이 작품은 NIDDK (LO), 미국 심장 협회 (AB), 스웨덴 및 Kungliga Fysiografiska Sällskapet, 룬드, 스웨덴 (UB)의 웬너 - Gren기구에서 박사 후 장학금에서 R01 DK078161에 의해 지원되었다. 추가 지원은 조직 병리학, 생물 정보학 및 외과를위한 메인 메디컬 센터 연구소의 핵심 시설 (2P20RR18789 - 06 지원)와 MMCRI 동물 시설에 의해 제공되었다.

1. 신장 소화를위한 시약 준비 <ol><li> 0.25 %의 Collagenase 1.5 ML은 (W / V), 1 % Pancreatin 다이제스트 (W / V) 솔루션은 8 E17.5 신장에서 nephrogenic 영역 전지 (NZCs)의 추출에 필요한 것입니다. Pancreatin은 상온에서 분해하기 위해 약 2 시간이 소요되기 때문에 충분한 사전 실험되어야 예상​​ 배아 신장의 최대 번호에 대한 솔루션을 소화. 첫번째 25 Collagenase의 MG 10 ML Dulbecco의 인산 분명 15 ML, 멸균 원심 튜브에 살린 (DPBS)를 버퍼 수 있습니다.을 추가하여 솔루션을 소화 준비 이것이 효소 소화에 영향을 줍니까로 DPBS이 칼슘이나 마그네슘을 포함하지 않는 것이 중요합니다. Collagenase A. 적어도 2 시간 해산 Collagenase nutator에 솔루션과 섞어 Pancreatin 100 MG 추가 해산 10 분 nutator에 솔루션을 섞는다. 또는, Collagenase A / Pancreatin 다이제스트 솔루션은 4 박 nutator에서 혼합 수 있습니다 ° C. 이것은 당신이 Collagenase와 Pancreatin은 무게 동안 대기 중으로 쉽게 분산과 비강을 짜증나게 수 있으므로, 마스크를 착용하는 것이 좋습니다. </li><li> 행크의 버퍼 생리 식염수 (HBSS)에 5 %의 태아 소 혈청 (FBS) (V / V) 솔루션을 준비합니다. 섞어 반전. 8 신장의 각 튜브 1 ML이 필요합니다. </li><li> 1 % 글루타민 (V / V), 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 (PenStrep) (V / V)와 Keratinocyte 혈청 무료 매체를 보완하여 문화 매체를 준비합니다. </li><li> 성장 표면의 cm 2 당 5 밀리그램의 농도에 인간 fibronectin 솔루션 코트 살균 평면 바닥 폴리스티렌 조직 문화 플레이트 (96, 48, 24 또는 잘 6). fibronectin 가루 5 MG는 무균 H 2 O. 5 ML에 resuspended입니다 이것은 칼슘이나 마그네슘없는 무균 DPBS에 1시 25분을 희석하고 250 ML은 24 잘 접시의 각각의 잘에 추가됩니다. 번호판은 다음 4 ° C. 또는 1 시간 뒤에 1 시간 동안 실온에서 fibronectin 솔루션과 함께 incubated 있으며, 접시는 4 밤새 incubated 수 있습니다 ° C. 솔루션은 다음 층류 후드에 aspirated입니다 전에 중간 /의 이외에도 세포. </li></ol> 2. 해부 신장 및 제거 캡슐 (실온에서 완료) <ol><li> E17.5에서, 귀하의 기관 애니멀 케어 및 사용위원회의 승인 절차를 사용하여 어머니를 희생 자궁을 제거하고 칼슘, 마그네슘과 DPBS를 포함하는 페트리 접시에 놓으십시오. 해부 현미경, 자궁에서 각 배아를 제거하고 각각의 배아를 참살하는 시계 &#39;집게를 사용합니다. 전체 쓰레기가 자궁 밖으로되면, 칼슘, 전적으로 가능한 한 많은 혈액과 조직 부스러기처럼 뒤에 떠나는 배아를 충당하기 위해 마그네슘과 충분한 DPBS가 포함된 깨끗한 페트리 접시에 배아를 전송합니다. </li><li> 포셉를 사용하여 배꼽의 수준에있는 배 (胚)의 복벽에 원주 절개합니다. 그런 다음, 그 뒷면에있는 배아를 배치 포셉 한 세트와 함께 어깨에 내려 핀, 아래 포셉의 다른 세트를 사용하여 방광에 폐에서 내장을 제거합니다. 연습이 한 동작으로 할 수 있습니다. 신장은 장기의 질량의 뒷면에 첨부해야합니다. 신장이 eviscerated 기관에 연결된 유지하지 않으면, 그들은 조심스럽게 등의 신체 벽에서 제거할 수 있습니다. 그들이 부적 절한 세포 유형과 최종 문화를 오염시킬 수 있으므로 이러한 해부 과정에서 손상되었을 신장은 폐기되어야합니다. </li><li> 부드럽게 서로 연결된 신장을주의한다, 장기의 나머지 부분에서 신장을 떨어져 애타게. 포셉 한 세트로 신장 사이의 조직을 잡고 다른 포셉과 신장 중 하나에 연결된 부신 (副 肾)를 잡아. 부신 (副 肾)이 신장 캡슐에 첨부해야합니다. 부드럽게 부신 (副 肾)과 멀리 바나나 필링과 비슷한 신장의 외부 주위에서 캡슐 껍질. 필링 동안 절반으로 신장을 분할하고, 캡슐 아래 신장 조직을 손상하지 않도록되지 않도록 조심 해요. 조심스럽게 남아있는 캡슐뿐만 아니라 여전히 연결된 경우 ureter를 제거합니다. 나머지 신장과 함께 반복합니다. </li><li> HBSS의 5 ML의 폴리스티렌 관에 신장을 배치 상처 전송 pipet을 사용합니다. 반복 각 배아에 대한 2.2-2.4 단계를 반복합니다. 신장은 튜브 당 8 풀링 수 있습니다. 연습, 해부 및 캡슐 제거를 통해 배아 당 2-3분 소요됩니다. </li></ol> 3. 신장의 효소 소화 (그렇지 않으면 표시되지 않는 실온에서 모든 단계) <ol><li> 신중하게 신장과 접촉을 피하고 동안 pipettor과 신장을 포함하는 5 ML 튜브의 HBSS 용액을 제거합니다. 즉시 Collagenase 다음 예제로 이동하기 전에 신장을 포함하는 5 ML 튜브로 A / Pancreatin 다이제스트 솔루션 1.5 ML를 추가합니다. 신장의 각 튜브에 대해 반복합니다. </li><li> 효소 / 신장과 함께 플레이스 튜브는 15 분 동안 미리 예열 37 ° C 배양기에서 nutator에 요약. 이분 이전다이제스트의 완성, 수행중인 각 소화 하나의 신선한 5 ML의 폴리스티렌 튜브에 DNase 3 μl (1 U / ML)을 추가합니다. </li><li> 신속하게 제거 인큐베이터에서 소화, FBS의 75 μl를 추가하고 섞어 3 번 반전. 2 분 동안 벤치에 서 보자. </li><li> 나머지 0.2 ML 세포 현탁액과 뒤에 신장을 떠나는 동안 DNase (1 U / ML)이있는 5 ML의 폴리스티렌 튜브에 세포 현탁액의 1.4 ML을 전송합니다. 솔루션의 추가 0.2 ML 같은 세포외 기질과 같은 불순물을 포함합니다 남아. </li><li> 미리 예열 37 10 분 ° C 배양기에서 nutator에 혼합 세포 현탁액 / DNase. </li><li> 신속 인큐베이터에서 셀 suspensions를 제거하고 1.5 ML Eppendorf 튜브에 각각 전송할 수 있습니다. 5 분 325g에 microfuge의 세포 suspensions를 스핀. </li><li> 5-6 번하고 아래로 pipetting 5 % FBS / HBSS 1 ML에서 세포 펠릿 및 resuspend 펠렛에서 뜨는 제거합니다. 다음 예제로 이동하기 전에 각각의 튜브 캡. </li><li> 5 분 325g에서 microcentrifuge에서 셀 suspensions를 스핀. </li><li> 뜨는을 제거하고 다음 예제로 이동하기 전에 각각의 튜브에 첨가제와 캡 튜브로 Keratinocyte 혈청 무료 매체 (KSFM)의 0.5 ML를 추가합니다. 매체는 모든 튜브에 추가되었습니다 후, 부드럽게 1ml micropipette로 5-6 회를 pipetting 아래 각 세포 펠렛을 resuspend. 신선한 5 ML의 폴리스티렌 튜브의 모든 세포 suspensions을 결합합니다. </li><li> 샘플 당 KSFM와 5 ML의 폴리스티렌 원형 바닥 관에 위치 서부 유럽 표준시 사전이 40 미크론 셀 스트레이너 모자. 1 ML의 micropipette로 전송 한 셀 스트레이너 캡을 통해 세포 suspensions 패스. 피펫 팁으로 필터를 감동하지 마십시오. 흐름 -을 통해 수집하고 두 번째 여과기 뚜껑을 통해 여과를 반복합니다. 셀 스트레이너 뚜껑을 제거하고 정상 5 ML의 폴리스티렌 관에서 새 모자로 바꿉니다. </li><li> 첨가제와 KSFM와 필요한 diluting, hemocytometer 또는 cm 2 당 100,000-200,000 세포의 밀도에 fibronectin 코팅 문화 판의 우물에 장치 및 전송 세포를 세고 다른 세포와 세포를 계산합니다. 일반적으로, 우리는 10 배아 쓰레기 약 4.5x10 6 세포를 검색할 수 있습니다. </li><li> 37 세포를 품어 ° C 5% CO 2 humidified 보육. </li><li> 세포가 회복 및 추가 시약과 함께 이전에 자극에 매체 2~4시간 위해 첨부할 수 있습니다. 1-48시간에 대한 관심의 화합물로 세포를 자극. 제조 업체의 지침에 따라 Qiagen RNeasy 마이크로 키트를 사용하여 PCR 분석을위한 RNA를 정화하거나 찬란 세포를 immunostain 아래 지침을 따르십시오. </li></ol> 4. 셀의 고정을위한 시약을 준비하고 Immunostaining <ol><li> 4퍼센트 PFA 준비 : 55에서 PBS (V / V)에 4 % paraformaldehyde를 해산 ° C 정기적으로 동요와 함께. 사용하기 전에 실온에 쿨. 이 솔루션은 독성이며, 지정 폐기물 용기에 폐기해야합니다. </li><li> 0.3 % (V / V) 솔루션을 얻기 위해 PBS에 트리톤 X - 100을 추가하여 permeabilization 솔루션을 준비합니다. </li><li> 사용할 차 항체를 마련하는 데 사용한 것과 같은 종류의 혈청과 PBS에 5 %의 차단 솔루션을 준비합니다. 당신은 당나귀 방지 래빗 알렉사 플루어 568를 통해 타겟 항원에 대한 토끼 항체를 감지하는 경우 예를 들어, 5 % 당나귀 혈청을 포함하는 차단 솔루션을 준비합니다. 4 스토어 ° C. </li><li> 5% 차단 솔루션 항체의 적절한 농도를 추가하여 기본 항체 솔루션을 준비합니다. </li><li> 사용하기 바로 전에 차 항체 용액을 준비합니다. 핵 counterstain DAPI와 같은 5% 차단 솔루션 phalloidin 같은 다른 organelle 마커와 함께 제조 업체의 권장 농도에 형광단 복합 항체를 추가합니다. 스토리지가 필요한 경우, 4 어둠의 솔루션을 유지 ° C를 사용까지. </li><li> immunostained 세포의 저장을위한 50 % 글리세롤 / PBS 용액 (V / V)를 준비합니다. 또는 Vectashield 사용할 수 있습니다. </li></ol> 5. 셀의 고정 및 Immunostaining <ol><li> 다음 프로토콜은 24 잘 접시에 NZCs의 고정 및 얼룩을 위해 설계되었습니다. 주어진 볼륨은 단일 잘위한 것입니다. 시약은 부드럽게 세포의 분리를 피하기 위해 모든 단계 동안 pipetted되어야하고, 평판 교반는 인큐베이션 단계에서 사용하지 않는 것이 좋습니다. </li><li> 부드럽게 1 ML micropipette와 매체를 제거하고 부착 교양 세포 4% PFA 0.5 ML를 추가합니다. 상온에서 그대로 15 분 동안 품어. </li><li> 4퍼센트에게 PFA를 제거하고 0.5 ML 당 우물의 permeabilization 솔루션을 추가합니다. 실온에서 10 분 알을 품다. </li><li> permeabilization 솔루션을 제거하고 부드럽게 씻어 당 PBS 0.5 ML로 두 번 씻어. </li><li> 솔루션을 차단 0.5 ML를 추가하고 60 분 실온에서 알을 품다. </li><li> 차단 솔루션을 제거하고 0.225 ML 차 항체 솔루션을 추가합니다. </li><li> 4에서 2 시간 또는 숙박에 대해 실온에서 품어 ° C. </li><li> 기본 항체 솔루션을 제거하고 부드럽게 도리린스 당 PBS 0.5 ML로 두 번 nse. </li><li> 0.225 ML 차 항체 솔루션을 추가합니다. 60 분 상온에서 어둠의 번호판을 품어. </li><li> 차 항체 용액을 제거하고 부드럽게 씻어 당 PBS 0.5 ML로 두 번 씻어. </li><li> 50 % 글리세롤 / PBS 용액 (V / V) 또는 잘 표면의 바닥을 감추기에 충분 할만큼 Vectashield의 ​​0.3 ML를 추가합니다. </li><li> epifluorescence 현미경하거나 저장과 이미지 전지는 4 호일에 싸여 ° C. </li></ol> 6. 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/2555/2555fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. NZCs이 cm 2 당 200,000 개 셀로 도금, E17.5 배아에서 정화 및 24 시간 총 37 ° C에서 incubated했다. 세포 immunofluorescent 얼룩하기​​ 전에 Leica DM의 IRB 거꾸로 현미경으로 위상 대조적으로 몇 군데 있었다. 문화 24 시간 이후 NZCs의 (A) 20X 위상 콘트라스트 볼 수 있습니다. (B) 세포 고정과 nephron의 전구 세포에 대한 구체적인 토끼 방지 PAX2 항체 (적색)과 보조 알렉사 플루어 568 복합 당나귀 방지 토끼를 사용하여 얼룩되었습니다. 블루 핵은 DAPI와 counterstained합니다. 문화 24 시간 후에 nephron의 progenitors의 클러스터 (C) 40X 위상 콘트라스트보기 (중심). (D) LacZ + Foxd1 모터의 제어하에 β - galactosidase를 표현 Foxd1 LacZ 스트레인의 배아. Foxd1에서 격리 NZCs의 40X 이미지는 개발 신장의 nephrogenic 구역 내에서 stromal 세포 인구 표시됩니다. 세포는 F - 굴지 마커 phalloidin (오레건 녹색 차 공액), 핵 얼룩 DAPI (블루)와 토끼 방지 β - galactosidase 물들일 했어요 - Foxd1의 검출을위한 (보조 알렉사 플루어 당나귀 안티 래빗 568) + stromal 세포 ( 빨간색).

<ol>
	<li>Blank, U., Brown, A., Adams, D. C., Karolak, M. J., Oxburgh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP7+promotes+proliferation+of+nephron+progenitor+cells+via+a+JNK-dependent+mechanism.">BMP7 promotes proliferation of nephron progenitor cells via a JNK-dependent mechanism.</a> Development. 136, 3557-3566 (2009).</li><li>Brunskill, E. W., Aronow, B. J., Georgas, K., Rumballe, B., Valerius, M. T., Aronow, J., Kaimal, V., Jegga, A. G., Grimmond, S., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atlas+of+gene+expression+in+the+developing+kidney+at+microanatomic+resolution.">Atlas of gene expression in the developing kidney at microanatomic resolution.</a> Developmental Cell. 15, 781-791 (2008).</li><li>Godin, R. E., Takaesu, N. T., Robertson, E. J., Dudley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+BMP7+expression+during+kidney+development.">Regulation of BMP7 expression during kidney development.</a> Development. 125, 3473-3482 (1998).</li><li>Grobstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inductive+epitheliomesenchymal+interaction+in+cultured+organ+rudiments+of+the+mouse.">Inductive epitheliomesenchymal interaction in cultured organ rudiments of the mouse.</a> Science. 118, 52-55 (1953).</li><li>Grobstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenetic+interaction+between+embryonic+mouse+tissues+separated+by+a+membrane+filter.">Morphogenetic interaction between embryonic mouse tissues separated by a membrane filter.</a> Nature. 172, 869-870 (1953).</li><li>Hatini, V., Huh, S. O., Herzlinger, D., Soares, V. C., Lai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+role+of+stromal+mesenchyme+in+kidney+morphogenesis+revealed+by+targeted+disruption+of+Winged+Helix+transcription+factor+BF-2.">Essential role of stromal mesenchyme in kidney morphogenesis revealed by targeted disruption of Winged Helix transcription factor BF-2.</a> Genes and Development. 10, 1467-1478 (1996).</li><li>Oxburgh, L., Chu, G. C., Michael, S. K., Robertson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGFb+superfamily+signals+are+required+for+morphogenesis+of+the+kidney+mesenchyme+progenitor+population.">TGFb superfamily signals are required for morphogenesis of the kidney mesenchyme progenitor population.</a> Development. 131, 4593-4605 (2004).</li><li>Srinivas, S., Watanabe, T., Lin, C. S., William, C. M., Tanabe, Y., Jessell, T. M., Costantini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre+reporter+strains+produced+by+targeted+insertion+of+EYFP+and+ECFP+into+the+ROSA26+locus.">Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus.</a> BMC Developmental Biology. 1, 4-4 (2001).</li><li>Yu, J., Carroll, T. J., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+regulates+proliferation+and+differentiation+of+mesenchymal+cells+in+the+mouse+metanephric+kidney.">Sonic hedgehog regulates proliferation and differentiation of mesenchymal cells in the mouse metanephric kidney.</a> Development. 129, 5301-5312 (2002).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

이 프로토콜에서는 배아 신장의 nephrogenic 영역에서 세포를 분리하여 문화하는 방법을 설명합니다. 그것은 처음 nephrogenic 영역 (빈 외., 2009)의 세포에 BMP7 치료의 효과에 관한 연구의 일환으로 출판하는 방법의 개발이다. 초기 연구에서는 NZC 인구 내에서 대표 셀 유형을 특성화하기 위해 일련의 실험을 실시했다. (스리 니 바스 외, 2001.; 유 외를, 간단히, 대뇌 피질의 기질 (Foxd...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Watchmaker&#x2019;s forceps #5</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roboz</td>
<td>RS-4905</td>
<td>2 pairs required</td>
</tr>
<tr>
<td>Collagenase A</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>10 103 578 001</td>
<td>Wear mask</td>
</tr>
<tr>
<td>Porcine Pancreatin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P8096</td>
<td>Wear mask</td>
</tr>
<tr>
<td>DPBS w/ Ca, Mg</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>17-513F</td>
<td>With Mg &amp; Ca</td>
</tr>
<tr>
<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BioWhittaker</td>
<td>14-901E</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HBSS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>14175</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KSFM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>10724-011</td>
<td>without added growth factors</td>
</tr>
<tr>
<td>L-Glutamine 200mM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G7513</td>
<td>Use @ 1% v/v</td>
</tr>
<tr>
<td>PenStrep 10,000 U penicillin / ml 10 mg streptomycin / ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P4333</td>
<td>Use @ 1% v/v</td>
</tr>
<tr>
<td>Fibronectin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>356008</td>
<td>Supplied as powder</td>
</tr>
<tr>
<td>24 well culture plate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific </td>
<td>142485</td>
<td>Nunclon</td>
</tr>
<tr>
<td>DPBS w/o Mg &amp; Ca</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>17-512F</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5mL polystyrene tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>352235</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DNase (1 U/&mu;l)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>18068-015</td>
<td>4 &mu;l per 1.5 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>40 micron cell-strainer </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>352235</td>
<td>w/cap and tube</td>
</tr>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P6148</td>
<td>Use @ 4 % w/v</td>
</tr>
<tr>
<td>Triton X100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>VW3929-2</td>
<td>Use @ 0.3 % v/v</td>
</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P3813</td>
<td>Supplied as powder</td>
</tr>
<tr>
<td>Donkey serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson ImmunoResearch</td>
<td>017-000-121</td>
<td> Use @ 5 % v/v</td>
</tr>
<tr>
<td>Rabbit anti-PAX2 </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>71-6000</td>
<td>Dilute 1:100</td>
</tr>
<tr>
<td>Rabbit anti-&beta;-gal</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MP Biomedicals</td>
<td>559762</td>
<td>Dilute 1:200</td>
</tr>
<tr>
<td>Oregon Green 488 phalloidin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>O7466</td>
<td>Dilute 1:200</td>
</tr>
<tr>
<td>Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 568</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A10042</td>
<td>Dilute 1:200</td>
</tr>
<tr>
<td>DAPI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>D1306</td>
<td>Dilute 1:5000</td>
</tr>
<tr>
<td>Vectashield</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>H-1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycerol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD</td>
<td>GX0185-6</td>
<td>Mix 50 % with H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>RNeasy Micro Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>74004</td>
<td>Use "DNase on column" protocol</td>
</tr>
<tr>
<td>Transfer pipettes, 3ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>357575</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

isolation and culture of cells from the nephrogenic zone of the embryonic mouse kidney

신장의 배아 개발 광범위 organogenesis의 상피 - mesenchymal 상호 작용을위한 모델로하고 선천성 신장 질환의 기원의 이해를 얻기 위해 두 연구되었습니다. 최근 nephrogenic 운명 향해 순진한 배아 줄기 세포를 핸들의 가능성은 재생 의학의 새로운 분야에서 살펴되었습니다. 마우스의 유전자 연구가 신장 개발에 필요한 몇 가지 경로를 파악해야하고, 장기에서 유전자 전사의 글로벌 카탈로그는 최근 생성되었습니다 <a href="http://www.gudmap.org/">http://www.gudmap.org/을</a> 필수 발달 기능의 수많은 후보 레귤레이터를 제공합니다. 쥐 신장의 Organogenesis는 장기 문화를 공부 할 수 있으며, 여러 보고서 중 후보 단백질을 적용하거나 siRNA 또는 morpholinos를 사용하여 후보 유전자의 표현을 쓰러뜨린의 결과를 분석하기 위해이 방법을 사용했습니다. 교양 장기 macromolecules 및 바이러스 입자의 소형 세포외 기질 제한 확산을 포함 그러나 개발 신장에 줄기 / 전구 세포의 차별 대 갱신을 조절 신호의 연구 기관 문화의 적용이 제한됩니다. 우리가 분화의 상피 유도에서 격리 개발 신장 전의 생체내의 nephrogenic 영역 또는 전구 세포의 틈새를 수립 차 전지 시스템을 개발했습니다 신장에서 줄기 / 전구 세포의 틈새에 영향을 미치는 이벤트를 신호 세포를 연구합니다. 제한 효소 소화 사용 nephrogenic 영역 전지는 E17.5에서 신장을 개발로부터 해방 선택하실 수 있습니다. 여과 후,이 세포가 최적의 조건을 사용하여 불규칙한 monolayer로 교양 수 있습니다. 마커 유전자 분석은 이러한 문화가 생체내에 nephrogenic 영역의 특성 세포 유형의 분포를 포함하는 것을 보여줍니다, 그들은 문화의 기간 동안 적절한 마커 유전자 발현을 유지. 이 전지는 작은 분자 및 재조합 단백질 치료에 매우 접근하고 있으며, 중요한 것은 역시 크게 후보 줄기 / 전구 세포 조절 효과의 연구를 용이하게 바이러스 전달에. 이러한 증식과 세포 죽음뿐만 아니라 생체내의 nephron의 줄기 / 전구 세포의 특성을 분자 마커의 표현의 변경과 같은 기본적인 세포 생물 학적 매개 변수가 성공적으로 실험 결과로 사용할 수 있습니다. 이 소설 일차 전지 기술을 사용하여 우리 연구실에서 진행중인 작업은 nephron의 줄기 / 전구 세포의 자기 갱신 대 분화의 규정을 관할 기본적인 메커니즘을 발견하는 것을 목표로하고있다.

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Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

이 보고서에서 우리는 개발 신장의 줄기 / 전구 세포를 조절 신호 경로를 연구하는 데 사용할 수있는 배아 마우스 신장에서 전구 세포의 틈새의 격리와 문화에 대한 방법을 설명합니다. 이러한 교양 세포가 작은 분자 및 재조합 단백질 치료에 매우 접근하고 있으며, 또한 중요한 후보 경로의 효율적인 조작을 허용 바이러스 전달에.

배아 마우스 신장의 Nephrogenic 지대의 세포의 분리 및 문화

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

isolation-culture-cells-from-nephrogenic-zone-embryonic-mouse

Research

JoVE Journal

Biology

18.0K 조회수.  Maine Medical Center Research Institute. 이 보고서에서 우리는 개발 신장의 줄기 / 전구 세포를 조절 신호 경로를 연구하는 데 사용할 수있는 배아 마우스 신장에서 전구 세포의 틈새의 격리와 문화에 대한 방법을 설명합니다. 이러한 교양 세포가 작은 분자 및 재조합 단백질 치료에 매우 접근하고 있으며, 또한 중요한 후보 경로의 효율적인 조작을 허용 바이러스 전달에.

비디오: Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

절연 및 마우스 배아 새싹 세포의 유도

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

연구

생물학

Isolation and Culture of Avian Embryonic Valvular Progenitor Cells

Proper formation and function of embryonic heart valves is critical for developmental progression. The early embryonic heart is a U-shaped tube of endocardium surrounded by myocardium. The myocardium secretes cardiac jelly, a hyaluronan-rich gelatinous matrix, into the atrioventricular (AV) junction and outflow tract (OFT) lumen. At stage HH14 valvulogenesis begins when a subset of endocardial cells receive signals from the myocardium, undergo endocardial to mesenchymal transformation (EMT), and invade the cardiac jelly. At stage HH25 the valvular cushions are fully mesenchymalized, and it is this mesenchyme that eventually forms the valvular and septal apparatus of the heart. Understanding the mechanisms that initiate and modulate the process of EMT and cell differentiation are important because of their connection to serious congenital heart defects. In this study we present methods to isolate pre-EMT endocardial and post-EMT mesenchymal cells, which are the two different cell phenotypes of the prevalvular cushion. Pre-EMT endocardial cells can be cultured with or without the myocardium. Post-EMT AV cushion mesenchymal cells can be cultured inside mechanically constrained or stress-free collagen gels. These 3D in vitro models mimic key valvular morphogenic events and are useful for deconstructing the mechanisms of early and late stage valvulogenesis.

This article will provide a method for isolating and culturing quail or chicken HH14- valve endocardial cells and HH25 valve cushion mesenchymal cells.

조류 배아 판막병 전구 세포의 분리 및 문화

Proper formation and function of embryonic heart valves is critical for developmental progression. The early embryonic heart is a U-shaped tube of ...

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of non-pigmented inner and pigmented outer cell layers, and the clonal RSC colonies that arise from a single pigmented cell from the CE are made up of both pigmented and non-pigmented cells which can be differentiated to form all the cell types of the neural retina and the RPE. There is some controversy about whether all the cells within the spheres all contain at least some pigment4; however the cells are still capable of forming the different cell types found within the neural retina1-3. In some species, such as amphibians and fish, their eyes are capable of regeneration after injury5, however; the mammalian eye shows no such regenerative properties. We seek to identify the stem cell in vivo and to understand the mechanisms that keep the mammalian retinal stem cells quiescent6-8, even after injury as well as using them as a potential source of cells to help repair physical or genetic models of eye injury through transplantation9-12. Here we describe how to isolate the ciliary epithelial cells from the mouse eye and grow them in culture in order to form the clonal retinal stem cell spheres. Since there are no known markers of the stem cell in vivo, these spheres are the only known way to prospectively identify the stem cell population within the ciliary epithelium of the eye.

In this video, we will demonstrate how to isolate retinal stem cells from the ciliary epithelium of the mouse eye and grow them in culture to form clonal retinal spheres. The spheres that are isolated possess the cardinal properties of stem cells: self-renewal and multipotentiality.

마우스 아이의 망막 줄기 세포의 분리

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

유도 만능의 줄기 세포에서 파생 마우스의 생성

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

성인 마우스 앞니의 치아 상피 줄기 세포의 분리 및 문화

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

쥐과 밸브 내피 세포의 분리

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Protein Isolation from the Developing Embryonic Mouse Heart Valve Region

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis method may not be sufficiently sensitive to detect a protein of interest. To overcome these difficulties, we examined protocols for obtaining protein from adult human cardiac valves and modified these protocols for the developing early embryonic mouse counterparts. In brief, the mouse embryonic aortic valve regions, including the aortic valve and surrounding aortic wall, are collected in the minimal possible volume of a Tris-based lysis buffer with protease inhibitors. If required based on the breeding strategy, embryos are genotyped prior to pooling four embryonic aortic valve regions for homogenization. After homogenization, an SDS-based sample buffer is used to denature the sample for running on an SDS-PAGE gel and subsequent western blot analysis. Although the protein concentration remains too low to quantify using spectrophotometric protein quantification assays and have sample remaining for subsequent analyses, this technique can be used to successfully detect and semi-quantify phosphorylated proteins via western blot from pooled samples of four embryonic day 13.5 mouse aortic valve regions, each of which yields approximately 1 &#956;g of protein. This technique will be of benefit for studying cell signaling pathway activation and protein expression levels during early embryonic mouse valve development.

The analysis of protein expression in young embryonic mouse valves has been hampered by the limited tissue available. This manuscript provides a protocol for preparing protein from developing embryonic mouse valve regions for western blot analysis.

개발 배아 마우스 심장 밸브 지역에서 단백질 분리

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

분리 및 마우스 대동맥 내피 세포의 차 문화

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation of Enteric Glial Cells from the Submucosa and Lamina Propria of the Adult Mouse

The enteric nervous system (ENS) consists of neurons and enteric glial cells (EGCs) that reside within the smooth muscle wall, submucosa and lamina propria. EGCs play important roles in gut homeostasis through the release of various trophic factors and contribute to the integrity of the epithelial barrier. Most studies of primary enteric glial cultures use cells isolated from the myenteric plexus after enzymatic dissociation. Here, a non-enzymatic method to isolate and culture EGCs from the intestinal submucosa and lamina propria is described. After manual removal of the longitudinal muscle layer, EGCs were liberated from the lamina propria and submucosa using sequential HEPES-buffered EDTA incubations followed by incubation in commercially available non-enzymatic cell recovery solution. The EDTA incubations were sufficient to strip most of the epithelial mucosa from the lamina propria, allowing the cell recovery solution to liberate the submucosal EGCs. Any residual lamina propria and smooth muscle was discarded along with the myenteric glia. EGCs were easily identified by their ability to express glial fibrillary acidic protein (GFAP). Only about 50% of the cell suspension contained GFAP+ cells after completing tissue incubations and prior to plating on the poly-D-lysine/laminin substrate. However, after 3 days of culturing the cells in glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF)-containing culture media, the cell population adhering to the substrate-coated plates comprised of &#62;95% enteric glia. We created a hybrid mouse line by breeding a hGFAP-Cre mouse to the ROSA-tdTomato reporter line to track the percentage of GFAP+ cells using endogenous cell fluorescence. Thus, non-myenteric enteric glia can be isolated by non-enzymatic methods and cultured for at least 5 days.

Here, we describe the isolation of enteric-glial cells from the intestinal-submucosa using sequential EDTA incubations to chelate divalent cations and then incubation in non-enzymatic cell recovery solution. Plating the resultant cell suspension on poly-D-lysine and laminin results in a highly enriched culture of submucosal glial cells for functional analysis.

Submucosa 및 성인 마우스의 Lamina Propria 장의 Glial 세포의 고립

The enteric nervous system (ENS) consists of neurons and enteric glial cells (EGCs) that reside within the smooth muscle wall, submucosa and lamina ...

Simultaneous Isolation and Culture of Atrial Myocytes, Ventricular Myocytes, and Non-Myocytes from an Adult Mouse Heart

The isolation and culturing of cardiac myocytes from mice has been essential for furthering the understanding of cardiac physiology and pathophysiology. While isolating myocytes from neonatal mouse hearts is relatively straightforward, myocytes from the adult murine heart are preferred. This is because compared to neonatal cells, adult myocytes more accurately recapitulate cell function as it occurs in the adult heart in vivo. However, it is technically difficult to isolate adult mouse cardiac myocytes in the necessary quantities and viability, which contributes to an experimental impasse. Furthermore, published procedures are specific for the isolation of either atrial or ventricular myocytes at the expense of atrial and ventricular non-myocyte cells. Described here is a detailed method for isolating both atrial and ventricular cardiac myocytes, along with atrial and ventricular non-myocytes, simultaneously from a single mouse heart. Also provided are the details for optimal cell-specific culturing methods, which enhance cell viability and function. This protocol aims not only to expedite the process of adult murine cardiac cell isolation, but also to increase the yield and viability of cells for investigations of atrial and ventricular cardiac cells.

A method is described for the simultaneous isolation of myocytes and non-myocytes from both the atria and ventricles of a single adult mouse heart. This protocol results in consistent yields of highly viable cardiac myocytes and non-myocytes and details optimal cell-specific culture conditions for phenotyping and in vitro analysis.

성인용 마우스 심장에서 심방 심근 세포, 심실 심근 세포 및 비근구의 동시 격리 및 문화

The isolation and culturing of cardiac myocytes from mice has been essential for furthering the understanding of cardiac physiology and pathophysiology. ...