우리는 광범위한 줄기 세포 연구 센터 FACS을 인정하고 특히 셀 정렬과의 도움을 제시카 스콜스와 시아 Codrea 감사드립니다. 작품은 CIRM RN2 - 00904-1, K08 HL074229, 미국 흉부 학회 / COPD 재단 ATS-06-065, 걱정 재단, UCLA Jonsson 종합 암 센터 흉부 종양학 프로그램 / 폐 암 포자, 캘리포니아 암의 대학 자금을 지원 한 연구 조정위원회와 Gwynne 헤이 즌 벚꽃 기념 연구소 (BG).

단계의 개요 1. 기관의 해부 2. 호흡 관을 청소하고 절단 3. 하나의 세포 현탁액에 효소 소화 및 처리 4. FACS에 얼룩 및 정렬 5. 생체 및 체외 모델에 대한 분류 세포를 처리 1. 기관의 해부 <ol><li> pentobarbital 0.1 mg/0.2 CC의 intraperitoneal 주사와 마우스를 안락사시켜야. </li><li> 복부 벽을 열고 잘라 내고 복부 대동맥을 노출 한 다음 해부하기 위해 옆에 창자를 이동합니다. </li><li> 심장과 폐를 노출 양쪽 횡격막과 흉부 앞쪽에 벽을 통해 절단하여 상자를 엽니 다. 기관을 폭로하기 위해 지방과 침샘을 제거 목에까지 절단 계속합니다. </li><li> thymus를 제거하고 아래의 뒤의 연결 해제 폐를 잘라. Separ그들 사이 집게를 삽입하여 식도에서기도를 먹었다는 후두와의 연결을 위의 상단 대부분의 기관을 잘라. 그런 다음 집게로 기관을 보유하고 첨부 파일에서 해부하고 마음과 폐 전용 블록으로 제거 할 아래로 계속 진행합니다. 오른쪽과 왼쪽 주요 기관지의 대부분을 포함 할 수있는 hilum에 가까운 심장과 폐를 멀리 자른다. </li><li> 얼음 매체를 수집하는 포함하는 작은 배양 접시에있는 호흡 관을 삽입합니다. </li></ol> 2. 기도를 청소하고 절단 <ol><li> 해부 현미경에서 그것에 연결된 모든 다른 조직에서 기관을 청소하는 것은 매우 훌륭한 점 포셉 (5 호)와 Vannas 튀빙겐 가위 (FST 15003-08 finescience.com)을 사용합니다. 이 자료에는 림프절, 재발 후두 신경, 지방, 갑상선 및 남은 폐 혈관합니다. 기관의 위쪽 부분은 SMG의 가장 큰 뭉치를 손상시키지 않고 큰 후두 연골을 제거하기 위해 특별한주의가 필요합니다그는 반지 연골의 연골 및 제 tracheal 연골 성의 링 (C1) 4 사이에 붙어있다. </li><li> 상부와 C4 &amp; C5 사이의 하단 부분에 호흡 관을 잘라 다음 기관의 내강을 통해 두 부분을 잘라 냈어. </li></ol> 3. 단일 세포 현탁액 (SCS)에 효소 소화 및 처리 <ol><li> 30 분 같은 이전 5 설명을위한 실내 온도 (RT)에서 Eppendorf 튜브 16 U의 dispase 1 ML에있는 기관의 하단을 품다. 그런 다음 RT에서 추가 20 분에 0.5 밀리그램 / DMEM에 ML DNase I을 추가합니다. </li><li> 멸균 페트리 접시에 신선한 수집 매체로 소화 tracheas를 제거하고, 해부 현미경으로 표면 상피를 제거. 50 ML 원뿔 튜브로 제거 상피를 포함하는 매체를 전송하는 피펫을 사용합니다. </li><li> 4 ° C.에서 1,000 XG에서 제거 상피를 스핀 다운 표면에 뜨는을 제거하고 일을 흔들어 동안 0.1 % 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 품다를 추가37에 전자 튜브 ° C 30 분에 보육 (200 RPM)를 흔들어. 부화 후, 1000 μl 팁을 사용하여 clumps을 해제하고 단일 세포 현탁액을 형성하기 위해 아래로 피펫합니다. </li><li> 0.15 %의 pronase 1 ML을 포함하는 원추 관 상부기도를 놓습니다. 그런 다음 4 시간에 대해 4 ° C에서 알을 품다. </li><li> 관 부드럽게 소용돌이하고 신선한 수집 매체로 기관을 배치하고 표면 상피 (SE)의 완전한 분리가되는 해부 현미경으로 확인합니다. </li><li> SMG 구획을 연 다음 천천히 흔들림을 RT에서 pronase에 하나 더 시간 동안 배양하기 위해 고급 가위로기도를 이기다. </li><li> tracheal 조직을 스핀 다운, pronase를 제거 위와 같이 흔들림과 30 분에 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 및 품다 37 ° C에서 0.1 %를 추가합니다. </li><li> 10 ML의 주사기를 사용하여 20G, 23G 및 26G 바늘을 통과 소화 세포, clumps과 땀샘의 남은 덩어리. 전에 각 바늘 크기 passaging를 여​​러 번 반복물러나. 지금, 대부분의 세포는 SCS에 있어야합니다. </li><li> 40 μM의 스트레이너를 통해 정지를 필터링하면 다음 여과기을 씻고 세포를 스핀 다운. 그런 매체의 적절한 볼륨에서 reconstitute 세포는 세포 수를 계산하고 얼룩 및 정렬 FACS 즉시 진행합니다. 우리가이 생존에 영향을 미치는 심각하게 효율성을 형성 영역을 감소 것을 발견하기 때문에 4 ° C 또는 몇 시간 동안 얼음에 세포를 방치하지 마십시오. </li></ol> 4. FACS에 얼룩 및 정렬 <ol><li> 그리고 RT에서 15 분 동안 차 항체, 염소 Trop2와 쥐 ITGA6있는 세포의 나머지 부분을 얼룩 흠없는 및 단일 스테인드 보상 튜브를 준비하기위한 충분한 세포를보세요. 그런 다음 PBS로 씻거나 매체를 수집, 제거 표면에 뜨는을 매우 신중하게하고 세포 펠렛을 깰. </li><li> 10 분 동안 RT에서 어둠 속에서 길러 적절한 보조 항체와 얼룩, 씻고 표면에 뜨는 제거한 다음 펠렛을 깰. </li><li> FACS에ARIA, 파편, 아주 작은 세포, 세포 doublets와 죽은 세포 밖으로 전압 및 보상, 게이트를 조정 한 후. SMG 세포의 20~50%이 TROP2 + 6 질 것 그런 다음, SE에서 가장 전지는 TROP2 긍정적해야합니다. </li><li> 귀하의 정렬 Trop2에 대한 게이트 + ITGA6 SMG (덕트 세포)에서 SE에서 + 세포 (기저 세포)와 Trop2에 대한 + 세포 (+ /-ITGA6 긍정적 인 세포).을 설정 </li></ol> 5. 에 대한 정렬 셀을 처리 : 생체 모델에서 체외 문화에 5-9 문화를 형성 체외 영역에서 5.1 <ol><li> 100 μl 혼합 한 다음 24도 횡단도의 상부 챔버에이 혼합물을 넣어 50,000 정렬 셀까지 포함 된 완벽한 중간 10,11 (표 1 참조)의 100 μl와 함께 &quot;성장 인자는 Matrigel을 감소.&quot; 그런 다음 37 하부 챔버에서 완전 매체 400 μl를 넣고 배양 ° C. 매일 하부 챔버에서 미디어를 변경하고 Matrigel의 추가 100 μl를 추가매주하거나 얇은 될 경우 이전. </li></ol> 생체 모델에 5.2 <ol><li> Reconstitute 50 μl 당 5,000-10,000 세포의 농도에 matrigel과 1시 1분 혼합 완전한 중간에 정렬 세포 펠릿. </li><li> 받는 사람 C57/BL6 쥐를 마취. 진통제로 subcutaenously Carprofen을 (5 밀리그램 / kg) 관리 할 수​​ 있습니다. 살균과 뒤를 면도는 상단 뒤쪽에 중심 길이 방향 피부 절개를합니다. 절개는 지방 패드 분사 사이트뿐만 아니라 주입 한 후 형성 물집을 식별 할 수있을만큼 충분히 주어져야합니다. 액세스 및 시각화를 극대화 할 양쪽 가슴 벽의 피부와 다시 사이 파우치를 좀 더 넓혀야 가위의 무딘면을 사용합니다. </li><li> 견갑골의 이동을 볼 위 뒤로 마우스 forelimb을 눌러 견갑골의 내측 경계를 식별합니다. 300 μl BD의 인슐린 주사기로 세포 현탁액의 50 μl를 타고 그냥 견갑골에 안쪽하고 측면 지방 패드에 주사척추. 당신이 너무 깊어 그렇지 않으면 물집을 볼 수 있습니다. 반대편 후 클립이나 바늘 피부 절개를에서 동일하게 반복합니다. 마우스를 확인하고 48 시간을 위해 하루에 한 번씩 Carprofen을 (5 밀리그램 / kg, SC) 제공합니다. </li><li> 3 주 후에도, pentobarbatol (0.1 mg/0.2 CC, IP)로 쥐를 안락사시켜야 위의 피부를 열고 형성하고 주변에 확장 한 수있는 조직 구조를 누락 방지 할 수있는 여유가 양쪽에서 전체 지방 패드를 해부. 파라핀 12 PFA 및 소스에서 수정합니다. 익스트림주의 트리밍과 구조를 무시하거나 간과하지 블록을 절단하는 동안 고용해야합니다. 가장 좋은 방법은 한 번 한 후 4 μm 슬라이스를 잘라 유리 슬라이드에 배치하고 블록 여부를이 부분에서 &quot;상피 구조&quot;가있을 경우 확인 현미경을 검사 40 μm를 잘라하는 것입니다. 본 아무것도없는 경우, 한 번 잘라이 단계를 반복합니다. </li></ol> 6. 대표 결과 취소 선마우스 tracheas의 pping은 그림 1A와 같이 가벼운 현미경으로 볼 수있는 denuded 기관 될 것입니다. 그림 1B는 포도의 조직과 유사한 뭉치에서 풀려나 submucosal 분비와 상피 벗겨 이후 기관의 brightfield보기를 보여줍니다. Pronase는 ITGA6 에피토프를 제거하고 TROP2 덕트 세포 ITGA6 +과로 분리 할 수​​없는 이유입니다 - 인구. 그러나, ITGA6 에피토프를 보존 dispase은, 표면 상피, 심지어 매우 짧은 부화 시간과 덕트 세포, 따라서 세 기저 세포에서 덕트를 분리하는 데 사용할 수 없습니다를 모두 소화. 단일 세포 현탁액의 유동 세포 계측법은 그림 2A에 표현 분산과 측면 분산 형 플롯을 앞으로 표시합니다. tracheal 세포가 형광 활성 세포 sorti에 대한 유동 세포 계측법에 Trop2 항체를 볼 수 있어야 할 경우 나머지 덕트 세포의 좋은 분리NG는 (FACS)와 같은 그림 2B에 표시. 분야는 문화에 약 1 주 후 matrigel에 볼 수 있으며 그림 3과 같이 외관에 고밀도 아르해야합니다. 이 프로세스의 효율성은 여전히​​ matrigel에 존재하고 가능성이 자기 ​​갱신 능력을 가지고하지 않는 submucosal 글 랜드 덕트의 세포를 잘 표현할 수 1-2% 및 단일 세포의 순서입니다. 그림 4 표시됩니다 submucosal 선 같은 구조의 형성에서 마우스 지방 패드 결과에 덕트 줄기 세포의 주입. 이도 H &amp; E 염색하지 않고 블록에 볼 수 있습니다. 다음은 구형이며, 중앙 루멘을 보유하고 있습니다. 대부분의 크로스 섹션이 상피 구조를 놓치지되지 않도록 지방 패드 통해해야합니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3731/3731fig1.jpg" /> 그림 1. tracheal 상피의 효소 소화. 표면 상피 세포의 제거는 blac으로 표시됩니다K 화살표, submucosal 글 랜드 덕트의 세포의 제거는 녹색 화살표로 표시됩니다. 빛 현미경으로 볼 수 있습니다 Denuded tracheas는 dispase 소화 30 분 후에 pronase는 소화의 4 시간 후에 표시됩니다. <img alt="그림 2A" src="/files/ftp_upload/3731/3731fig2A.jpg" /> 그림 2A. 전. 상피 표면이 벗겨 후 마우스 tracheas에서 대표 앞으로 분산 및 사이드 분산 형 플롯을 보여주는 단일 세포 현탁액의 유동 세포 계측법. II. 마우스 tracheas에서 덕트 셀에 TROP2 표현 대표 FACS 플롯. <img alt="그림 2B" src="/files/ftp_upload/3731/3731fig2B.jpg" /> 그림 2B. 전. 대표 앞으로 분산 및 사이드 분산 형 플롯을 보여주는 마우스 기관의 낮은 삼분의이의 제거 표면 상피에서 단일 세포 현탁액의 유동 세포 계측법. II. 스와의 ITGA6 표현의 일반적인 FACS의 음모상피를 rface. III. 녹색 기저 세포 인구의 게이팅을 다시 보여주는 표면 상피에서 순방향 및 측면 분산의 또 다른 대표 FACS의 줄거리. IV. 일반 ITGA6 및 TROP2이 녹색으로 세포 인구를 표현. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3731/3731fig3.jpg" /> 그림 3. 분야의 개발 시간 코스입니다. A. 덕트 영역. 분야는 문화에 대한 일주 후 matrigel에 표시됩니다 거의 모든 외관에 조밀 있습니다. 분야를 형성하지 않습니다 단일 세포도 볼 수 있습니다. (스케일 바 = 50 μm). B. 자연적으로 흐르는 것과 분야는 모양이 크고 luminal 있습니다. 분야를 형성하지 않습니다 단일 세포도 볼 수 있습니다. (스케일 바 = 50 μm). <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3731/3731fig4.jpg" /> 그림 4. submucosal 선 같은 구조의 형성에서 마우스 지방 패드 결과에 덕트 줄기 세포의 주입. 대표 구조지방 패드에 표시되어 있으며 일부는 Alcian 파란 정기 산성 스키 프는 얼룩과 점액 (하늘색)를 생산 표시됩니다.

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관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

기도의 덕트와 기저 세포를 분리하는이 기술은기도 수리 및 재생과기도 질환에 대한 우리의 이해를 개선하는 것이 중요합니다. 여기에 설명 된 기술은 몇 가지 중요한 단계가 포함되어 있습니다. 첫 번째는 최적화 된 효소 소화 기간입니다. 두 번째는 세포 전단을 방지하기 위해하지만, 셀 clumps을 깨고 점점 더 게이지 바늘로 passaging 시리얼을 통해 단일 ​​세포 현탁액의 창조입니다. 세 번째는 ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> 중간 열을 완료 : DMEM-F-12, 50 / 50, 1X) </td><td> Mediatech </td><td> 15-090 - CV </td></tr><tr><td> Hepes (15 ㎜) </td><td> Invitrogen </td><td> 15,630 </td></tr><tr><td> 나트륨 중탄산염 (3.6mM 또는 0.03 %) </td><td> Invitrogen </td><td> 25,080 </td></tr><tr><td> L-글루타민 (4 ㎜) </td><td> Mediatech </td><td> 25-005-CL </td></tr><tr><td> 페니실린 (100 U / ML) </td><td> Mediatech </td><td> 30-001 - CI </td></tr><tr><td> 스트렙토 마이신 (100 μg / m) </td><td> Mediatech </td><td> 30-001 - CI </td></tr><tr><td> Amphotericin B (0.25 μg / ML) </td><td> Lonza </td><td> 17 836R </td></tr><tr><td> 에sulin (10 μg / ML) </td><td> 시그마 </td><td> I6634 </td></tr><tr><td> 트랜스페린 (5 μg / ML) </td><td> 시그마 </td><td> T1147 </td></tr><tr><td> 콜레라 독소 (0.1 μg / ML) </td><td> 시그마 </td><td> C8052 </td></tr><tr><td> 표피 성장 인자 (25 NG / ML) </td><td> BD </td><td> 354001 </td></tr><tr><td> 소 뇌하수체 추출 (30 μg / ML) </td><td> Invitrogen </td><td> 13028-014 </td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 (5 %) </td><td> 어부 </td><td> SH3008803HI </td></tr><tr><td> Retinoic 산 (0.05 μM) </td><td> 시그마 </td><td> R2625 </td></tr><tr><td> 성장 인자는 Matrigel을 감소 </td><td> BD </td><td> 354230 </td></tr></tbody></table> 표 1. 미디어 구성 요소를 완료합니다. <table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </TD&gt; <td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> Pronase </td><td> 로슈 </td><td> 10165921001 </td><td> 0.15 %에서 사용 : 4 번 - O / N ° C의 소화 총 tracheal 세포를 (ALI 문화 용) 분리 할 수 -4 시간에 소화 4 ° C SMG 격리하기 </td></tr><tr><td> Dispase </td><td> BD Biosciences </td><td> 354235 </td><td> 16 단위에서 사용 : RT시 30 분 </td></tr><tr><td> DNase I </td><td> 시그마 </td><td> DN25 </td><td> 0.5 MG / ML에서 사용 : RT에서 20-30 분 </td></tr></tbody></table> 표 2. 효소는 기관의 효소 소화에 사용됩니다.

isolation of basal cells and submucosal gland duct cells from mouse trachea

대형 항공은 1 우리가 숨 독소와 전염성 대리인의 부상 때문에 민감 환경과의 접촉에 직접하고. 대형 항공 따라서 효율적인 복구 메커니즘이 우리 몸을 보호하기 위해 필요합니다. 이 복구 과정은기도의 줄기 세포에서 발생기도에서 이러한 줄기 세포를 분리하는 것은 수리와 중생의 메커니즘을 이해하는 것이 중요합니다. 이기도 질환이 될 수 있습니다 이상 수리를 이해하는 것도 중요하다. 이 방법의 목적은 마우스 tracheal submucosal 글 랜드 덕트에서 새로운 줄기 세포 인구를 분리하고 submucosal 선들은 3 수리와 중생의 메커니즘을 식별하는 체외 및 생체 모델 시스템에서 이러한 셀을 배치하는 것입니다. 이 생산은 큰기도 3에서 덕트 및 기초 줄기 세포를 분리하고 분석하는 데 사용할 수있는 방법을 보여줍니다.이 우리에게 수이러한 낭성 섬유증, 천식, 만성 폐 질환으로 방해하는기도가 질병을 공부합니다. 현재 submucosal 선 덕트 세포의 분리에 대한 방법은 없습니다 및 submucosal 분비의 재생을 연구하는 생체 모델에 더 있습니다.

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Isolation of Basal Cells and Submucosal Gland Duct Cells from Mouse Trachea

여기 마우스 tracheas의 기초 및 submucosal 글 랜드 덕트 세포의 분리에 대한 프로토콜을 보여줍니다. 우리는 또한을 만들 등쪽 마우스 지방 패드에 줄기 세포를 주입하는 방법을 보여줍니다<em&gt; 생체 내</emsubmucosal 글 랜드 중생의&gt; 모델입니다.

마우스 기관에서 자연적으로 흐르는 것과 셀 및 Submucosal 글 랜드 덕트 세포의 분리

The large airways are directly in contact with the environment and therefore susceptible to injury from toxins and infectious agents that we breath in 1. ...

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Research

JoVE Journal

Biology

13.3K 조회수.  David Geffen School of Medicine at UCLA. 여기 마우스 tracheas의 기초 및 submucosal 글 랜드 덕트 세포의 분리에 대한 프로토콜을 보여줍니다. 우리는 또한을 만들 등쪽 마우스 지방 패드에 줄기 세포를 주입하는 방법을 보여줍니다 생체 내 모델입니다.

비디오: Isolation of Basal Cells and Submucosal Gland Duct Cells from Mouse Trachea

Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several organisms including humans, non-human primates, rat and, as we describe here, mice. Magnetic bead-based cell separation allows for either positive selection (or cell depletion) as well as negative selection. Here, we demonstrate negative selection of untouched or na ve CD4+ helper T cells. Using this standard protocol we typically purify cells that are &#8805; 96% pure CD4+/CD3+. This protocol is used in conjunction with the protocol Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice published in issue 7 of JoVE, for purification of T cells and other cell types to adoptively transfer for imaging purposes. Although we did not demonstrate FACS analysis in this protocol video, it is highly recommended to check the overall purity of isolated cells using the appropriate antibodies via FACS. In addition, we demonstrate the non-sterile method of T cell isolation. If sterile cells are needed for your particular end-user application, be sure to do all of the demonstrated procedures in the tissue culture hood under standard sterile conditions. Thank you for watching and good luck with your own experiments!

Isolation of lymphocytes using the Miltenyi MACs kit is a reliable way to purify cells from whole lymphoid tissue homogenates. Cells purified using the Miltenyi system are typically &#8805; 96% pure. Here, we demonstrate the steps taken to isolate CD4+ T cells, one of the many kits offered by Miltenyi.

CD4의 분리 + Miltenyi 맥을 정제를 사용하여 마우스 림프절에서 T 세포

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several ...

연구

생물학

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

절연 및 마우스 배아 새싹 세포의 유도

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of non-pigmented inner and pigmented outer cell layers, and the clonal RSC colonies that arise from a single pigmented cell from the CE are made up of both pigmented and non-pigmented cells which can be differentiated to form all the cell types of the neural retina and the RPE. There is some controversy about whether all the cells within the spheres all contain at least some pigment4; however the cells are still capable of forming the different cell types found within the neural retina1-3. In some species, such as amphibians and fish, their eyes are capable of regeneration after injury5, however; the mammalian eye shows no such regenerative properties. We seek to identify the stem cell in vivo and to understand the mechanisms that keep the mammalian retinal stem cells quiescent6-8, even after injury as well as using them as a potential source of cells to help repair physical or genetic models of eye injury through transplantation9-12. Here we describe how to isolate the ciliary epithelial cells from the mouse eye and grow them in culture in order to form the clonal retinal stem cell spheres. Since there are no known markers of the stem cell in vivo, these spheres are the only known way to prospectively identify the stem cell population within the ciliary epithelium of the eye.

In this video, we will demonstrate how to isolate retinal stem cells from the ciliary epithelium of the mouse eye and grow them in culture to form clonal retinal spheres. The spheres that are isolated possess the cardinal properties of stem cells: self-renewal and multipotentiality.

마우스 아이의 망막 줄기 세포의 분리

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of saliva into the oral cavity. Serous and mucous acinar cells are the protein and mucous producing factories of the gland respectively, and represent the origin of saliva production. Once synthesised, the various enzymatic and other proteinaceous components of saliva are secreted through a series of ductal cells bearing epithelial-type morphology, until the eventual expulsion of the saliva through one major duct into the cavity of the mouth. The composition of saliva is also modified by the ductal cells during this process.
In the manifestation of diseases such as Sj&ouml;gren's syndrome, and in some clinical situations such as radiotherapy treatment for head and neck cancers, saliva production by the glands is dramatically reduced 1,2. The resulting xerostomia, a subjective feeling of dry mouth, affects not only the ability of the patient to swallow and speak, but also encourages the development of dental caries and can be socially debilitating for the sufferer.
The restoration of saliva production in the above-mentioned clinical conditions therefore represents an unmet clinical need, and as such several studies have demonstrated the regenerative capacity of the salivary glands 3-5. Further to the isolation of stem cell-like populations of cells from various tissues within the mouse and human bodies 6-8, we have shown using the described method that stem cells isolated from mouse salivary glands can be used to rescue saliva production in irradiated salivary glands 9,10. This discovery paves the way for the development of stem cell-based therapies for the treatment of xerostomic conditions in humans, and also for the exploration of the salivary gland as a microenvironment containing cells with multipotent self-renewing capabilities.

An optimized protocol for the isolation of stem cells from the mouse salivary gland is described. The method employs enzymatic and mechanical digestion, and permits isolation of salispheres containing cells with characteristics of stem cells.

마우스 침샘에 줄기 세포의 분리

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and to gain understanding of the origins of congenital kidney disease. More recently, the possibility of steering na&iuml;ve embryonic stem cells toward nephrogenic fates has been explored in the emerging field of regenerative medicine. Genetic studies in the mouse have identified several pathways required for kidney development, and a global catalog of gene transcription in the organ has recently been generated <a href="http://www.gudmap.org/">http://www.gudmap.org/</a>, providing numerous candidate regulators of essential developmental functions. Organogenesis of the rodent kidney can be studied in organ culture, and many reports have used this approach to analyze outcomes of either applying candidate proteins or knocking down the expression of candidate genes using siRNA or morpholinos. However, the applicability of organ culture to the study of signaling that regulates stem/progenitor cell differentiation versus renewal in the developing kidney is limited as cultured organs contain a compact extracellular matrix limiting diffusion of macromolecules and virus particles. To study the cell signaling events that influence the stem/progenitor cell niche in the kidney we have developed a primary cell system that establishes the nephrogenic zone or progenitor cell niche of the developing kidney ex vivo in isolation from the epithelial inducer of differentiation. Using limited enzymatic digestion, nephrogenic zone cells can be selectively liberated from developing kidneys at E17.5. Following filtration, these cells can be cultured as an irregular monolayer using optimized conditions. Marker gene analysis demonstrates that these cultures contain a distribution of cell types characteristic of the nephrogenic zone in vivo, and that they maintain appropriate marker gene expression during the culture period. These cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which greatly facilitates the study of candidate stem/progenitor cell regulator effects. Basic cell biological parameters such as proliferation and cell death as well as changes in expression of molecular markers characteristic of nephron stem/progenitor cells in vivo can be successfully used as experimental outcomes. Ongoing work in our laboratory using this novel primary cell technique aims to uncover basic mechanisms governing the regulation of self-renewal versus differentiation in nephron stem/progenitor cells.

In this report we describe a method for the isolation and culture of the progenitor cell niche from the embryonic mouse kidney that can be used to study signaling pathways regulating stem/progenitor cells of the developing kidney. These cultured cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which allows efficient manipulation of candidate pathways.

배아 마우스 신장의 Nephrogenic 지대의 세포의 분리 및 문화

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various chemokines and growth factors 1,2. However, once in the TME, these cells lose the ability to promote anti-tumor immunity and begin to support tumor growth and down-regulate anti-tumor immune responses 3-4. Studies on tumor-associated leukocytes have mainly focused on cells isolated from tumor-draining lymph nodes or spleen due to the inherent difficulties in obtaining sufficient cell numbers and purity from the primary tumor. While identifying the mechanisms of cell activation and trafficking through the lymphatic system of tumor bearing mice is important and may give insight to the kinetics of immune responses to cancer, in our experience, many leukocytes, including dendritic cells (DCs), in tumor-draining lymph nodes have a different phenotype than those that infiltrate tumors 5,6 . Furthermore, we have previously demonstrated that adoptively-transferred T cells isolated from the tumor-draining lymph nodes are not tolerized and are capable of responding to secondary stimulation in vitro unlike T cells isolated from the TME, which are tolerized and incapable of proliferation or cytokine production 7,8. Interestingly, we have shown that changing the tumor microenvironment, such as providing CD4+ T helper cells via adoptive transfer, promotes CD8+ T cells to maintain pro-inflammatory effector functions 5. The results from each of the previously mentioned studies demonstrate the importance of measuring cellular responses from TME-infiltrating immune cells as opposed to cells that remain in the periphery. To study the function of immune cells which infiltrate tumors using the Miltenyi Biotech isolation system9, we have modified and optimized this antibody-based isolation procedure to obtain highly enriched populations of antigen presenting cells and tumor antigen-specific cytotoxic T lymphocytes. The protocol includes a detailed dissection of murine prostate tissue from a spontaneous prostate tumor model (TRansgenic Adenocarcinoma of the Mouse Prostate -TRAMP) 10 and a subcutaneous melanoma (B16) tumor model followed by subsequent purification of various leukocyte populations.

In this report, we describe a protocol for isolating highly purified populations of leukocytes that infiltrate tumors. This protocol is adapted from the Miltenyi Biotech protocol to enhance yield and purity for isolating cells from complex tumor tissue.

일차 종양에서 면역 세포의 분리

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

유도 만능의 줄기 세포에서 파생 마우스의 생성

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

간엽 전환을 유도하고 상피의 분석

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

성인 마우스 앞니의 치아 상피 줄기 세포의 분리 및 문화

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of cell heath due to their role in both cell metabolism and energy production as well as control of apoptosis. Therefore, direct evaluation of isolated mitochondria and mitochondrial perturbation offers the ability to determine if organelle-specific (dys)function is occurring. The methods described in this protocol include isolation of intact, functional mitochondria from HEK cultured cells and mouse liver and spinal cord, but can be easily adapted for use with other cultured cells or animal tissues. Mitochondrial function assessed by TMRE and the use of common mitochondrial uncouplers and inhibitors in conjunction with a fluorescent plate reader allow this protocol not only to be versatile and accessible to most research laboratories, but also offers high throughput.

Comparison of mitochondrial membrane potential between samples yields valuable information about cellular status. Detailed steps for isolating mitochondria and assessing response to inhibitors and uncouplers using fluorescence are described. The method and utility of this protocol are illustrated by use of a cell culture and animal model of cellular stress.

분리 및 배양 세포 및 마우스 조직에서 미토콘드리아의 기능적 분석

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...