이 작품은 건강 그랜트 GM 69,829의 국립 연구소에 의해 지원되었다.

1. 작용제 농도 - 반응 곡선의 측정 : 없음 제정 활동 <ol><li> 상대 작용제 K B 값의 추정 (RA I)에 대한, 적어도 두 작용제 농도 - 반응 곡선의 연속이 필요합니다. GPCR의 기능 반응에 대한 시험 관내 분석의 모든이 작용제의 농도가 제어 및 수용체 mediates의 단일 유형의 응답 수를 제공 측정할 수 있습니다. 적합 셀 기반 assays 캠프 4,7의 측정 및 재조합 수용체를 표현하는 세포 라인 inositolphosphate 축적 8,9를 포함합니다. 전체 조직 assays의 예는 평활근 10 M 2 muscarinic 수용체와 아트리움 11 왼쪽 필드 자극 쥐 수축에 β 1 - adrenoceptor - 중재 변경 수축의 측정을 포함합니다. </li><li> 매우 효과 작용제를 포함하여 분석을 위해 agonists 일련의 선택(예 : 내생 리간드). 주어진 실험에서 각 작용제에 대한 전체 농도 - 반응 곡선을 측정합니다. agonists의 수가 한 실험에서 분석을 완료하려면 너무 큰 경우 subgroups, 하나의 실험 agonists의 관리 번호로 구성된 각에 agonists를 나눕니다. 각 하급 집단 들어, (그림 3 참조) 하급 집단에있는 다른 agonists 분들과 함께 높은 효과 작용제의 농도 - 반응 곡선을 측정합니다. 6 회, 약, 데이터의 다양성에 따라 - 각 하급 집단 3에 대한 실험을 반복합니다. </li><li> 각각의 농도 - 반응 곡선을 보려면 작용제의 부재 (기저 응답)의 응답을 측정하고, 작용제의 농도 증가의 존재 인치 우주 균일하게 로그 크기마다 약 0.3에서 작용제의 농도 - 0.7 로그 10 대, 응답의 범위를 덮고 있으며 최대한의 응답 (E 최대) (그림 3 참조) 정의. experim에 대한세포 라인에 대한 엔트는 각 측정 세중의에 수행됩니다. </li><li> 작용제의 각 농도의 면전에서 측정되는 기초에서 응답을 빼기. 응답 그림 3에 꾸몄다는 이러한 방식으로 계산했다. </li></ol> 2. 작용제 농도 - 반응 곡선의 예비 분석 : 없음 제정 활동 <ol><li> 프리즘에 데이터 테이블에 농도 - 반응 실험 (예를 들어, 그림 5)에서 데이터를 입력합니다. 로그 작용제의 농도는 모두 가장 큰 전자 최대 가치를 갖고 나타나는 작용제에 대한 응답 측정이 칼럼에 입력하고 있으며, 다른 작용제 분들이 옆에 글자를 컬럼에 입력됩니다 X. 표시된 열 아래 입력합니다. 농도 - 반응 곡선의 복제 성능은 주어진 글자를 열의 하위 컬럼에 입력됩니다. </li><li> 데이터가 역모중인 그래프 시트를 선택하고 사용하여 비선형 회귀 분석하여 데이터를 분석방정식이받을 로그 (작용제) 대 응답 - 가변 슬로프 (4 매개 변수). 0으로 &quot;히프&quot;매개 변수를 제한하고, 회귀 분석을 수행합니다. (E 최대)의 &quot;상위&quot;를 복사하여 초기 매개 변수 견적의 계산에 사용하기 위해 Excel 스프레드 시트로 EC 50 매개 변수를 기록합니다. 다른 agonists는 &quot;테스트 agonists&quot;로 지정되어 있습니다 반면, 가장 큰 전자 최대 추정치와 작용제는 &quot;표준 작용제&quot;로 지정되어 있습니다. </li><li> 표준 작용제 (- 로그 EC 50 &#39;)의 부정 로그 EC 50 값이 obs 로그 τK의 초기 추정치 (LOGR1)를 계산합니다. 로그로 로그 RA 각 테스트 작용제의 전 값 (LOGRA)의 초기 추정치를 계산 {(상단 * EC 50 &#39;) / (상위&#39;* EC 50 개)} 표준 작용제의 매개 변수가 아포 스트로피로 표시된하는, . 로그 친화 죄수를 계산해당 EC 50 가치의 부정 로그로 - 테스트 agonists의 stants (LOGK5 LOGK2). </li></ol> 3. 비선형 회귀 분석을 사용하여 작용제 라이 값 추정 : 없음 제정 활동 <ol><li> 2.1 이하 위에 설명된대로 프리즘의 데이터 테이블에 데이터를 입력합니다. 표준 작용제에 대한 데이터가 A 열에 입력되어 있는지 확인 </li><li> 다섯 agonists 총 관련된 사건에 대한 그림과 같이 사용자 정의 방정식을 입력 여러 라인에 프리즘으로, &quot;RAI 로그&quot; <ul><li> &lt;a&gt;에서 P = LOGK1 </li><li> &lt;a&gt;에서 Q = LOGR </li><li> &lt;~&gt; Q = LOGR + LOGRA </li><li> &lt;B&gt; P = LOGK2 </li><li> &lt;C&gt; P = LOGK3 </li><li> &lt;D&gt; P = LOGK4 </li><li> &lt;E&gt; P = LOGK5 </li><li> Y = Msys / (1 + {[(1 10 ^ (X + P)) / (10 ^ (X + Q))] ^ M}) </li></ul></li><li> 다음과 같이 초기 매개 변수 추정을 입력하십시오 : 표준 작용제의 로그 친화 상수 (LOGK1)에 대한 0 임의로 낮은 값을 입력합니다. 의 초기 평가를 입력하세요LOGR과 친화 상수 (LOGK2 - LOGK5) 시험 agonists와 로그 라이 값 (LOGRA). 변환기의 기울기 계수 (M) 1.0의 값을 초기 예상을 지정합니다. 시스템의 최대한의 응답 (Msys) 표준 작용제 (상단 &#39;)의 전자 최대에 해당하는 값을 초기 견적을 지정합니다. </li><li> ; LOGR1, Msys와 M, 모든 데이터 집합에 대한 공유 가치, - LOGK5 및 LOGRA없고 제약 LOGK2 LOGK1 상수, 0으로 제약이있는 다음 매개 변수 제약 조건을 적용합니다. </li><li> 비선형 회귀 분석을 시작합니다. 결과는 obs 로그 K를 얻을 수 있고 시험 agonists의 로그 RA I 값. 표준 작용제가 가득 작용제있다면, 로그 K 모두 obs 및 로그 RA I 값이 정확하고 있습니다. 가장 효과 작용제 (표준 작용제)는 다음 실제로 K 부분 작용제 경우 obs 더 효과 AG의 가치onists는 과대 평가 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 로그 RA의 견적이 상황에서 아직도 정확하고 있습니다. </li><li> 회귀가 수렴하지 않는 경우, 실험자은 초기 매개 변수 추정에 의해 정의된 이론 곡선을 계획하실 수 있습니다. 데이터 포인트와 이론적 곡선 사이에 큰 편차가있다면, 초기 매개 변수 견적의 계산을 확인합니다. 하나 이상의 agonists 전자 맥스가 표준 작용제의에 해당하는 값이있다면, 그것은 obs 회귀를 위해 0으로 값이 솔루션을 추적하기 위해 로그 K를 제한해야 할 수도 있습니다. </li></ol> 4. 작용제 농도 - 반응 곡선의 측정 셀 기반 assays에서 제정 수용체​​ 활동을 전시 <ol><li> M -1, 세포가 체외 기반의 assays에 전시 제정 수용체 활동을 사용하는 절대 단위로 작용제 K B의 값을 추정하십시오. Constitutive 수용체 활동이 관심의 수용체 표현에 의한 기초 수준 이상 반응의 증가로 정의됩니다. </li><li> agonists를 선택하고 섹션 1.2에서 위에서 설명한 실험을 설계. </li><li> 각각의 농도 - 반응 곡선 들어, 비 transfected 세포의 작용제의 부재 (기초 반응) 및 관심있는 수용체 (기초 반응 + 제정 응답)로 transfected 세포의 반응을 측정합니다. 섹션 1.3 위에 설명된대로 다른 agonists의 다른 농도의 존재에 응답을 측정합니다. </li><li> 제정 수용체​​ 활동 및 측정된 응답 마이너스 수용체와 transfected하지 세포 기저 응답으로 작용제의 각 농도에 대한 응답을 계산합니다. 그림 6은 매우 낮은 제정 활동을 전시 신호 경로를 위해 이러한 방식으로 계산된 여러 agonists에 대한 답변을 보여줍니다. </li></ol> 5. 예선작용제 농도 - 반응 곡선의 alysis이 제정 활동을 전시 <ol><li> 섹션 3.1에서 설명한뿐만 아니라 -20의 로그 작용제의 농도에 해당하는 적절한 글자 열에 제정 수용체​​의 활동에 의한 응답을 입력으로 프리즘의 데이터 테이블에있는 데이터 (예를 들어, 그림 6)를 입력합니다. 대형 부정 대수는 제로의 대략적인 작용제의 농도로 입력됩니다. </li><li> 섹션 2.2에서 위에서 설명한 있지만, &quot;아래&quot;매개 변수가되도록 제약과 마찬가지로 데이터 분석 &quot;모든 데이터 집합에 대한 공유를.&quot; &#39;상위&#39;(E 최대), 공유 &quot;아래&quot;를 복사하여 초기 매개 변수 견적의 계산에 사용하기 위해 Excel 스프레드 시트에 EC50 매개 변수를 기록합니다. </li><li> 다음과 같이 초기 매개 변수 견적 계산 : 이전 3에서 설명하는 것처럼 표준 작용제 (LOGK1) 또는 전체, 테스트 작용제의 상수 로그 선호도는 별도의 실험에서 결정되어야합니다 </suP&gt;. 로그의 초기 추정치를 계산 K obs 로그 {(Top&#39; - 톱) / (EC 50 (Top&#39; - 아래))} 각 부분의 테스트 작용제의 값 (즉,이 경우에만 LOGK2)하는 &quot;아래에서 &quot;제정 수용체​​ 활성화에 의한 반응은 나타냅니다. 로그 각 작용제에 대한 로그 K B (LOGKb)의 초기 추정치를 계산 {가기 / (EC 50 아래)}. 로그로 로그 τ 치세요 (LOGTsys)의 초기 추정치를 계산 {하단 / (톱 &#39;- 아래)}. </li></ol> 6. 비선형 회귀 분석을 사용하여 제정 수용체​​의 활동을 전시 응답 작용제의 KB 값 추정 <ol><li> 3.1 이하 위에 설명된대로 프리즘의 데이터 테이블에 데이터를 입력 </li><li> 이 agonists의 상태에 대해 같이 사용자 정의 방정식을 입력 여러 라인에 프리즘으로, &quot;KB 로그&quot; <ul><li> &lt;a&gt;에서 LOGKOBS = LOGK1 </li><li> &lt;B&gt; LOGKOBS = LOGK2 </li><li> A = (10 ^ (X + LOGKOBS)) 1 </li><li> B = 10 ^ (X + LOGTSYS + LOGKB) </li><li> C = (10 ^ (LOGTSYS)) </li><li> Y = Msys / {1 + [(A / (B + C)) ^ M]} </li></ul></li><li> 다음과 같이 초기 매개 변수 추정을 입력하십시오 : 각 작용제의 친화 상수 (- 5.3 단계에 따라 결정된 값을 입력 LOGK1)를 입력합니다. obs 각 테스트 작용제의 견적을 K를 입력하십시오. agonists의 KB 견적을 입력합니다. τ 치세요 (LOGTsys) 견적 로그 입력합니다. 각각의 트랜스 듀서의 기울기 계수 (M)와 시스템의 최대한의 응답 (Msys) 1.0 및 상위 &#39;(표준 작용제의 E 최대)의 값을 할당합니다. </li><li> ; LOGK2 및 LOGKb, 아니 제약 LOGTsys, Msys와 M, 모든 데이터 집합에 대한 공유 값 : 다음과 같은 매개 변수 제약 조건을 적용합니다. </li><li> 비선형 회귀 분석을 시작합니다. 결과는 표준 작용제의 로그 K B, 로그 K obs를 얻을 수 </sub&gt; 및 일부 agonists, 그리고 시스템 (Msys), 무료 수용체 복합 (LOGTsys)에 대한 τ 치세요 값 및 운영 모델 (M)에서 변환기의 기울기 계수의 최대한의 반응의 로그 K B 값. </li><li> 회귀가 수렴하지 않는 경우, 포인트 3.6 이하 위에 설명된 단계를 따르십시오. </li></ol> 7. 대표 결과 그림 5는 안정 M 3 muscarinic 수용체 12 표현 중국어 햄스터 난소 세포에서 muscarinic 작용제 유발 phosphoinositide 가수 분해에 대한 이전에 게시된 데이터의 일부를 보여줍니다. 선택된 muscarinic agonists의 농도 - 반응 곡선이 분석에서 측정되었습니다. oxotremorine - M의 상대, 각 작용제의 K B 값을 추정 제 3 절 아래에서 위의 표현 설명된대로 데이터를 분석했다. areco, 이러한 로그 RA 제가 견적, carbachol, -0.56 ± 0.063 아르라인, -0.60 ± 0.074, pilocarpine, -1.20 ± 0.15, 그리고 McN - A - 343, -1.92 ± 0.31. 이론 곡선은 데이터 (섹션 3.2)로 회귀 방정식의 최소 제곱 적합을 나타냅니다. 시스템의 최대 응답 (M 치세요)와 변환기의 기울기 계수 (M)의 해당 견적은 53.9 ± 1.3 및 1.15 ± 0.09, 각각 있었다. 로그 K obs oxotremorine - M의 경우를 제외하고 agonists의 가치가 있었다 carbachol, 5.19 ± 0.14, arecoline, 5.49 ± 0.12, pilocarpine, 5.58 ± 0.16 및 McN - A - 343, 5.27 ± 0.33. 그림 6은 안정 G α15 3 표현 HEK 293 세포에 muscarinic 작용제 자극 phosphoinositide 가수 분해에 대한 실험의 결과를 보여줍니다. M 3 muscarinic 수용체의 과도 표현 제정 수용체 activ에 기인되었다 기저 phosphoinositide 가수 분해, 증가의 원인ity. 데이터는 제 6 항 아래에 설명되어있는대로 oxotremorine - M 및 McN - A - 343의 로그 K B 값을 추정하기 위해 분석되었다. 이 분석은 각각 oxotremorine - M 및 McN - A - 343에 대한 8.30의 로그 K B 값 ± 0.59 및 6.59 ± 0.77이 나왔고. 이론 곡선은 데이터에 회귀 방정식의 최소 제곱 적합 (제 6.2 참조)를 나타냅니다. 로그인 τ 치세요, M 치세요과 M의 추정은 -2.29 ± 0.59, 95.8 ± 2.8 및 0.72 ± 0.08, 각각 있었다. K의 예상 obs McN - A - 343의 가치는 5.35 ± 0.46했다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3179/3179fig1.jpg" /> 그림 1. 단일 수용체 활동 및 수용체 인구의 활성화의 평균 수준 간의 관계. 단일 수용체 활동, transitio를 겪고 단일 수용체의 이론적인 행동작용제의 존재에서 활약 사이 NS (ON) 및 비활성 (OFF) 상태는 표시됩니다. 활성 및 비활성 상태에 대한 작용제의 친화 상수는 각각 K B와 K으로 표시됩니다. 인구 행동 작용제의 존재에 활성 및 비활성 상태 사이의 임의의 전환을 진행하는 여러 수용체의 이론적인 행동. 인구 보여집니다 평균은 작용제의 특정 농도의 존재에 수용체의 인구 수용체 활성화의 평균 수준 표시됩니다. 수용체 인구의 활성화 수준은 자극으로 알려져 있습니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3179/3179fig2.jpg" /> 그림 2. 수용체 활성화 기능과 효능 (ε)과 작용제. 인구 평균 관찰 친화 상수 (K obs) 사이의 관계의 평균 수준수용체 활성화 작용제의 농도를 증가 것은 표시 의해 elicited. 수용체 활성화를 수용체 활성화의 평균 수준은 작용제 작용제의 로그 농도 꾸몄다입니다. 절반 최대한의 수용체 활성화에 필요한 작용제의 부정 로그 농도는 작용제 (로그 K obs)의 지속적인 로그 관찰 친화력하는 것과 동일합니다. 수용체 활성화 함수의 최대 효능 (ε)로 표시된 것입니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3179/3179fig3.jpg" /> 그림 3. 인간 M 3 muscarinic 수용체를 표현 중국어 햄스터 난소 세포의 다양한 muscarinic agonists에 의한 [3 H] inositolphosphate 축적의 자극에 대한 농도 - 반응 곡선의 예. 구 작용제 농도 - 반응 곡선의 총 측정되었습니다. 실험은 두 부분으로 나눌 수 있습니다. 각 부분 들어, 표준 작용제 (oxotremorinEM)은 언제나 추가 agonists와 함께 테스트됩니다. 따라서, 표시 유형의 두 실험은 A와 B 겨우 다섯 agonists는 한번에 assayed 수있다면 구 agonists의 농도 - 반응 곡선을 측정해야합니다. 데이터 Ehlert 외에서 있습니다. 12. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3179/3179fig4.jpg" /> 그림 4. 인간이 muscarinic 수용체 M과 G α15을 표현하는 HEK 293 세포에서 다양한 muscarinic agonists에 의한 [3 H] inositolphosphate 축적의 자극에 대한 농도 - 반응 곡선의 예. M 2 수용체 표현 30을 일으킨 - 제정 수용체의 활동에 기인했다 35% [3 H] inositolphosphate 응답. 데이터 Ehlert 외에서 있습니다. 12. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/3179/3179fig5.jpg" /> 그림 5. </중국어 햄스터 난소 세포에서 강한&gt; Muscarinic 작용제 - 중재 phosphoinositide 가수 분해가 안정적으로 인간 M 3 muscarinic 수용체를 표현. 자극 phosphoinositide 가수 분해에 대해 선택한 muscarinic agonists의 농도 - 반응 곡선이 표시됩니다. 세 실험에서 값을 평균 ± SEM이 표시됩니다. 데이터 Ehlert 외에서 있습니다. 12. <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/3179/3179fig6.jpg" /> 그림 6. Oxotremorine - M과 G α15 및 M 3 muscarinic 수용체를 표현하는 HEK 293 세포에 McN - A - 343 - 중재 phosphoinositide 가수 분해. Phosphoinositide 가수 분해는 oxotremorine - M의 전자 최대에 상대적으로 표시됩니다. 작용제의 부재에서 phosphoinositide 가수 분해는 M 3 수용체 응답의 약 2 %를 차지한다 표현에 기인. 세 실험 ± SEM의 수단이 표시됩니다. DATA는 Ehlert 외에서 있습니다. 3.

<ol>
	<li>Stephenson, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modification+of+receptor+theory.">A modification of receptor theory.</a> British Journal of Pharmacology. 11, 379-393 (1956).</li><li>Furchgott, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+b-haloalkylamines+in+the+differentiation+of+receptors+and+in+the+determination+of+dissociation+constants+of+receptor-agonist+complexes.">The use of b-haloalkylamines in the differentiation of receptors and in the determination of dissociation constants of receptor-agonist complexes.</a> Advances in Drug Research. 3, 21-55 (1966).</li><li>Ehlert, F. J., Suga, H., Griffin, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+agonism+and+inverse+agonism+in+functional+assays+with+constitutive+activity:+Estimation+of+orthosteric+ligand+affinity+constants+for+active+and+inactive+receptor+states.">Analysis of agonism and inverse agonism in functional assays with constitutive activity: Estimation of orthosteric ligand affinity constants for active and inactive receptor states.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 33, 671-686 (2011).</li><li>Griffin, M. T., Figueroa, K. W., Liller, S., Ehlert, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+Agonist+Activity+at+G+Protein-Coupled+Receptors:+Analysis+of+M2+Muscarinic+Receptor+Signaling+through+Gi/o,Gs,+and+G15.">Estimation of Agonist Activity at G Protein-Coupled Receptors: Analysis of M2 Muscarinic Receptor Signaling through Gi/o,Gs, and G15.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 321, 1193-1207 (2007).</li><li>Black, J. W., Leff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Operational+models+of+pharmacological+agonism.">Operational models of pharmacological agonism.</a> Proceedings of the Royal Society of LondonSeries B: Biological Sciences. 220, 141-162 (1983).</li><li>Tran, J. A., Chang, A., Matsui, M., Ehlert, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+relative+microscopic+affinity+constants+of+agonists+for+the+active+state+of+the+receptor+in+functional+studies+on+M2+and+M3+muscarinic+receptors.">Estimation of relative microscopic affinity constants of agonists for the active state of the receptor in functional studies on M2 and M3 muscarinic receptors.</a> Mol. Pharmacol. 75, 381-396 (2009).</li><li>Schultz, J., Hamprecht, B., Daly, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+adenosine+3':5'-cyclic+monophosphate+in+clonal+glial+cells:+labeling+of+intracellular+adenine+nucleotides+with+radioactive+adenine.">Accumulation of adenosine 3':5'-cyclic monophosphate in clonal glial cells: labeling of intracellular adenine nucleotides with radioactive adenine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69, 1266-1270 (1972).</li><li>Berridge, M. J., Downes, C. P., Hanley, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lithium+amplifies+agonist-dependent+phosphatidylinositol+responses+in+brain+and+salivary+glands.">Lithium amplifies agonist-dependent phosphatidylinositol responses in brain and salivary glands.</a> Biochemical Journal. 206, 587-595 (1982).</li><li>Kendall, D. A., Hill, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Neurotransmitter Receptor Analysis. , 68-87 (1990).</li><li>Pulido-Rios, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitro+Isolated+Tissue+Functional+Muscarinic+Receptor+Assays.">Vitro Isolated Tissue Functional Muscarinic Receptor Assays.</a> Current Protocols in Pharmacology. 48, 4-15 (2010).</li><li>Kenakin, T., Enna, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current Protocols in Pharmacology. , (2001).</li><li>Ehlert, F. J., Griffin, M. T., Sawyer, G. W., Bailon, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=simple+method+for+estimation+of+agonist+activity+at+receptor+subtypes:+comparison+of+native+and+cloned+M3+muscarinic+receptors+in+guinea+pig+ileum+and+transfected+cells.">simple method for estimation of agonist activity at receptor subtypes: comparison of native and cloned M3 muscarinic receptors in guinea pig ileum and transfected cells.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 289, 981-992 (1999).</li><li>Burstein, E. S., Spalding, T. A., Brann, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacology+of+muscarinic+receptor+subtypes+constitutively+activated+by+G+proteins.">Pharmacology of muscarinic receptor subtypes constitutively activated by G proteins.</a> Mol. Pharmacol. 51, 312-319 (1997).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

RA I (상대 K B 값)을 계산하는 우리의 방법은 작용제 농도 - 반응 곡선의 측정을 필요로하기 때문에이 곡선이 측정 언제든지, 우리의 분석을 할 수 있습니다. 실험 준비 (예 : 세포 또는 조직)의 응답에 매일 변동이 큰 경우, 각각의 농도 - 반응 곡선의 응답 성능은의 표준 작용제의 &quot;상위&quot;추정 상대적 정상화 수있는 매일 매일의 실험. 상?...

quantifying agonist activity at g protein-coupled receptors

작용제는 G 단백질 결합 수용체 (GPCRs)의 인구를 활성화하면 세포 또는 조직의 반응에 culminates 신호 경로를 elicits. 이 과정은 하나의 수용체, 수용체의 인구, 또는 스트림 응답의 수준에서 분석할 수 있습니다. 여기 하나의 수용체의 활성 상태에 대한 지속적인 작용제 선호도의 추정치를 얻을 수있는 스트림 응답을 분석하는 방법을 설명합니다. 수용체는 quantal 스위치로 동작되는 활성 및 비활성 상태 (그림 1) 사이의 대체. 활성 상태가 특정 G 단백질 신호 또는 기타 파트너와 상호 작용합니다. 리간드의 부재에서 비활성 상태 predominates. 작용제의 바인딩은 활성 상태 (K B)에 대한 상수의 친화력은 비활성 상태 (K)에 대한보다 훨씬 더 때문에 수용체가 활성 상태로 전환됩니다 그 확률을 증가시킵니다. 의 요약인구에있는 수용체의 모든 임의의 출력 시간 수용체 활성화의 일정 수준을 산출. 절반 최대한 수용체 활성을 도출 작용제의 농도의 상호는 관찰 친화 상수 (K obs)에 해당되며, 활성 상태로 작용제 - 수용체 단지의 분율은 효능 (ε) (그림 2)로 정의됩니다. GPCRs의 스트림 응답을 분석하는 방법은 K obs 및 작용제의 1,2의 상대적 효능의 견적을 설정하는 것이 개발되었습니다. 이 보고서에서는, 우리는 다른 작용제의 상대 작용제 K B 값을 추정이 분석을 수정하는 방법을 보여줍니다. 제정 활동을 전시 assays 위해, 우리는 M -1 절대 단위로 K B를 추정하는 방법을 보여줍니다. 작용제 농도 - 반응 곡선 3,4을 분석 우리의 방법으로 구성되어 있습니다운영 모델 5를 사용하고 글로벌 비선형 회귀니다. 우리는 소프트웨어 응용 프로그램, 프리즘 (GraphPad 소프트웨어, 주식, 샌디에고, CA)을 사용하여 프로 시저를 설명합니다. 분석 K의 제품 obs과 효능 (τ)에 비례 매개 변수 견적을 산출. 다른의에 의해 조각나 작용제의 τK obs,의 추정치는 K B의 상대 측정 (RA I) 6입니다. 제정 활동을 전시하는 수용체에 대한, 그것은 무료 수용체 복합의 효능 (τ 치세요)에 비례 매개 변수를 추정하는 것이 가능합니다. 이 경우, 작용제의 K B 값은 τK obs / τ 치세요 3 동일합니다. 우리의 방법은 수용체 subtypes에 대한 작용제의 선택도를 결정하고 다른 G 단백질을 통해 작용제 - 수용체의 신호를 quantifying하는 데 유용합니다.

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Agonist Activity at G Protein-coupled Receptors at JoVE.com

Quantifying Agonist Activity at G Protein-coupled Receptors

활성 상태 작용제의 친화력이 상수 계산하는 방법 (<em&gt; K<sub&gt; B</sub</em&gt;) G 단백질 결합 수용체의이 설명되어 있습니다. 분석의 절대 또는 상대 조치를 제공합니다<em&gt; K<sub&gt; B</sub</em&gt; 제정 수용체​​ 활성화는 측정 여부에 따라 다릅니다. 우리의 방법은 수용체 활성화 다양한 응답 스트림에 적용됩니다.

G 단백질 결합 수용체에 작용제 활동 Quantifying

When an agonist activates a population of G protein-coupled receptors (GPCRs), it elicits a signaling pathway that culminates in the response of the cell ...

quantifying-agonist-activity-at-g-protein-coupled-receptors

Research

JoVE Journal

Biology

18.2K 조회수.  University of California, Irvine. 활성 상태 작용제의 친화력이 상수 계산하는 방법 ( K B

비디오: Quantifying Agonist Activity at G Protein-coupled Receptors

Dopamine Release at Individual Presynaptic Terminals Visualized with FFNs

The nervous system transmits signals between neurons via neurotransmitter release during synaptic vesicle fusion. To observe neurotransmitter uptake and release from individual presynaptic terminals directly, we designed fluorescent false neurotransmitters as substrates for the synaptic vesicle monoamine transporter. Using these probes to image dopamine release in the striatum, we made several observations pertinent to synaptic plasticity. We found that the fraction of synaptic vesicles releasing neurotransmitter per stimulus was dependent on the stimulus frequency. A kinetically distinct "reserve" synaptic vesicle population was not observed under these experimental conditions. A frequency-dependent heterogeneity of presynaptic terminals was revealed that was dependent in part on D2 dopamine receptors, indicating a mechanism for frequency-dependent coding of presynaptic selection.

Hui Zhang and Niko G. Gubernator contributed equally to this work.

A new means to measure neurotransmission optically using fluorescent dopamine analogs.

개인 Presynaptic 터미널에서 도파민 릴리스 FFNs와 시각

The nervous system transmits signals between neurons via neurotransmitter release during synaptic vesicle fusion. To observe neurotransmitter uptake and ...

연구

생물학

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial applications as well as increases basic fundamental biological knowledge. F&ouml;rster (Fluorescence) Resonance Energy Transfer (FRET) between a donor molecule in an electronically excited state and a nearby acceptor molecule has been frequently utilized for studies of protein-protein interactions in living cells. The proteins of interest are tagged with two different types of fluorescent probes and expressed in biological cells. The fluorescent probes are then excited, typically using laser light, and the spectral properties of the fluorescence emission emanating from the fluorescent probes is collected and analyzed. Information regarding the degree of the protein interactions is embedded in the spectral emission data. Typically, the cell must be scanned a number of times in order to accumulate enough spectral information to accurately quantify the extent of the protein interactions for each region of interest within the cell. However, the molecular composition of these regions may change during the course of the acquisition process, limiting the spatial determination of the quantitative values of the apparent FRET efficiencies to an average over entire cells. By means of a spectrally resolved two-photon microscope, we are able to obtain a full set of spectrally resolved images after only one complete excitation scan of the sample of interest. From this pixel-level spectral data, a map of FRET efficiencies throughout the cell is calculated. By applying a simple theory of FRET in oligomeric complexes to the experimentally obtained distribution of FRET efficiencies throughout the cell, a single spectrally resolved scan reveals stoichiometric and structural information about the oligomer complex under study. Here we describe the procedure of preparing biological cells (the yeast Saccharomyces cerevisiae) expressing membrane receptors (sterile 2 &alpha;-factor receptors) tagged with two different types of fluorescent probes. Furthermore, we illustrate critical factors involved in collecting fluorescence data using the spectrally resolved two-photon microscopy imaging system. The use of this protocol may be extended to study any type of protein which can be expressed in a living cell with a fluorescent marker attached to it.

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

By employing a spectrally resolved two-photon microscopy imaging system, pixel-level maps of F&ouml;rster Resonance Energy Transfer (FRET) efficiencies are obtained for cells expressing membrane receptors hypothesized to form homo-oligomeric complexes. From the FRET efficiency maps, we are able to estimate stoichiometric information about the oligomer complex under study.

Spectrally 해결된 두 광자 현미경을 사용하여 G 단백질 결합 수용체 상호 작용의 생체내 부량에서

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial ...

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1. This guided cell migration is referred as chemotaxis, which is essential for various cells to carry out their functions such as trafficking of immune cells and patterning of neuronal cells 2, 3. A large family of G-protein coupled receptors (GPCRs) detects variable small peptides, known as chemokines, to direct cell migration in vivo 4. The final goal of chemotaxis research is to understand how a GPCR machinery senses chemokine gradients and controls signaling events leading to chemotaxis. To this end, we use imaging techniques to monitor, in real time, spatiotemporal concentrations of chemoattractants, cell movement in a gradient of chemoattractant, GPCR mediated activation of heterotrimeric G-protein, and intracellular signaling events involved in chemotaxis of eukaryotic cells 5-8. The simple eukaryotic organism, Dictyostelium discoideum, displays chemotaxic behaviors that are similar to those of leukocytes, and D. discoideum is a key model system for studying eukaryotic chemotaxis. As free-living amoebae, D. discoideum cells divide in rich medium. Upon starvation, cells enter a developmental program in which they aggregate through cAMP-mediated chemotaxis to form multicullular structures. Many components involved in chemotaxis to cAMP have been identified in D. discoideum. The binding of cAMP to a GPCR (cAR1) induces dissociation of heterotrimeric G-proteins into G&gamma; and G&beta;&gamma; subunits 7, 9, 10. G&beta;&gamma; subunits activate Ras, which in turn activates PI3K, converting PIP2 into PIP3 on the cell membrane 11-13. PIP3 serve as binding sites for proteins with pleckstrin Homology (PH) domains, thus recruiting these proteins to the membrane 14, 15. Activation of cAR1 receptors also controls the membrane associations of PTEN, which dephosphorylates PIP3 to PIP2 16, 17. The molecular mechanisms are evolutionarily conserved in chemokine GPCR-mediated chemotaxis of human cells such as neutrophils 18. We present following methods for studying chemotaxis of D. discoideum cells. 1. Preparation of chemotactic component cells. 2. Imaging chemotaxis of cells in a cAMP gradient. 3. Monitoring a GPCR induced activation of heterotrimeric G-protein in single live cells. 4. Imaging chemoattractant-triggered dynamic PIP3 responses in single live cells in real time. Our developed imaging methods can be applied to study chemotaxis of human leukocytes.

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Here, we describe detailed live cell imaging methods for investigating chemotaxis. We present fluorescence microscopic methods to monitor spatiotemporal dynamics of signaling events in migrating cells. Measurement of signaling events permits us to further understand how a GPCR-signaling network achieves gradient sensing of chemoattractants and controls directional migration of eukaryotic cells.

이미징 G - 단백질 결합 수용체 (GPCR) - 중재 신호 행사 그 제어 Chemotaxis Dictyostelium Discoideum</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce informative probes or labels into expressed receptors that do not perturb receptor function. We used amber codon suppression technology to genetically-encode the unnatural amino acid, p-azido-L-phenylalanine (azF) at various targeted positions in GPCRs heterologously expressed in mammalian cells. The versatility of the azido group is illustrated here in different applications to study GPCRs in their native cellular environment or under detergent solubilized conditions. First, we demonstrate a cell-based targeted photocrosslinking technology to identify the residues in the ligand-binding pocket of GPCR where a tritium-labeled small-molecule ligand is crosslinked to a genetically-encoded azido amino acid. We then demonstrate site-specific modification of GPCRs by the bioorthogonal Staudinger-Bertozzi ligation reaction that targets the azido group using phosphine derivatives. We discuss a general strategy for targeted peptide-epitope tagging of expressed membrane proteins in-culture and its detection using a whole-cell-based ELISA approach. Finally, we show that azF-GPCRs can be selectively tagged with fluorescent probes. The methodologies discussed are general, in that they can in principle be applied to any amino acid position in any expressed GPCR to interrogate active signaling complexes.

We genetically-encode the unnatural amino acid, p-azido-L-phenylalanine at various targeted positions in GPCRs and show the versatility of the azido group in different applications. These include a targeted photocrosslinking technology to identify residues in the ligand-binding pocket of a GPCR, and site-specific bioorthogonal modification of GPCRs with a peptide-epitope tag or fluorescent probe.

유전자 인코딩 분자 프로브는 G 단백질 결합 수용체를 연구하는

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce ...

Characterization of G Protein-coupled Receptors by a Fluorescence-based Calcium Mobilization Assay

For more than 20 years, reverse pharmacology has been the preeminent strategy to discover the activating ligands of orphan G protein-coupled receptors (GPCRs). The onset of a reverse pharmacology assay is the cloning and subsequent transfection of a GPCR of interest in a cellular expression system. The heterologous expressed receptor is then challenged with a compound library of candidate ligands to identify the receptor-activating ligand(s). Receptor activation can be assessed by measuring changes in concentration of second messenger reporter molecules, like calcium or cAMP. The fluorescence-based calcium mobilization assay described here is a frequently used medium-throughput reverse pharmacology assay. The orphan GPCR is transiently expressed in human embryonic kidney 293T (HEK293T) cells and a promiscuous G&#945;16 construct is co-transfected. Following ligand binding, activation of the G&#945;16 subunit induces the release of calcium from the endoplasmic reticulum. Prior to ligand screening, the receptor-expressing cells are loaded with a fluorescent calcium indicator, Fluo-4 acetoxymethyl. The fluorescent signal of Fluo-4 is negligible in cells under resting conditions, but can be amplified more than a 100-fold upon the interaction with calcium ions that are released after receptor activation. The described technique does not require the time-consuming establishment of stably transfected cell lines in which the transfected genetic material is integrated into the host cell genome. Instead, a transient transfection, generating temporary expression of the target gene, is sufficient to perform the screening assay. The setup allows medium-throughput screening of hundreds of compounds. Co-transfection of the promiscuous G&#945;16, which couples to most GPCRs, allows the intracellular signaling pathway to be redirected towards the release of calcium, regardless of the native signaling pathway in endogenous settings. The HEK293T cells are easy to handle and have proven their efficacy throughout the years in receptor deorphanization assays. However, optimization of the assay for specific receptors may remain necessary.

The here described fluorescence-based calcium mobilization assay is a medium-throughput reverse pharmacology screening system for the identification of functionally activating ligand(s) of orphan G protein-coupled receptors (GPCRs).

형광 기반의 칼슘 동원 분석에 의해 G 단백질 결합 수용체의 특성

For more than 20 years, reverse pharmacology has been the preeminent strategy to discover the activating ligands of orphan G protein-coupled receptors ...

Visualizing Clathrin-mediated Endocytosis of G Protein-coupled Receptors at Single-event Resolution via TIRF Microscopy

Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological assays, measuring global changes in endocytosis, have identified over 30 known components participating in CME, and biochemical studies have generated an interaction map of many of these components. It is becoming increasingly clear, however, that CME is a highly dynamic process whose regulation is complex and delicate. In this manuscript, we describe the use of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize the dynamics of components of the clathrin-mediated endocytic machinery, in real time in living cells, at the level of individual events that mediate this process. This approach is essential to elucidate the subtle changes that can alter endocytosis without globally blocking it, as is seen with physiological regulation. We will focus on using this technique to analyze an area of emerging interest, the role of cargo composition in modulating the dynamics of distinct clathrin-coated pits (CCPs). This protocol is compatible with a variety of widely available fluorescence probes, and may be applied to visualizing the dynamics of many cargo molecules that are internalized from the cell surface.

Clathrin-mediated endocytosis, a rapid and highly dynamic process internalizes many proteins, including signaling receptors. The protocol described here directly visualizes the kinetics of individual endocytic events. This is essential for understanding how core members of the endocytic machinery coordinate with each other, and how protein cargo influence this process.

TIRF 현미경을 통해 단일 ​​이벤트 해상도에서 G 단백질 결합 수용체의 Clathrin 매개 엔도 시토 시스를 시각화

Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological ...

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 (Kir4.1)

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a cytosine-guanine dinucleotide. While DNA methylation provides long-lasting and stable changes in gene expression, patterns and levels of DNA methylation are also subject to change based on a variety of signals and stimuli. As such, DNA methylation functions as a powerful and dynamic regulator of gene expression. The study of neuroepigenetics has revealed a variety of physiological and pathological states that are associated with both global and gene-specific changes in DNA methylation. Specifically, striking correlations between changes in gene expression and DNA methylation exist in neuropsychiatric and neurodegenerative disorders, during synaptic plasticity, and following CNS injury. However, as the field of neuroepigenetics continues to expand its understanding of the role of DNA methylation in CNS physiology, delineating causal relationships in regards to changes in gene expression and DNA methylation are essential. Moreover, in regards to the larger field of neuroscience, the presence of vast region and cell-specific differences requires techniques that address these variances when studying the transcriptome, proteome, and epigenome. Here we describe FACS sorting of cortical astrocytes that allows for subsequent examination of a both RNA transcription and DNA methylation. Furthermore, we detail a technique to examine DNA methylation, methylation sensitive high resolution melt analysis (MS-HRMA) as well as a luciferase promoter assay. Through the use of these combined techniques one is able to not only explore correlative changes between DNA methylation and gene expression, but also directly assess if changes in the DNA methylation status of a given gene region are sufficient to affect transcriptional activity.

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 Kir4.1

DNA methylation is capable of maintaining stable levels of gene expression as well as allowing for dynamic changes in gene expression in response to a variety of stimuli. We detail techniques that allow the study of gene-specific changes in DNA methylation and the effect of these changes on gene expression.

유전자 특이 발현과 DNA 메틸화 변화와 성상 세포의 전사 활동의 상관 관계<em&gt; KCNJ10</em&gt; (Kir4.1)

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a ...

Comparative Analysis of Human Growth Hormone in Serum Using SPRi, Nano-SPRi and ELISA Assays

Sensitive and selective methods for the detection of human growth hormone (hGH) over a wide range of concentrations (high levels of 50-100 ng ml&#8722;1 and minimum levels of 0.03 ng ml&#8722;1) in circulating blood are essential as variable levels may indicate altered physiology. For example, growth disorders occurring in childhood can be diagnosed by measuring levels of hGH in blood. Also, the misuse of recombinant hGH in sports not only poses an ethical issue it also presents serious health threats to the abuser. One popular strategy for measuring hGH misuse, relies on the detection of the ratio of 22 kDa hGH to total hGH, as non-22 kDa endogenous levels drop after exogenous recombinant hGH (rhGH) administration. Surface plasmon resonance imaging (SPRi) is an analytical tool that allows direct (label-free) monitoring and visualization of biomolecular interactions by recording changes of the refractive index adjacent to the sensor surface in real time. In contrast, the most frequently used colorimetric method, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) uses enzyme labeled detection antibodies to indirectly measure analyte concentration after the addition of a substrate that induces a color change. To increase detection sensitivity, amplified SPRi uses a sandwich assay format and near infrared quantum dots (QDs) to increase signal strength. After direct SPRi detection of recombinant rhGH in spiked human serum, the SPRi signal is amplified by the sequential injection of detection antibody coated with near-infrared QDs (Nano-SPRi). In this study, the diagnostic potential of direct and amplified SPRi was assessed for measuring rhGH spiked in human serum and compared directly with the capabilities of a commercially available ELISA kit.

The proposed work assesses the diagnostic potential of direct and amplified surface plasmon resonance imaging (SPRi) assays, particularly for the detection of recombinant human growth hormone in spiked human serum, by comparing SPRi results directly with commercially available enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit.

SPRI, 나노 SPRI 및 ELISA 분석 실험을 사용하여 혈청에있는 인간 성장 호르몬의 비교 분석

Sensitive and selective methods for the detection of human growth hormone (hGH) over a wide range of concentrations (high levels of 50-100 ng ml&#8722;1 ...

Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many physiological processes, such as embryogenesis, neuron patterning, metastasis of cancer cells, recruitment of neutrophils to sites of inflammation, and the development of the model organism Dictyostelium discoideum. Eukaryotic cells sense chemo-attractants using G protein-coupled receptors. Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

이미징 G의 호중구와 같은 HL60 세포에서 화성과 시그널링 이벤트 수용체가 매개 단백질 결합

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many ...

Detection of Ligand-activated G Protein-coupled Receptor Internalization by Confocal Microscopy

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent fusion proteins, such as green fluorescent protein (GFP), to determine their expression, localization, and function. The subcellular localization of target proteins is important for identification, characterization, and functional analyses. Internalization is one of the predominant mechanisms controlling G protein-coupled receptor (GPCR) signaling to ensure the appropriate cellular responses to stimuli. Here, we describe an experimental method to detect the subcellular localization and internalization of GPCR in HEK293 cells with confocal microscopy. In addition, this experiment provides some details about cell culture and transfection. This protocol is compatible with a variety of widely available fluorescent markers and is applicable to the visualization of the subcellular localization of a majority of proteins, as well as of the internalization of GPCR. This technique should enable researchers to efficiently manipulate GPCR gene expression in mammalian cell lines and should facilitate studies on GPCR subcellular localization and internalization.

This protocol describes confocal microscopy detection of G protein-coupled receptor (GPCR) internalization in mammalian cells. It includes the basic cell culture, transfection, and confocal microscopy procedure and provides an efficient and easily interpretable method to detect the subcellular localization and internalization of fusion-expressed GPCR.

공 초점 현미경으로 리간드 - 활성화 된 G 단백질 결합 수용체 내재화 검출

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent ...