역 뚜껑을 닫습니다. 혼합 모드 B.로 역을 설정 </li><li> ° C 17시간 65에서 배열을 잡종. </li><li> 0.005 %의 최종 농도 트리톤 X - 102을 추가하여 버퍼 2를 씻어 준비합니다. ° C 야간 37 유지. </li></ol> 4. Microarray 세척 <ol><li> 0.005 %의 최종 농도 버퍼 1 씻어 트리톤 X - 102을 추가합니다. 객실 temperatur에서 보관E. </li><li> 하이브 리다이 제이션이 완료되면, 워시 버퍼 1 유리 접시 &quot;A&quot;를 입력합니다. 접시는 조립 / 해체 도구를 잡고뿐만 아니라 일부 작전을 허용만큼 큰해야합니다. 모든 세척은 유리로 이루어 질 것입니다. 그들이 배열에 높은 백그라운드에서 발생 리치 화합물하는 경향이 있기 때문에, 플라스틱 요리를 피하십시오. </li><li> 얼룩 요리 &quot;B&quot;의 슬라이드 랙 및 저어 막대를 넣어. 그것은 선반을 커버해야하고, 워시 버퍼 1 채웁니다. 상온에서 저어 접시에 놓습니다. </li><li> 저어 접시에 빈 얼룩 요리 &quot;C&quot;와 장소에 저어 막대를 넣어. </li><li> 배열을 제거하고 조립 / 해체 도구에 넣어. 요리 &quot;A&quot;에서 잠수함 온 회중합니다. </li><li> 조심스럽게 A4 믹서에서 껍질, 한 손으로 반대편에서 조립 / 해체 도구 및 슬라이드를 누른 상태. 당신은 배열의 영역을 스크래치하지 않도록합니다. </li><li> 신속하게 요리 &quot;B&quot;를 얼룩의 선반에 슬라이드를 놓습니다. Cy5 염료는 오존에 민감한 있기 때문에 지금부터, 공기에 노출을 최소화해야합니다. 한 번에 두 개 이상 8 배열을 씻지 마십시오. </li><li> 중간 속도로 1 분 감동을위한 씻으십시오. </li><li> 사전 예열 씻으 버퍼 2 요리 &quot;C&quot;를 염색법 입력합니다. 슬라이드를 전송하고 1 분 씻으십시오. </li><li> 아주 천천히 슬라이드에 남아 방울을 최소화하기 위해 요리 &quot;C&quot;를 얼룩의 슬라이드 선반을 제거합니다. </li><li> 2 분 동안 회전하여 슬라이드를 건조시킵니다. 호환 원심 분리기를 사용할 수없는 경우, 50 ML 원뿔 튜브 슬라이드를 원심 또는 이상의 아르곤 가스를 불어. </li><li> 플레이스 50 ML 원뿔 튜브 슬라이드 및 아르곤 가스를 채우십시오. 신호 손실을 피하기 위해 즉시 스캔. 우리는 분자 장치에서 GenePix 4000B 스캐너의 사용을 권장합니다. </li></ol> 5. 대표 결과 : 2 주요 ribosomal RNA 종 대응, 품질 관리를위한 Bioanalyzer에서 실행하면 양질의 총 RNA 샘플은 두 가지 주요 봉우리를 생성해야합니다. 일부 RNA의 저하는 첫 번째 ribosomal RNA 피크 전에 얼룩으로 표시됩니다. 심각하게 저하될 2 ribosomal RNA의 봉우리가 전혀 매우 낮은 농도 여부 식별이 될 것입니다 반면, 낮은 품질의 RNA는 브로드 피크 또는 낮은 유지 시간에 봉우리의 시리즈를 표시합니다. 2100 Bioanalyzer 출력의 예를 들면, 그림 1을 참조하십시오. 전문가 2100 소프트웨어는 RNA 품질의 양적 측정으로 RNA 무결성 번호 또는 RIN을 계산합니다. 9 이상 RIN 값 고품질 샘플, microarray 애플 리케이션에 가장 분명합니다. 그러나, 우리는 합리적인 품질의 microarray 데이터를 생성 5.2만큼 낮은 RIN 값 샘플을 사용했습니다. 양질의 배열은 비교적 낮은 PMT 값을 높은 신호를 생성한다. 우리의 실험에서는, 기록의 대부분은 실험과 참조 예제에서와 비슷한 수준에 존재 것으로 예상되며 유전자 발현에 대규모, 광범위한 변화는 아마도 어떤 생물 학적 의미가없는 것입니다. 따라서, 배열의 대부분은 오히려 녹색 또는 빨간색보다 노란색 보일 것입니다. 양질의 신호는 신호 histograms 완전히 중복되는 같은 동적 범위에 있어야합니다. 예를 보려면 그림 2를 참조하십시오. <img src="/files/ftp_upload/2546/2546fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 인간의 뇌 종양 조직으로부터 격리 사 RNA 샘플의 예. RNA는 3.1.1에 표시되는 프로토콜을 사용하여 격리되었다. 샘플 품질로 3.1.3에 설명된 RNA 6000 칩에 2100 Bioanalyzer를 사용하여 평가되었다. 샘플 4 별개의 RNA의 자질 대표하는 : A, 아주 좋은 RNA 품질 (RIN&gt; 9), B, 부분적으로 저하 RNA (RIN 5-6, 28S rRNA에 대한 상당히 낮은 정상 주) C, 고도의 저하 RNA (RIN &lt; 3), D, 거의 저하 RNA (RIN = 2). 우리는 하류 microarray 애플 리케이션을위한 비슷하거나 B (RIN&gt; 5.2)보다 나은 자질을 가진 샘플을 성공적으로 사용했습니다. 솔리드 및 오픈 화살촉은 각각 18S와 28S rRNA 종의 위치를​​ 나타냅니다. <img src="/files/ftp_upload/2546/2546fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. 어레이 이미지와 스캐터 플롯의 예. 4X44K 애질런트 형식으로 네 개의 배열을 보여주는, 전체 슬라이드 미리보기, B, 배열의 영역 중 하나의 고해상도 스캔은 신호의도 (빨간색 또는 녹색)가 주된있다는 점에 유의, C,에있는 이미지의 스캐터 플롯 B, 신호가 완전히 중복하고 더 이상 -6 1x10 이상의 기능이 포화 강도에됩니다.

<ol>
	<li>Diaz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+Decade+Later:+What+has+Gene+Expression+Profiling+Told+us+About+Neuronal+Cell+Types,+Brain+Function+and+Disease.">One Decade Later: What has Gene Expression Profiling Told us About Neuronal Cell Types, Brain Function and Disease.</a> Curr Genomics. 10, 318-318 (2009).</li><li>Barisone, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Expression profiling in Neuroscience, edited by Ioannis Karamanos. , (2010).</li><li>Gelder, R. N. V. a. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplified+RNA+synthesized+from+limited+quantities+of+heterogeneous+cDNA.">Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 1663-1663 (1990).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

DNA의 microarrays와 표현 프로 파일링 두 생물 학적 샘플 사이 differentially 표현 유전자를 식별할 수있는 간단한 방법을 제공합니다. 성공적인 표현 프로 파일링 실험 고품질의 RNA 샘플, 강력한 라벨링과 하이브 리다이 제이션을 필요로합니다. 우리의 경험에서 애질런트의 상업 배열과 라벨 키트는 저렴한 비용으로 고품질의 데이터를 제공합니다. 애질런트는 또한 자신의 하이브리드화 및 스캐닝 기계를 제공하고 있지만, 우리는 로체 - Nimblegen 및 분자 장치에서 GenePix 4000B microarray 스캐너의 하이브리드화 시스템을 선호. 로체 - Nimblegen의 하이브리드화 장치가 이전 마우이 하이브리드화 시스템으로 알려져 있다고합니다. 로체가 최근 기업 인수 후, A4의 믹서가 중단되었습니다. 이 글을 쓰는 순간에, 그들은 여전히 같은 Kreatech 진단 (다른 판매자를 통해 찾을 수 <a href="http://www.kreatech.com/">www.kreatech.com</a> ,이 웹사이트는 또한 편리한 배열 호환성 도구를 제공합니다)하지만, 장기 재고 여부는 불확실합니다. 기타 하이브리드화 시스템 (예를 들어, 애​​질런트에서) 제공되지만, 배열을 사용하고와 호환 믹서를 찾을 수있다면, 우리는 품질과 재현성에 대한 호슈 - Nimblegen의 시스템을 권장합니다.

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>2100 Bioanalyzer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent Technologies</td>
<td>G2943CA</td>
<td>Includes chip priming station, vortexer, software and laptop computer</td>
</tr>
<tr>
<td>2100 Bioanalyzer electrophoresis set</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent Technologies</td>
<td>G2947CA</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNA 6000 Nano kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent Technologies</td>
<td>5067-1511</td>
<td>includes size ladder, marker, gel matrix, dye, electrode cleaners, spin filters and nanochips</td>
</tr>
<tr>
<td>RNase Zap</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Applied Biosystems &#x2013; Ambion</td>
<td>AM9780M</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Quick Amp labeling kit, two-color</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent Technologies</td>
<td>5190-0444</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNeasy mini kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>74104</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gene Expression Hybridization Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent Technologies</td>
<td>5188-542</td>
<td>Includes Blocking agent, Fragmentation buffer and Hybridization buffer</td>
</tr>
<tr>
<td>Gene Expression Wash Buffer Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent Technologies</td>
<td>5188-5327</td>
<td>Includes Wash Buffers 1 and 2 and Triton X-102</td>
</tr>
<tr>
<td>Hybridization Station</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche Nimblegen</td>
<td>05223652001</td>
<td>4-slide model</td>
</tr>
<tr>
<td>Hybridization System Accesory Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche Nimblegen</td>
<td>05327695001</td>
<td>Contains verification assembly for testing mixing, replacement O-rings, disassembly tool, forceps and brayer</td>
</tr>
<tr>
<td>A4 mixer hybridization chambers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Whole Human Genome (4x44) Oligo Microarray</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent Technologies</td>
<td>G4112F</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Positive displacement pipette</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gilson</td>
<td>F148504</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Capillary pistons for positive displacement pipette</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gilson</td>
<td>F148415</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microarray dryer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nimblegen</td>
<td>05223636001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microarray fluorescent scanner, Axon GenePix 4000B</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>GENEPIX4000B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GenePix Pro 6.0 software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

dna microarrays: sample quality control, array hybridization and scanning

신경 계통의 Microarray 표현 프로 파일링은 일반적으로, 실험적으로 1 테스트중인 모든 조건 개발의 여러 단계, 여러 생리 또는 병적인 상태, 치료에 대한 응답에서 유전자 활동을 파악하고 강력한 방법을 제공합니다. 신경 조직의 표현 프로 파일링 고품질 RNA, 분리된 RNA와 DNA의 microarrays에 하이브 리다이 제이션의 증폭의 고립이 필요합니다. 이 문서에서 우리는 뇌 종양 조직 2 재현할 microarray 실험을 위해 프로토콜을 설명합니다. 우리는 애질런트의 2100 Bioanalyzer &quot;실험실 - 온 - 어 - 칩 &#39;기술로 고립 RNA 샘플의 품질 관리 분석을 수행하여 시작합니다. 고품질의 RNA 샘플은 microarray 실험의 성공을 위해 중요하고, 2100 Bioanalyzer은 샘플의 품질 빠르고 양적 측정을 제공합니다. RNA 샘플은 다음과 cDNA 증폭 얻기 위해 역방향 전송을 수행하여 라벨, 라벨 cRNA 생산 레이블 세포핵의 면전에서 체외의 전사에 의해 다음 있습니다. 듀얼 컬러 라벨 키트를 사용하여, 우리는 Cy3와 Cy5로 참조 샘플과 함께 실험 샘플 레이블을 것입니다. 두 샘플은 다음 결합과 애질런트의 4x44 K 배열에 hybridized 것입니다. 듀얼 - 색상 배열은 두 RNA 샘플은 하나의 microarray에 경쟁력 hybridized 때문에이를 표현 수준의 작은 변화에 대해 특히, 측정의 정확도를 증가 두 RNA 샘플 사이의 직접적인 비교의 장점을 제공합니다. 배열은 두 대응하는 파장에서 스캔되며, 각 기능에 대한 Cy3로 Cy5 신호의 비율은 해당 mRNA의 상대적인 풍요의 직접적인 측정으로 사용됩니다. 이 분석은 differentially 테스트중인 실험 조건에 대한 응답으로 표현됩니다 유전자를 식별합니다.

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DNA Microarrays: Sample Quality Control, Array Hybridization and Scanning

우리는 신경계의 표현을위한 프로 파일링의 DNA microarrays의 사용을 보여줍니다. 우리는 RNA 품질 관리, 샘플 라벨링, 그리고 배열의 하이브리드화 및 검사에 대해 설명합니다.

의 DNA Microarrays : 샘플 품질 제어, 배열 하이브 리다이 제이션 및 스캔

Microarray expression profiling of the nervous system provides a powerful approach to identifying gene activities in different stages of development, ...

dna-microarrays-sample-quality-control-array-hybridization

Research

JoVE Journal

Biology

37.8K 조회수.  University of California, Davis. 우리는 신경계의 표현을위한 프로 파일링의 DNA microarrays의 사용을 보여줍니다. 우리는 RNA 품질 관리, 샘플 라벨링, 그리고 배열의 하이브리드화 및 검사에 대해 설명합니다.

비디오: DNA Microarrays: Sample Quality Control, Array Hybridization and Scanning

Technical Demonstration of Whole Genome Array Comparative Genomic Hybridization

Array comparative genomic hybridization (array CGH) is a method for detecting gains and losses of DNA segments or gene dosage in the genome 1. Recent advances in this technology have enabled high resolution comparison of whole genomes for the identification of genetic alterations in cancer and other genetic diseases 2. The Sub-Megabase Resolution Tiling-set array (or SMRT) array is comprised of a set of approximately thirty thousand overlapping bacterial artificial chromosome (BAC) clones that span the human genome in ~100 kilobase pair (kb) segments 2. These BAC targets are individually synthesized and spotted in duplicate on a single glass slide 2-4. Array CGH is based on the principle of competitive hybridization. Sample and reference DNA are differentially labeled with Cyanine-3 and Cyanine-5 fluorescent dyes, and co-hybridized to the array. After an incubation period the unbound samples are washed from the slide and the array is imaged. A freely available custom software package called SeeGH (www.flintbox.ca) is used to process the large volume of data collected - a single experiment generates 53,892 data points. SeeGH visualizes the log2 signal intensity ratio between the 2 samples at each BAC target which is vertically aligned with chromosomal position 5,6. The SMRT array can detect alterations as small as 50 kb in size 7. The SMRT array can detect a variety of DNA rearrangement events including DNA gains, losses, amplifications and homozygous deletions. A unique advantage of the SMRT array is that one can use DNA isolated from formalin fixed paraffin embedded samples. When combined with the low input requirements of unamplified DNA (25-100ng) this allows profiling of precious samples such as those produced by microdissection 7,8. This is attributed to the large size of each BAC hybridization target that allows the binding of sufficient labeled samples to produce signals for detection. Another advantage of this platform is the tolerance of tissue heterogeneity, decreasing the need for tedious tissue microdissection 8. This video protocol is a step-by-step tutorial from labeling the input DNA through to signal acquisition for the whole genome tiling path SMRT array.

This video is a technical demonstration of the hybridization protocol for whole genome tiling path array CGH, which scans the entire human genome using only 25-100 ng of DNA that can be isolated from a variety of sources, including archival formalin fixed material.

전체 게놈 배열 비교 게놈 하이브 리다이 제이션의 기술의 데모

Array comparative genomic hybridization (array CGH) is a method for detecting gains and losses of DNA segments or gene dosage in the genome 1.  Recent ...

연구

생물학

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using noninvasive sampling techniques to investigate population genetics and demography of wild populations1. This approach has proven to be especially useful when dealing with rare or elusive species2. While a number of these methods have been developed to sample hair, feces and other biological material from carnivores and medium-sized mammals, they have largely remained untested in elusive small mammals. In this video, we present a novel, inexpensive and noninvasive hair snare targeted at an elusive small mammal, the American pika (Ochotona princeps). We describe the general set-up of the hair snare, which consists of strips of packing tape arranged in a web-like fashion and placed along travelling routes in the pikas&#x2019; habitat. We illustrate the efficiency of the snare at collecting a large quantity of hair that can then be collected and brought back to the lab. We then demonstrate the use of the DNA IQ system (Promega) to isolate DNA and showcase the utility of this method to amplify commonly used molecular markers including nuclear microsatellites, amplified fragment length polymorphisms (AFLPs), mitochondrial sequences (800bp) as well as a molecular sexing marker. Overall, we demonstrate the utility of this novel noninvasive hair snare as a sampling technique for wildlife population biologists. We anticipate that this approach will be applicable to a variety of small mammals, opening up areas of investigation within natural populations, while minimizing impact to study organisms.

We present a noninvasive sampling approach to efficiently collect hair samples from elusive small mammals, as shown for the American pika. We demonstrate the utility of this method by extracting DNA from sampled hair and amplifying several types of molecular markers commonly used in studies of wildlife ecology and conservation.

엘루시브 작은 포유류의 고품질 DNA를 얻기 위해 비침 투 헤어 샘플링 기법

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays (MEArrays)

The interactions between cells and their surrounding microenvironment have functional consequences for cellular behaviour. On the single cell level, distinct microenvironments can impose differentiation, migration, and proliferation phenotypes, and on the tissue level the microenvironment processes as complex as morphogenesis and tumorigenesis1. Not only do the cell and molecular contents of microenvironments impact the cells within, but so do the elasticity2 and geometry3 of the tissue. Defined as the sum total of cell-cell, -ECM, and -soluble factor interactions, in addition to physical characteristics, the microenvironment is complex. The phenotypes of cells within a tissue are partially due to their genomic content and partially due to the combinatorial interactions with the microenviroment. A major challenge is to link specific combinations of microenvironmental components with distinctive behaviours.
Here, we present the microenvironment microarray (MEArray) platform for cell-based functional screening of interactions with combinatorial microenvironments4. The method allows for simultaneous control of the molecular composition and the elastic modulus, and combines the use of widely available microarray and micropatterning technologies. MEArray screens require as few as 10,000 cells per array, which facilitates functional studies of rare cell types such as adult progenitor cells. A limitation of the technology is that entire tissue microenvironments cannot be completely recapitulated on MEArrays. However, comparison of responses in the same cell type to numerous related microenvironments, for instance pairwise combinations of ECM proteins that characterize a given tissue, will provide insights into how microenvironmental components elicit tissue-specific functional phenotypes.
MEArrays can be printed using a wide variety of recombinant growth factors, cytokines, and purified ECM proteins, and combinations thereof. The platform is limited only by the availability of specific reagents. MEArrays are amenable to time-lapsed analysis, but most often are used for end point analyses of cellular functions that are measureable with fluorescent probes. For instance, DNA synthesis, apoptosis, acquisition of differentiated states, or production of specific gene products are commonly measured. Briefly, the basic flow of an MEArray experiment is to prepare slides coated with printing substrata and to prepare the master plate of proteins that are to be printed. Then the arrays are printed with a microarray robot, cells are allowed to attach, grow in culture, and then are chemically fixed upon reaching the experimental endpoint. Fluorescent or colorimetric assays, imaged with traditional microscopes or microarray scanners, are used to reveal relevant molecular and cellular phenotypes (Figure 1).

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays MEArrays

A combinatorial functional screening method for gaining insights into the impacts of the molecular composition of microenvironments on cellular functions is described. The method takes advantage of existing microarray-based technologies to generate arrays of defined combinatorial microenvironments that support cell adhesion and functional analysis.

제조 및 MicroEnvironment의 microArrays의 사용 (MEArrays)

The interactions between cells and their surrounding microenvironment have functional consequences for cellular behaviour. On the single cell level, ...

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the raw materials for human societies (e.g. wood, paper, textile and biofuel industries)1,2. However, understanding the biosynthesis and function of these components remains challenging.
Cell wall glycans are chemically and conformationally diverse due to the complexity of their building blocks, the glycosyl residues. These form linkages at multiple positions and differ in ring structure, isomeric or anomeric configuration, and in addition, are substituted with an array of non-sugar residues. Glycan composition varies in different cell and/or tissue types or even sub-domains of a single cell wall3. Furthermore, their composition is also modified during development1, or in response to environmental cues4.
In excess of 2,000 genes have Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans been predicted to be involved in cell wall glycan biosynthesis and modification in Arabidopsis5. However, relatively few of the biosynthetic genes have been functionally characterized 4,5. Reverse genetics approaches are difficult because the genes are often differentially expressed, often at low levels, between cell types6. Also, mutant studies are often hindered by gene redundancy or compensatory mechanisms to ensure appropriate cell wall function is maintained7. Thus novel approaches are needed to rapidly characterise the diverse range of glycan structures and to facilitate functional genomics approaches to understanding cell wall biosynthesis and modification.
Monoclonal antibodies (mAbs)8,9 have emerged as an important tool for determining glycan structure and distribution in plants. These recognise distinct epitopes present within major classes of plant cell wall glycans, including pectins, xyloglucans, xylans, mannans, glucans and arabinogalactans. Recently their use has been extended to large-scale screening experiments to determine the relative abundance of glycans in a broad range of plant and tissue types simultaneously9,10,11.
Here we present a microarray-based glycan screening method called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) (Figures 1 &amp; 2)10,11 that enables multiple samples (100 sec) to be screened using a miniaturised microarray platform with reduced reagent and sample volumes. The spot signals on the microarray can be formally quantified to give semi-quantitative data about glycan epitope occurrence. This approach is well suited to tracking glycan changes in complex biological systems12 and providing a global overview of cell wall composition particularly when prior knowledge of this is unavailable.

A technique called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) for the characterisation of plant cell wall glycans is described. This method combines the specificity of monoclonal antibodies directed to defined glycan-epitopes with a miniature microarray analytical platform allowing screening of glycan occurrence in a broad range of biological contexts.

Microarrays를 사용하여 식물 세포의 벽 폴리머의 Glycan 프로파일

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the ...

Array Comparative Genomic Hybridization (Array CGH) for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a clinical diagnostic service laboratory. DNA extracted from a patient&#8217;s sample (blood, saliva or other tissue types) is labeled with a fluorochrome (either cyanine 5 or cyanine 3). A reference DNA sample is labeled with the opposite fluorochrome. There follows a cleanup step to remove unincorporated nucleotides before the labeled DNAs are mixed and resuspended in a hybridization buffer and applied to an array comprising ~60,000 oligonucleotide probes from loci across the genome, with high probe density in clinically important areas. Following hybridization, the arrays are washed, then scanned and the resulting images are analyzed to measure the red and green fluorescence for each probe. Software is used to assess the quality of each probe measurement, calculate the ratio of red to green fluorescence and detect potential copy number variants.

Array Comparative Genomic Hybridization Array CGH for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a diagnostic service laboratory.

게놈 복사 번호 변종의 탐지를위한 배열 비교 게놈 교잡 (배열 CGH)

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly effective at mapping highly repetitive sequences to heterochromatic regions, where computational approaches face prohibitive challenges. Here we describe a streamlined protocol for DNA ISH that circumvents formamide washes that are standard steps in other DNA ISH protocols. Our protocol is optimized for hybridization with short single strand DNA probes that carry fluorescent dyes, which effectively mark repetitive DNA sequences within heterochromatic chromosomal regions across a number of different insect tissue types. However, applications may be extended to use with larger probes and visualization of single copy (non-repetitive) DNA sequences. We demonstrate this method by mapping several different repetitive sequences to squashed chromosomes from Drosophila melanogaster neural cells and Nasonia vitripennis spermatocytes. We show hybridization patterns for both small, commercially synthesized probes and for a larger probe for comparison. This procedure uses simple laboratory supplies and reagents, and is ideal for investigators who have little experience with performing DNA ISH.

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.

형광 DNA를위한 간단한 방법<em&gt; 현장에서</em&gt; 숙청 염색체에 하이브리드

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

Do's and Don'ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state by transmission electron microscopy (TEM). This can be achieved with very low quantity of protein and in the buffer of choice, without the use of any stain, which is very useful to determine structure-function correlations of macromolecules. When combined with single-particle image processing, the technique has found widespread usefulness for 3D structural determination of purified macromolecules. 
The protocol presented here explains how to perform cryoEM and examines the causes of most commonly encountered problems for rational troubleshooting; following all these steps should lead to acquisition of high quality cryoEM images. The technique requires access to the electron microscope instrument and to a vitrification device. Knowledge of the 3D reconstruction concepts and software is also needed for computerized image processing. Importantly, high quality results depend on finding the right purification conditions leading to a uniform population of structurally intact macromolecules. 
The ability of cryoEM to visualize macromolecules combined with the versatility of single particle image processing has proven very successful for structural determination of large proteins and macromolecular machines in their near-native state, identification of their multiple components by 3D difference mapping, and creation of pseudo-atomic structures by docking of x-ray structures. The relentless development of cryoEM instrumentation and image processing techniques for the last 30 years has resulted in the possibility to generate de novo 3D reconstructions at atomic resolution level.

Do&#039;s and Don&#039;ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

This paper describes the cryo-electron microscopy methodology, which is used to obtain high quality microscopic images of macromolecules in their near-native state. The method yields images suitable for further computerized processing using the single particle approach, devised to generate the 3D reconstruction of a macromolecule.

거대 분자 3D 재건을위한 샘플 준비에 프라이머 높은 품질 데이터 수집 : 곳을 알아내는 - 전자 현미경의 것과하지 말아야를 수행

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

레트로 바이러스 통합 사이트의 증폭, 차세대 시퀀싱 및 게놈 DNA 매핑

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Synthesis of Wavelength-shifting DNA Hybridization Probes by Using Photostable Cyanine Dyes

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase synthesis using standard phosphoramidite chemistry. Oligonucleotides are post-synthetically labeled by two new photostable cyanine dyes using copper-catalyzed click-chemistry. The synthesis of both donor and acceptor dye is described and is performed in three consecutive steps. With the DNA as the surrounding architecture, these two dyes undergo an energy transfer when they are brought into close proximity by hybridization. Therefore, annealing of two single stranded DNA strands is visualized by a change of fluorescence color. This color change is characterized by fluorescence spectroscopy but can also be directly observed by using a handheld ultraviolet (UV) lamp. The concept of a dual fluorescence color readout makes these oligonucleotide probes excellent tools for molecular imaging especially when the described photostable dyes are used. Thereby, photobleaching of the imaging probes is prevented, and biological processes can be observed in real time for a longer time period.

Photostable cyanine dyes are attached to oligonucleotides to monitor hybridization by energy transfer.

광 안정성 시아닌 염료를 사용하여 파장 변환 DNA 혼성화 프로브의 합성

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase ...

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we showed that D. discoideum is remarkably resilient to protein aggregation and can be used to gain insights into the cellular protein quality control system. However, the use of D. discoideum as a model system poses several challenges to microscopy-based experimental approaches, such as the high motility of the cells and their susceptibility to photo-toxicity. The latter proves to be especially challenging when studying protein homeostasis, as the phototoxic effects can induce a cellular stress response and thus alter to behavior of the protein quality control system. 
Temperature increase is a commonly used way to induce cellular stress. Here, we describe a temperature-controllable imaging protocol, which allows observing temperature-induced perturbations in D. discoideum. Moreover, when applied at normal growth temperature, this imaging protocol can also noticeably reduce photo-toxicity, thus allowing imaging with higher intensities. This can be particularly useful when imaging proteins with very low expression levels. Moreover, the high mobility of the cells often requires the acquisition of multiple fields of view to follow individual cells, and the number of fields needs to be balanced against the desired time interval and exposure time.

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

The social amoebae Dictyostelium discoideum has recently been established as a system to study protein misfolding and proteostasis. Here, we describe a new imaging-based methodology to study temperature-induced protein aggregation and the cellular stress response in D. discoideum.

단백질의 품질 관리 시스템을 공부<em&gt; D. discoideum</em&gt; 온도 제어 라이브 셀 이미징을 사용하여

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we ...