우리는 몇 가지 기초 및 자선 기증자의 관대 한 지원을 (SakmarLab.org 참조) 감사합니다.

1. GPCR에에 부 자연스러운 아미노산의 사이트 별 유전 설립 <ol><li> 5 % CO 2 분위기에서 37 ° C에서 10 % 태아 소 혈청 (FBS)이 보충 된 DMEM에서 HEK293T 세포 (포도당 4.5 g / L, 2 mM의 글루타민)을 유지한다. </li><li> 리포 펙 타민 플러스 시약을 사용하여 10-cm 접시에서 60-80% 합류로 성장 된 세포를 형질. <ol><li> 750 μL의 DMEM에, 원하는 위치에 황색 정지 코돈을 포함하는 10 ㎕의 플러스 시약, GPCR의 cDNA 3.5 μg (pMT4. RHO 또는 pcDNA를 3.1. CCR5), 3.5 회로의 tRNA의 cDNA (pSVB.Yam) ㎍의 0.35 μg을 추가 P-아지도-L-페닐알라닌 (pcDNA.RS)에 대한 돌연변이 아미노 아실 tRNA의 합성 효소의 cDNA. 15 분 동안 실온에서 배양한다. 또한 제어 역할을 중량 GPCR의 cDNA (앰버 정지 코돈을 함유하지 않는)를 사용하여 유사한 형질 전환을 수행한다. 17 μL의 리포 펙 타민과 DMEM 750 μL에이 혼합물을 추가합니다. 실온에서 15 분 동안 평형화 한 후 가져4 ML에 전체 볼륨. </li><li> 10 cm의 접시에 대기음 매체는 세포에 형질 전환 혼합물을 적용하고, CO 2 분위기 5 %에서 37 ° C로 돌아갑니다. 4-6 시간 후, 20 % FBS와 1 ㎜ AZF을 포함하는 4 ML DMEM으로 세포를 보충합니다. </li></ol></li><li> 다음 날, DMEM 10 % FBS와 0.5 ㎜ AZF을 포함로 성장 매체를 교체하십시오. </li><li> 수확 세포를 48 시간 후 형질 발현을 분석하거나 다음 절에서 설명 광 가교 또는 라벨링 절차를 진행합니다. <ol><li> 성장 미디어의 UAA의 존재에 GPCR 호박 돌연변이의 발현을 확인합니다. 우리는 서부 면역 블롯 검출하여이 작업을 수행. 를 Lyse 1 %의 세포 펠렛 (W / V) 20 MM 트리스 - 염산, pH의 도데 실-β-D-말토 (DDM) 7.5, 4 ℃에서 1 시간 동안 100 ㎜의 NaCl 16,000 XG에서 해물을 원심 분리기 및 SDS-PAGE에 의해 환원 조건에서 뜨는을 해결할 수 있습니다. PVDF 막에 옮기고 일을 사용하여 전체 길이의 수용체 발현을 검출하기 위해 면역 블롯 분석을 수행수용체의 C-말단에 설계 에피토프를 인식 전자는 1d4 단클론 항체 (국립 세포 배양 센터). 31 </li></ol></li></ol> 2. 표적 광 가교를 사용하여 리간드 결합 부위를 매핑 <ol><li> 48 시간 사후 형질 세포에서 미디어를 대기음 4 ML 1X 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)로 교체. 15 분 동안 37 ° C로 돌아갑니다. </li><li> 1X PBS로 세포를 재현 탁하고 팔콘 튜브에 전송할 수 있습니다. 펠릿 세포 상층 액을 흡인하기 위해 2 분 동안 1,500 rpm으로 원심 분리기. </li><li> 20 mM의 HEPES, pH가 7.5, 0.2 % BSA 및 수용체 - 리간드 복합체 형성을 보장하기 위해 시간과 온도의 필요한 길이에 대한 바인딩 농도가 포화에 삼중 리간드를 함유하는 1X 행크 완충 소금물에서 세포 펠렛을 재현 탁. </li><li> 4 ℃에서 15 분 동안 (예를 들어, UV-A 램프를 사용하여) 365 nm에서 AZF의 photoactivation의 24도 또는 96 - 웰 플레이트에 세포 현탁액을 전송 MaintaiN 얼음에 접시 샘플 가열 및 세포 용해를 방지 할 수 있습니다. </li><li> 펠릿 세포 에펜 도르프 튜브, 원심 분리기에 세포를 전송하고, 상층 액을 제거하고 분석을 진행합니다. 펠릿은 향후 사용을 위해 -20 ° C에 저장할 수 있습니다. </li><li> (w / v) DDM, 20 mM 트리스-HCl, pH7.5 및 프로테아제 억제제 1 %를 함유하는 용해 버퍼에서 세포 펠렛을 재현 탁. 4 ° C에서 1 시간 배양 한 후, 16,000 XG에 10 분 동안 세포 용 해물을 원심 분리, 새로운 튜브에 뜨는을 전송합니다. </li><li> 상층 액에 1d4 개 단클론 항체 - 세 파로스 2B 수지를 추가하고 설계 C-말단는 1d4 단클론 항체의 항원을 사용하여 GPCR을 immunopurify 4 ° C에서 밤새 품어. 다음날 용해 버퍼와 비즈를 여러 번 씻는다. 동요와 함께 1 시간 동안 37 ° C에서 1 % SDS와 용출 샘플. </li><li> 15 ㎖의 바이알 함유 신틸레이션 유체 용출액의 일부를 전송하고 일까지 삼중 리간드의 특이 적 결합의 양을 정량화하는 베타 섬광 계수기 의지전자 수용체. </li><li> 표준 겔 전기 영동에 의해 나머지는 1d4 단클론 항체 정제 리제를 해결합니다. 우리는 4 내지 12 % SDS-PAGE 젤과 면역 블롯을위한 PVDF 막에 다음 세미​​ 드라이 전송을 사용합니다. 우리는 또한 분자량의 시각적 접근을 안내하는 표준 단백질 사다리 레인이 (가) 있습니다. <ol><li> 0.05 % 트윈 -20을 함유하는 TBS 버퍼에 5 % 우유로 PVDF 멤브레인을 차단. HRP - 복합 항 - 마우스 IgG 이차 항체 다음 1d4 개 단클론 항체와 전체 길이 수용체 발현을 확인하기 위해 멤브레인을 조사. </li><li> 강화 된 화학 발광 (ECL) 시약과 치료와 밴드를 시각화하기 위해 필름을 오토 라디오 그래피 멤브레인을 노출합니다. </li></ol></li><li> 특정 분자량 마커에서 절단하여 다음 각 샘플 차선을 분리하는 면도날로 막을 잘라. 섬광 액체가 들어있는 유리 병에 막 세그먼트를 전송합니다. 베타 섬광 계수기에서 계수함으로써 각각의 막 세그먼트에서 삼중 수소의 양을 정량화. </li><li> 긍정적를 확인GPCR과 리간드의의 합과 동일 겉보기 분자 질량에서 삼중 수소의 검출과 photocrosslink. </li></ol> 3. 에피토프 태그 지정 및 세포 표면 효소 결합 면역 분석 (ELISA)을 대상으로 <ol><li> 24 시간 후 형질, PBS 1X 1 ㎖로 세포를 씻어 3 분 1 ㎖의 0.25 %의 트립신를 Trypsinize. 10 % FBS와 0.5 ㎜ AZF를 포함 9 ML DMEM으로 보충합니다. 세포를 재현 탁하고 세포 밀도를 계산. 우리는 표준 혈구를 사용합니다. </li><li> 0.01 ㎎ / 웰 당 ML 폴리 - D - 라이신 100 ㎖와 높은 결합, 분명 바닥 96 - 웰 플레이트를 사전 처리합니다. 1X PBS 및 공기 건조를 반복하여 세척하고 실온에서 30 분 동안 배양한다. </li><li> 플레이트 (200) 6 × 10 4의 밀도에서 형질 세포의 μL - 8 × 10 4 세포 / 잘 96 - 웰 플레이트에와 CO 2 분위기 5 %에서 37 ° C로 돌아갑니다. </li><li> 다음날 라벨에 대한 세포를 준비합니다. 부드럽게 100 μL / 잘 1X PBS의 T로 3 회 세척O 모든 AZF 포함 성장 미디어를 제거합니다. 세포는 PBS는 칼슘 2 + 2 + 및 Mg를 함유하여, 예를 들어, 부착 상태를 유지하도록. </li><li> PBS에 5 ~ 20 ㎜로 유지되는 주식에서 1X HBSS / PBS에서 50 ~ 200 μM FLAG-트리 아릴 포스의 표지 시약을 준비합니다. 각 웰 (각 호박 돌연변이에 대한 세중) 60 ML을 적용하고 30 분 내지 4, 37 ° C로 돌아갑니다. 1X HBSS / PBS에 라벨 처리하지 않고 우물의 집합을 유지합니다. 또한 AZF - GPCR의 변형과 비교하는 중량 GPCR 컨트롤을 포함. </li><li> 잘 차단 버퍼 100 μL /와 세포에게 3 번 씻으, BB (1X PBS, 0.5 % BSA)는, 완전 반응 라벨을 제거합니다. </li><li> 세포 100 μL / 잘 (1X PBS에서 16 %의 주식에서 준비) 4 % 파라 포름 알데히드를 적용합니다. 실온에서 20 분 동안 배양한다. BB로 3 회 씻는다. </li><li> 표지 된 수용체 및 수용체의 발현을 검출하기 위해 표준 세포 표면 ELISA 프로토콜을 수행한다. 차 뒤에 얼음에 1.5 시간 동안 차 항체와 부화실온에서 1 시간 동안 인큐베이션 tibody. <ol><li> FLAG-트리 아릴 포스의 표지 시약의 FLAG 펩티드 항원을 검출하기 위해 항-FLAG M2 항체 100 μL (BB에서 만들어진 항체의 예 1:2,000 희석)를 추가합니다. 또한 음성 대조군으로 비 라벨 처리 우물을 조사. 중량 또는 AZF - GPCR 세포 표면 발현을 결정하는 우물의 별도의 세트에 항체 (우리는 1:500 희석 사용) 방지 CCR5 2D7를 추가합니다. </li><li> BB와 세포를 세 번 씻어 HRP - 복합 항 - 마우스 IgG 이차 항체 (1:2,000 희석) 100 μL에 품어. </li><li> 조심스럽게 BB와 세포 다섯 번 씻는다. 50 μL 감지 버퍼 추가 Amplex 레드, 20 mM의 H 2 O 2, 1X PBS (1:10:90 비율)을 실온에서 15 분 알을 품다. λ의 예 = 530 형광 멀티 웰 플레이트 리더에 스펙트럼 데이터를 수집하고 λ는 EM은 590 =. </li></ol></li></ol> 4. GPCR의 Bioorthogonal 형광 라벨링 <ol><li> 를 Lyse중량 또는 AZF-로돕신이 1 %를 포함하는 1 ML의 용해 버퍼에 변형 (w / v)의 DM, 50 mM의 HEPES 또는 트리스 - 염산, 산도 6.8, 100 ㎜의 NaCl, 1 mM의 염화칼슘 및 단백질 분해 효소 억제제에 대한 1을 표현하는 10 7 수확 세포 4 ° C에서 시간 10 분 동안 15,000 XG에서 세포 용 해물을 원심 분리하고 상청액 분획을 수집한다. </li><li> 설계 C 말단는 1d4의 항원을 사용하여 수용체를 캡처하는 100 μL는 1d4 - 단클론 항체 세 파로스 2B 수지를 추가합니다. 4 ℃에서 12 시간 동안 배양 0.1 M 인산 나트륨 완충액, pH가 7.3 (W / V) DDM 0.1 %로 수지를 세 번 씻으십시오. </li><li> 면역 매트릭스 (1d4 개 - 단클론 항체 세 파로스 2B)에 고정 수용체​​를 레이블에 0.5 ㎖ - 0.3의 총 부피에 0.1 ㎜ 형광-포스를 추가합니다. 실온에서 12 시간 동안 배양한다. 원심 분리기 및 뜨는을 제거합니다. 미 반응 라벨을 제거하기 위해 수지를 씻으십시오. </li><li> (w / v) DDM 0.33 ㎎ / ㎖ nonapeptide (1d4 개 에피토프에 대해 C9 펩티드) 0.1 %를 함유하는 100 ㎖의 용출 완충액으로 표지 된 수용체을 용출2 mM의 포스페이트 완충액에서 1 시간 동안 얼음 위에서 배양 pH를 6.0. </li><li> 환원 조건 하에서 SDS-PAGE에 의해 표시된 샘플을 해결합니다. PBS에서 간단히 젤 씻어 다음에 젤 형광에 의해 AZF - GPCR의 라벨을 시각화. 예를 들어, 플루오 레세 인 변성 수용체를 검출하기 위해 488 nm 파장의 레이저 공 초점 형광 스캐너를 사용한다. </li></ol>

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S., MacKenzie, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+to+rhodopsin:+characterization,+cross-reactivity,+and+application+as+structural+probes.">Monoclonal antibodies to rhodopsin: characterization, cross-reactivity, and application as structural probes.</a> Biochemistry. 22, 653-660 (1983).</li><li>Gether, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agonists+induce+conformational+changes+in+transmembrane+domains+III+and+VI+of+the+beta2+adrenoceptor.">Agonists induce conformational changes in transmembrane domains III and VI of the beta2 adrenoceptor.</a> The EMBO journal. 16, 6737-6747 (1997).</li><li>Hubbell, W. L., Altenbach, C., Hubbell, C. M., Khorana, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhodopsin+structure,+dynamics,+and+activation:+A+perspective+from+crystallography,+site-directed+spin+labeling,+sulfhydryl+reactivity,+and+disulfide+cross-linking.">Rhodopsin structure, dynamics, and activation: A perspective from crystallography, site-directed spin labeling, sulfhydryl reactivity, and disulfide cross-linking.</a> Advances in Protein Chemistry; Membrane Proteins. 63, 243-290 (2003).</li><li>Cai, K., Itoh, Y., Khorana, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+contact+sites+in+complex+formation+between+transducin+and+light-activated+rhodopsin+by+covalent+crosslinking:+use+of+a+photoactivatable+reagent.">Mapping of contact sites in complex formation between transducin and light-activated rhodopsin by covalent crosslinking: use of a photoactivatable reagent.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 4877-4882 (2001).</li><li>Dorman, G., Prestwich, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benzophenone+photophores+in+biochemistry.">Benzophenone photophores in biochemistry.</a> Biochemistry. 33, 5661-5673 (1994).</li><li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+strategy+for+the+site-specific+modification+of+proteins+in+vivo.">A new strategy for the site-specific modification of proteins in vivo.</a> Biochemistry. 42, 6735-6746 (2003).</li><li>Dirksen, A., Hackeng, T. M., Dawson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleophilic+catalysis+of+oxime+ligation.">Nucleophilic catalysis of oxime ligation.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 45, 7581-7584 (2006).</li><li>Yanagisawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multistep+engineering+of+pyrrolysyl-tRNA+synthetase+to+genetically+encode+N(epsilon)-(o-azidobenzyloxycarbonyl)+lysine+for+site-specific+protein+modification.">Multistep engineering of pyrrolysyl-tRNA synthetase to genetically encode N(epsilon)-(o-azidobenzyloxycarbonyl) lysine for site-specific protein modification.</a> Chemistry &amp; biology. 15, 1187-1197 (2008).</li></ol>

저자가 공개하는 게 없다.

우리의 GPCR에, 반응 조사, AZF의 사이트 별 편입 여기 강력한 방법을 설명하고의 GPCR의 구조와 역학을 연구하는이 도구의 세 가지 유용한 응용 프로그램을 보여줍니다. 우리의 방법이 사이트는, 구체적으로 UAAs 화학적 (32, 33)를 라벨 또는 단일 접근 시스테인 돌연변이에 photocrosslinkers 34 부착에 따라 다른 전략에 근본적인 문제를 우회 통합. 시스테인 티올 그룹을 대상으로 화학 형광...

Heptahelical G 단백질 결합 수용체 (GPCR에)는 중요하고 다양한 세포 외 신호를 매개하는 매우 역동적 인 막 단백질의 거대 집단을 포함한다. 고전적인 패러다임에서, 수용체의 활성화는 리간드에 의한 구조적 변화와 연결되어있다. 1,의 GPCR의 구조 생물학에있는 최근 전진이 횡단 신호의 분자 메커니즘에 대한 중요한 통찰력을 제공하고 있습니다. 3-5하지만, 더 큰 화학 정밀도와 이해 기능적인 메커니즘과 GPCR 신호의 구조 역학은, 접근 방법의 툴킷은 활성 신호 단지를 심문하는 정보를 분자 및 화학 프로브를 통합하는 데 필요합니다. 이를 위해, 우리는 사이트 구체적으로 이전 슐츠와 C에 의해 개척 억제 기술 코돈 호박을 사용하여 자연스러운 아미노산 (UAA) 돌연변이에 따라 표현 수용체에 비 또는 최소가 혼란 프로브를 소개하는 방법을 적용oworkers. 6 우리는 포유 동물 세포 이외의 대부분의 이종 시스템에서 표현하기 어려운의 GPCR과 같은 단백질에 대한 높은 수율의 발현 및 돌연변이 유발 시스템을 달성하기 위해 UAA 돌연변이 유발 방법을 최적화. 직교 설계 회로의 tRNA를 사용하여 특정 UAA에 대한 아미노 아실-tRNA의 합성 쌍을 진화, 우리는 사이트 구체적으로 표현 된 대상의 GPCR에 UAAs을 소개했다. UAAs의 성공적인 결합은, P-아세틸-L-페닐알라닌 (ACF), P-벤조일-L-페닐알라닌 (BZF), 및 p-아지도-L-페닐알라닌 (AZF) 우리의 모델의 GPCR에서 입증되었습니다 - 로돕신과 인간 CC 케모카인 수용체 CCR5. 7, 8 원칙적으로, UAA는 유전자 단백질 시퀀스 내에서 어떤 위치에 인코딩 할 수 있으며,이 목표 GPCR의 단일 코돈 스캔을 가능으로이 속성은 매우 중요한 생화학 적 도구입니다. 우리는 반응 AZI가 UAA, AZF의 다양성에 특별히 초점을 맞춘다부분을​​. 9 AZF 또한 인접 급 아민 또는 지방족 수소와 반응시켜 광활성 가교제로 사용될 수 고유의 적외선 (IR) 조사, 08로서 외에도. 또한, 생물학적으로 불활성 인 아지 도기는 bioorthogonal 라벨링 반응에서 선택적 화학 핸들로서 참여할 수있다. 여기에서 우리는 같은 함정을 대상으로 광 가교 수용체 - 리간드 복합체 및 bioorthogonal 에피토프 태그 형광 라벨 전략으로의 GPCR의 변경 등의 GPCR로 AZF의 사이트 별 법인의 유용한 응용 프로그램을 설명하는 예를 제시한다. 광활성 시약은 1960 년대 이후 생물 학적 시스템을 연구하는 데 사용되었습니다.이 기간에 10, 수용체 - 리간드 가교 실험의 풍부가 GPCR 복합체를 연구보고되고있다, 그 중 대부분은 photoaffinity 리간드의 사용을 포함. (11, 12) 그러나 이러한 그들은 요하는대로 응용 프로그램은 기술적으로 제한됩니다가교기를 함유 리간드의 전자 합성. 13-15 또한, 리간드의 가교제 잔기, 그것은 GPCR에 가교 결합의 위치를 식별하기 위해 도전. 사이트 구체적 진압 기술 코돈 황색하여 단백질로 UAAs 등 광 가교기를 도입하는 것은 귀중한 발전이다. 16,17 우리에서 수용체 - 리간드 복합체의 형성에 관여하는 수용체에 결합 인터페이스를 식별하는 광 가교 기법을 개발 GPCR에로 광 불안정성 그룹을 도입함으로써 세포를 살아. (18, 19) 여기에서 우리는 작은 분자 리간드의 결합 부위, CCR5에 삼중 마라 비록을 식별하기 위해 표적 광 가교 기술을 적용하기위한 실험 프로토콜 및 데이터 분석 방법을 서술. 이 방법은 리간드의 기본 화학 구조를 유지 이외에 방사성 리간드에 손잡이의 정확한 정량화에 대문자. 형광 기반 기술을 직접 수용체의 구조적 상태를 프로빙하여 수용체 활성화의 구조 기준의 정확한 이해를 지원합니다. (20), (21)는 그러나 GPCR에에 형광 라벨을 소개 할 수있는 유연성을 가진 기술이 사이트 구체적으로 제한됩니다. 우리는 GPCR 신호 복합체의 단일 분자 검출 (SMD)를 용이하게하기 위해 bioorthogonal 화학적 변형 전략을 채용에 관심이 있습니다. 22 아지 도기는 딩거 (Staudinger) - BERTOZZI 내고, 23, 24 동계 변형 승진 아 지드 - 같은 bioorthogonal 화학에 참여할 수 알킨 사이클로 (SpAAC) 25 구리 - 촉매 아 지드 - 알킨 사이클로 (CuAAC가). 26 우리는 아 지드와 포스의 특정 반응을 포함 딩거 (Staudinger) - BERTOZZI 결찰 반응에 초점을 맞춘다. 우리는 펩티드 에피토프 (FLAG 펩티드) 또는 형광 라벨에 접합 된 두 개의 다른 포스 핀 유도체의 사용을 보여GPCR에의 특정 사이트 변경을 달성하기 위해 (형광). 우리는 이전에 노출 된 용매이다 대상 사이트를 선택하는 X-선 결정 구조 및 동적 시뮬레이션을 사용 AZF 변이체 로돕신의 부위 특이 적 표지에 대한 조건을 최적화. 27, 28 우리는 또한 의해 배경 프리 라벨링을 달성하기위한 가능성 도시 딩거 (Staudinger)을 BERTOZZI 결찰. 29 우리는 여기에 면역 매트릭스에 고정하고 이후에 겔 형광에 의해 가시화되는 세제 용해 수용체의 형광 라벨을 달성하기 위해 사용되는 일반적인 과정을 보여줍니다. 또한, 우리는 알 수없는 구조, CCR5의 수용체에 대한 표시 의무가 위치를 식별하기 위해이 라벨 전략에 대한 편리한 확장을 보여줍니다. 이것은 AZF - GPCR은 세포 기반의 세미 높은 처리량 형식으로 변형 bioorthogonal 수정에 의존하는 대상 펩티드 에피토프 태그 전략을 사용하여 수행됩니다. (30)이방법은 라벨링 이벤트를 모니터하는 세포 표면 ELISA의 다단계 검출 특성을 이용한다. 우리가 여기서 논의 방법은 일반이며, 원칙적으로 억제 기술 코돈 호박을 사용하여 AZF로 통합 된 모든 GPCR에 적용 할 수 있습니다. 우리는 세부 사항의 GPCR의 구조와 역동적 인 연구를 용이하게하기 위해 부 자연스러운 아미노산 돌연변이 유발 방법과 그 이후의 응용 프로그램을 사용하여 같은 AZF 등 UAAs와 결합 수용체의 포유 동물 세포 발현하는 단계에서 제시하는 프로토콜에서.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pSVB. Yam</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(Ye et al., 2008)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pcDNA.RS for azF</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(Ye et al., 2009)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids pMT4.Rho and pcDNA 3.1.CCR5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Optionally contain the amber stop codon (TAG) at a desired position</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK 293T cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Adherent cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gemini Bio-products</td>
			<td>100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine Plus</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Lipofectamine: 18324-012 
			Plus: 11514-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-azido-L-phenylalanine</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>6162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 1. Site-specific genetic incorporation of unnatural amino acids into GPCRs materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxima ML-3500S UV-A lamp</td>
			<td>Spectronics Corporation</td>
			<td></td>
			<td>azF is activated by 365-nm light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Buffered Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Irvine Scientific</td>
			<td>9319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3117405001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tritium-labeled ligand</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>From collaborator (Grunbeck et al., 2012)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% (w/v) n-dodecyl-&#946;-D-maltoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310LA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1D4-sepharose resin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1D4 mAb immobilized on CNBr-activated sepharose 2B resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% (w/v) sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Novex 4 - 12% SDS gels</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0322BOX</td>
			<td>SDS-PAGE performed on NuPAGE apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot SD apparatus</td>
			<td>Biorad</td>
			<td></td>
			<td>Apparatus for semi-dry transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-fat powered milk</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9934262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>274348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ecoscint A</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>LS-273</td>
			<td>Scintillation fluid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>333726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LKB Wallac 1209 Rackbeta Liquid Scintillation Counter</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td>Beta-Scintillation counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rhodopsin 1D4 mAb</td>
			<td>National Cell Culture Center</td>
			<td>custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated anti-mouse IgG</td>
			<td>KPL, Inc.</td>
			<td>474-1806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>34080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyblot CL AR film</td>
			<td>Denville</td>
			<td>E3018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 2. Targeted photocrosslinking materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15050065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLAG-triarylphosphine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>GPHOS1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M2 FLAG mAb</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CCR5 2D7 mAb</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555990</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3601</td>
			<td>Clear bottom, high binding EIA/RIA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (Calcium, Magnesium)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde</td>
			<td>EMS</td>
			<td>28908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-conjugated</td>
			<td>KPL, Inc.</td>
			<td>474-1516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit IgG</td>
			<td>KPL, Inc.</td>
			<td>474-1516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplex Red</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A12222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>DE Healthcare Products</td>
			<td>97-93399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoFluor II fluorescence multi-well plate reader</td>
			<td>Perseptive Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 3. Targeted peptide-epitope tagging and cell surface ELISA materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein-phosphine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(Huber et al., submitted 2012)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonapeptide (C9 peptide)</td>
			<td>AnaSpec</td>
			<td>62190</td>
			<td>Peptide mimicking the 1D4-epitope NH2-TETSQVAPA-COOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% (w/v) n-dodecyl-&#946;-D-maltoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310LA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1D4-sepharose resin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1D4 mAb immobilized on CNBr-activated sepharose 2B resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Novex 4 - 12% SDS gels</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0322BOX</td>
			<td>SDS-PAGE performed on NuPAGE apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Typhoon 9400 fluorescence scanner</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>discontinued</td>
			<td>Scanner with 488-nm wavelength laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 4. Fluorescent labeling materials</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetically-encoded molecular probes to study g protein-coupled receptors

단지 신호 G 단백질 결합 수용체 (GPCR)의 구조 및 동적 연구를 용이하게하기 위해 새로운 접근 방식은 수용체의 기능을 교란하지 않는 표현 수용체에 정보를 프로브 또는 라벨을 도입해야합니다. 우리는 유 전적으로 인코딩에 앰버 코돈 억제 기술을 사용 부자연 아미노산 heterologously 포유 동물 세포에서 발현의 GPCR의 다양한 표적 위치에서의 P-아지도-L-페닐알라닌 (AZF). 아지 그룹의 다양성은 그들 나라의 세포​​ 환경이나 세제 용해 된 상태에서의 GPCR을 연구하는 다른 응용 프로그램에서 보여줍니다. 먼저, 트리튬 표지 된 저분자 리간드 유전자 부호화 아지 아미노산 가교 GPCR의 리간드 결합 포켓 잔기를 식별하는 셀 기반 타겟팅 광 가교 기술을 보여준다. 우리는 그 다음 bioorthogonal 딩거 (Staudinger) - BERTOZZI 결찰 REAC로의 GPCR의 사이트의 특정 변형을 보여 주포스 핀 유도체를 사용하는 아지 도기를 대상 기. 우리는 전체 세포 기반 ELISA 방법을 사용하여의 문화와 탐지 표현 막 단백질의 대상 펩티드 에피토프 태그에 대한 일반적인 전략에 대해 설명합니다. 마지막으로, 우리는 AZF-GPCR에 선택적 형광 프로브로 태그 될 수 있다는 것을 보여줍니다. 그들은 원칙적으로 활성 신호 복합체를 심문하는 GPCR을 발현 어느 임의의 아미노산 위치에 적용 할 수 있다는 점에서 논의 된 방법은 일반적이다.

우리는 - 특히 사이트 억제 기술 코돈 호박을 사용하여 GPCR에 분자 프로브를 소개하는 부 자연스러운 아미노산 돌연변이 유발 방법을 채택했다. 그림 1의 방식은 방법론의 돌출 단계와의 GPCR에, 다양한 UAA를, P-아지도-L-페닐알라닌 (AZF) 통합의 다양한 응용 프로그램을 설명합니다. 포유 동물 세포에 AZF - GPCR에의 발현은 리간드 광 가교를 대상으로하고, bioorthogonal 라벨 화학을 ...

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Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

우리의 GPCR의 다양한 타겟 위치에 부 자연스러운 아미노산, P-아지도-L-페닐알라닌을 유전자 인코딩 및 다른 응용 프로그램에서 아지 그룹의 다양성을 보여줍니다. 이들은 GPCR의 리간드 결합 주머니에 잔류를 확인하는 대상으로 광 가교 기술 및 펩티드 에피토프 태그 또는 형광 프로브의 GPCR의 특정 사이트 bioorthogonal 수정이 (가) 있습니다.

유전자 인코딩 분자 프로브는 G 단백질 결합 수용체를 연구하는

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce ...

genetically-encoded-molecular-probes-to-study-g-protein-coupled

Research

JoVE Journal

Biology

15.1K 조회수.  The Rockefeller University.  우리의 GPCR의 다양한 타겟 위치에 부 자연스러운 아미노산, P-아지도-L-페닐알라닌을 유전자 인코딩 및 다른 응용 프로그램에서 아지 그룹의 다양성을 보여줍니다. 이들은 GPCR의 리간드 결합 주머니에 잔류를 확인하는 대상으로 광 가교 기술 및 펩티드 에피토프 태그 또는 형광 프로브의 GPCR의 특정 사이트 bioorthogonal 수정이 (가) 있습니다. 

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Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

도마뱀의 운동의 속도와 방향에 시각 민감도 테스트

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

연구

생물학

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite morphogenesis at the functional and molecular levels. To aid in these analyses, we have developed a strategy for the isolation of a subclass of PNS neurons called dendritic arborization (da) neurons that have been widely used for studying dendrite morphogenesis1,2. These neurons are very difficult to isolate as a pure population, due in part to their extremely low occurrence and their difficult-to-reach location below the tough chitinous larval cuticle. Our newly developed method overcomes these challenges, and is based on a fast and specific cell enrichment using antibody-coated magnetic beads. For our magnetic bead sorting studies, we have used age-matched third instar larvae expressing a mouse CD8 tagged GFP fusion protein (UAS-mCD8-GFP)3 under the control of either the class IV dendritic arborization (da) neuron-specific pickpocket (ppk)-GAL4 driver4 or the control of the pan-da neuron-specific GAL421-7 driver5. Although this protocol has been optimized for isolating PNS cells which are attached to the inner wall of the larval cuticle, by varying a few parameters, the same protocol could be used to isolate many different cell types attached to the cuticle at larval or pupal stages of development (e.g. epithelia, muscle, oenocytes etc.), or other cell types from larval organs depending upon the GAL4-specific driver expression pattern. The RNA isolated by this method is of high quality and can be readily used for downstream genomic analyses such as microarray gene expression profiling studies. This approach offers a powerful new tool to perform studies on isolated Drosophila dendritic arborization (da) neurons thereby providing novel insights into the molecular mechanisms underlying dendrite morphogenesis.

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

In this video-article we present a method for the isolation and purification of Drosophila peripheral neurons using a fast magnetic bead assisted cell sorting strategy. RNA obtained from the isolated cells can be readily used for downstream applications including microarray analyses.

의 분리 및 정제 Drosophila</em마그네틱 비드별로 정렬> 주변 뉴런

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial applications as well as increases basic fundamental biological knowledge. F&ouml;rster (Fluorescence) Resonance Energy Transfer (FRET) between a donor molecule in an electronically excited state and a nearby acceptor molecule has been frequently utilized for studies of protein-protein interactions in living cells. The proteins of interest are tagged with two different types of fluorescent probes and expressed in biological cells. The fluorescent probes are then excited, typically using laser light, and the spectral properties of the fluorescence emission emanating from the fluorescent probes is collected and analyzed. Information regarding the degree of the protein interactions is embedded in the spectral emission data. Typically, the cell must be scanned a number of times in order to accumulate enough spectral information to accurately quantify the extent of the protein interactions for each region of interest within the cell. However, the molecular composition of these regions may change during the course of the acquisition process, limiting the spatial determination of the quantitative values of the apparent FRET efficiencies to an average over entire cells. By means of a spectrally resolved two-photon microscope, we are able to obtain a full set of spectrally resolved images after only one complete excitation scan of the sample of interest. From this pixel-level spectral data, a map of FRET efficiencies throughout the cell is calculated. By applying a simple theory of FRET in oligomeric complexes to the experimentally obtained distribution of FRET efficiencies throughout the cell, a single spectrally resolved scan reveals stoichiometric and structural information about the oligomer complex under study. Here we describe the procedure of preparing biological cells (the yeast Saccharomyces cerevisiae) expressing membrane receptors (sterile 2 &alpha;-factor receptors) tagged with two different types of fluorescent probes. Furthermore, we illustrate critical factors involved in collecting fluorescence data using the spectrally resolved two-photon microscopy imaging system. The use of this protocol may be extended to study any type of protein which can be expressed in a living cell with a fluorescent marker attached to it.

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

By employing a spectrally resolved two-photon microscopy imaging system, pixel-level maps of F&ouml;rster Resonance Energy Transfer (FRET) efficiencies are obtained for cells expressing membrane receptors hypothesized to form homo-oligomeric complexes. From the FRET efficiency maps, we are able to estimate stoichiometric information about the oligomer complex under study.

Spectrally 해결된 두 광자 현미경을 사용하여 G 단백질 결합 수용체 상호 작용의 생체내 부량에서

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial ...

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, differentiation, and apoptosis1. During apoptosis, calcium accumulation in mitochondria promotes the release of pro-apoptotic factors from the mitochondria into the cytosol2. It is therefore of interest to directly measure mitochondrial calcium in living cells in situ during apoptosis. High-resolution fluorescent imaging of cells loaded with dual-excitation ratiometric and non-ratiometric synthetic calcium indicator dyes has been proven to be a reliable and versatile tool to study various aspects of intracellular calcium signaling. Measuring cytosolic calcium fluxes using these techniques is relatively straightforward. However, measuring intramitochondrial calcium levels in intact cells using synthetic calcium indicators such as rhod-2 and rhod-FF is more challenging. Synthetic indicators targeted to mitochondria have blunted responses to repetitive increases in mitochondrial calcium, and disrupt mitochondrial morphology3. Additionally, synthetic indicators tend to leak out of mitochondria over several hours which makes them unsuitable for long-term experiments. Thus, genetically encoded calcium indicators based upon green fluorescent protein (GFP)4 or aequorin5 targeted to mitochondria have greatly facilitated measurement of mitochondrial calcium dynamics. Here, we describe a simple method for real-time measurement of mitochondrial calcium fluxes in response to different stimuli. The method is based on fluorescence microscopy of 'ratiometric-pericam' which is selectively targeted to mitochondria. Ratiometric pericam is a calcium indicator based on a fusion of circularly permuted yellow fluorescent protein and calmodulin4. Binding of calcium to ratiometric pericam causes a shift of its excitation peak from 415 nm to 494 nm, while the emission spectrum, which peaks around 515 nm, remains unchanged. Ratiometric pericam binds a single calcium ion with a dissociation constant in vitro of ~1.7 &mu;M4. These properties of ratiometric pericam allow the quantification of rapid and long-term changes in mitochondrial calcium concentration. Furthermore, we describe adaptation of this methodology to a standard wide-field calcium imaging microscope with commonly available filter sets. Using two distinct agonists, the purinergic agonist ATP and apoptosis-inducing drug staurosporine, we demonstrate that this method is appropriate for monitoring changes in mitochondrial calcium concentration with a temporal resolution of seconds to hours. Furthermore, we also demonstrate that ratiometric pericam is also useful for measuring mitochondrial fission/fragmentation during apoptosis. Thus, ratiometric pericam is particularly well suited for continuous long-term measurement of mitochondrial calcium dynamics during apoptosis.

This protocol describes a method for real-time measurement of mitochondrial calcium fluxes by fluorescent imaging. The method takes advantage of a circularly permutated YFP-based dual-excitation ratiometric calcium sensor (ratiometric pericam-mt) selectively expressed in mitochondria.

유전자 변형으로 인코딩된 칼슘 센서를 사용하여 Apoptosis 동안 Mitochondrial 칼슘 레벨에서 동적 변경 사항 모니터링

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1. This guided cell migration is referred as chemotaxis, which is essential for various cells to carry out their functions such as trafficking of immune cells and patterning of neuronal cells 2, 3. A large family of G-protein coupled receptors (GPCRs) detects variable small peptides, known as chemokines, to direct cell migration in vivo 4. The final goal of chemotaxis research is to understand how a GPCR machinery senses chemokine gradients and controls signaling events leading to chemotaxis. To this end, we use imaging techniques to monitor, in real time, spatiotemporal concentrations of chemoattractants, cell movement in a gradient of chemoattractant, GPCR mediated activation of heterotrimeric G-protein, and intracellular signaling events involved in chemotaxis of eukaryotic cells 5-8. The simple eukaryotic organism, Dictyostelium discoideum, displays chemotaxic behaviors that are similar to those of leukocytes, and D. discoideum is a key model system for studying eukaryotic chemotaxis. As free-living amoebae, D. discoideum cells divide in rich medium. Upon starvation, cells enter a developmental program in which they aggregate through cAMP-mediated chemotaxis to form multicullular structures. Many components involved in chemotaxis to cAMP have been identified in D. discoideum. The binding of cAMP to a GPCR (cAR1) induces dissociation of heterotrimeric G-proteins into G&gamma; and G&beta;&gamma; subunits 7, 9, 10. G&beta;&gamma; subunits activate Ras, which in turn activates PI3K, converting PIP2 into PIP3 on the cell membrane 11-13. PIP3 serve as binding sites for proteins with pleckstrin Homology (PH) domains, thus recruiting these proteins to the membrane 14, 15. Activation of cAR1 receptors also controls the membrane associations of PTEN, which dephosphorylates PIP3 to PIP2 16, 17. The molecular mechanisms are evolutionarily conserved in chemokine GPCR-mediated chemotaxis of human cells such as neutrophils 18. We present following methods for studying chemotaxis of D. discoideum cells. 1. Preparation of chemotactic component cells. 2. Imaging chemotaxis of cells in a cAMP gradient. 3. Monitoring a GPCR induced activation of heterotrimeric G-protein in single live cells. 4. Imaging chemoattractant-triggered dynamic PIP3 responses in single live cells in real time. Our developed imaging methods can be applied to study chemotaxis of human leukocytes.

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Here, we describe detailed live cell imaging methods for investigating chemotaxis. We present fluorescence microscopic methods to monitor spatiotemporal dynamics of signaling events in migrating cells. Measurement of signaling events permits us to further understand how a GPCR-signaling network achieves gradient sensing of chemoattractants and controls directional migration of eukaryotic cells.

이미징 G - 단백질 결합 수용체 (GPCR) - 중재 신호 행사 그 제어 Chemotaxis Dictyostelium Discoideum</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

Quantifying Agonist Activity at G Protein-coupled Receptors

When an agonist activates a population of G protein-coupled receptors (GPCRs), it elicits a signaling pathway that culminates in the response of the cell or tissue. This process can be analyzed at the level of a single receptor, a population of receptors, or a downstream response. Here we describe how to analyze the downstream response to obtain an estimate of the agonist affinity constant for the active state of single receptors.
Receptors behave as quantal switches that alternate between active and inactive states (Figure 1). The active state interacts with specific G proteins or other signaling partners. In the absence of ligands, the inactive state predominates. The binding of agonist increases the probability that the receptor will switch into the active state because its affinity constant for the active state (Kb) is much greater than that for the inactive state (Ka). The summation of the random outputs of all of the receptors in the population yields a constant level of receptor activation in time. The reciprocal of the concentration of agonist eliciting half-maximal receptor activation is equivalent to the observed affinity constant (Kobs), and the fraction of agonist-receptor complexes in the active state is defined as efficacy (&#949;) (Figure 2).
Methods for analyzing the downstream responses of GPCRs have been developed that enable the estimation of the Kobs and relative efficacy of an agonist 1,2. In this report, we show how to modify this analysis to estimate the agonist Kb value relative to that of another agonist. For assays that exhibit constitutive activity, we show how to estimate Kb in absolute units of M-1.
Our method of analyzing agonist concentration-response curves 3,4 consists of global nonlinear regression using the operational model 5. We describe a procedure using the software application, Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). The analysis yields an estimate of the product of Kobs and a parameter proportional to efficacy (&tau;). The estimate of &tau;Kobs of one agonist, divided by that of another, is a relative measure of Kb (RAi) 6. For any receptor exhibiting constitutive activity, it is possible to estimate a parameter proportional to the efficacy of the free receptor complex (&tau;sys). In this case, the Kb value of an agonist is equivalent to &tau;Kobs/&tau;sys 3.
Our method is useful for determining the selectivity of an agonist for receptor subtypes and for quantifying agonist-receptor signaling through different G proteins.

A method for estimating the affinity constant of an agonist for the active state (Kb) of a G protein-coupled receptor is described. The analysis provides absolute or relative measures of Kb depending on whether constitutive receptor activation is measurable. Our method applies to various responses downstream from receptor activation.

G 단백질 결합 수용체에 작용제 활동 Quantifying

When an agonist activates a population of G protein-coupled receptors (GPCRs), it elicits a signaling pathway that culminates in the response of the cell ...

Characterization of G Protein-coupled Receptors by a Fluorescence-based Calcium Mobilization Assay

For more than 20 years, reverse pharmacology has been the preeminent strategy to discover the activating ligands of orphan G protein-coupled receptors (GPCRs). The onset of a reverse pharmacology assay is the cloning and subsequent transfection of a GPCR of interest in a cellular expression system. The heterologous expressed receptor is then challenged with a compound library of candidate ligands to identify the receptor-activating ligand(s). Receptor activation can be assessed by measuring changes in concentration of second messenger reporter molecules, like calcium or cAMP. The fluorescence-based calcium mobilization assay described here is a frequently used medium-throughput reverse pharmacology assay. The orphan GPCR is transiently expressed in human embryonic kidney 293T (HEK293T) cells and a promiscuous G&#945;16 construct is co-transfected. Following ligand binding, activation of the G&#945;16 subunit induces the release of calcium from the endoplasmic reticulum. Prior to ligand screening, the receptor-expressing cells are loaded with a fluorescent calcium indicator, Fluo-4 acetoxymethyl. The fluorescent signal of Fluo-4 is negligible in cells under resting conditions, but can be amplified more than a 100-fold upon the interaction with calcium ions that are released after receptor activation. The described technique does not require the time-consuming establishment of stably transfected cell lines in which the transfected genetic material is integrated into the host cell genome. Instead, a transient transfection, generating temporary expression of the target gene, is sufficient to perform the screening assay. The setup allows medium-throughput screening of hundreds of compounds. Co-transfection of the promiscuous G&#945;16, which couples to most GPCRs, allows the intracellular signaling pathway to be redirected towards the release of calcium, regardless of the native signaling pathway in endogenous settings. The HEK293T cells are easy to handle and have proven their efficacy throughout the years in receptor deorphanization assays. However, optimization of the assay for specific receptors may remain necessary.

The here described fluorescence-based calcium mobilization assay is a medium-throughput reverse pharmacology screening system for the identification of functionally activating ligand(s) of orphan G protein-coupled receptors (GPCRs).

형광 기반의 칼슘 동원 분석에 의해 G 단백질 결합 수용체의 특성

For more than 20 years, reverse pharmacology has been the preeminent strategy to discover the activating ligands of orphan G protein-coupled receptors ...

Visualizing Clathrin-mediated Endocytosis of G Protein-coupled Receptors at Single-event Resolution via TIRF Microscopy

Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological assays, measuring global changes in endocytosis, have identified over 30 known components participating in CME, and biochemical studies have generated an interaction map of many of these components. It is becoming increasingly clear, however, that CME is a highly dynamic process whose regulation is complex and delicate. In this manuscript, we describe the use of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize the dynamics of components of the clathrin-mediated endocytic machinery, in real time in living cells, at the level of individual events that mediate this process. This approach is essential to elucidate the subtle changes that can alter endocytosis without globally blocking it, as is seen with physiological regulation. We will focus on using this technique to analyze an area of emerging interest, the role of cargo composition in modulating the dynamics of distinct clathrin-coated pits (CCPs). This protocol is compatible with a variety of widely available fluorescence probes, and may be applied to visualizing the dynamics of many cargo molecules that are internalized from the cell surface.

Clathrin-mediated endocytosis, a rapid and highly dynamic process internalizes many proteins, including signaling receptors. The protocol described here directly visualizes the kinetics of individual endocytic events. This is essential for understanding how core members of the endocytic machinery coordinate with each other, and how protein cargo influence this process.

TIRF 현미경을 통해 단일 ​​이벤트 해상도에서 G 단백질 결합 수용체의 Clathrin 매개 엔도 시토 시스를 시각화

Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological ...

Hydroponics: A Versatile System to Study Nutrient Allocation and Plant Responses to Nutrient Availability and Exposure to Toxic Elements

Hydroponic systems have been utilized as one of the standard methods for plant biology research and are also used in commercial production for several crops, including lettuce and tomato. Within the plant research community, numerous hydroponic systems have been designed to study plant responses to biotic and abiotic stresses. Here we present a hydroponic protocol that can be easily implemented in laboratories interested in pursuing studies on plant mineral nutrition.
This protocol describes the hydroponic system set up in detail and the preparation of plant material for successful experiments. Most of the materials described in this protocol can be found outside scientific supply companies, making the set up for hydroponic experiments less expensive and convenient.
The use of a hydroponic growth system is most advantageous in situations where the nutrient media need to be well controlled and when intact roots need to be harvested for downstream applications. We also demonstrate how nutrient concentrations can be modified to induce plant responses to both essential nutrients and toxic non-essential elements.

Here, we present an easy-to-follow protocol to establish a successful hydroponic system for plant nutrition studies. This protocol has been extensively tested in Arabidopsis and can easily be adapted to other plant species to study specific nutritional requirements or the effect of non-essential elements on plant growth and development.

수경법, • 다목적 시스템은 유해 요소에 영양소 가용성 및 노출에 영양 할당 및 플랜트 응답을 공부하기

Hydroponic systems have been utilized as one of the standard methods for plant biology research and are also used in commercial production for several ...

Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many physiological processes, such as embryogenesis, neuron patterning, metastasis of cancer cells, recruitment of neutrophils to sites of inflammation, and the development of the model organism Dictyostelium discoideum. Eukaryotic cells sense chemo-attractants using G protein-coupled receptors. Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

이미징 G의 호중구와 같은 HL60 세포에서 화성과 시그널링 이벤트 수용체가 매개 단백질 결합

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many ...