이 작품은 검사서 오대호 Bioenergy 연구 센터 (DE-FC02-07ER64494 과학 검사서 BER 사무실)에서 교부금에 의해 지원되었다. 우리는 박사 Xudong 장 및 프로토콜을 마무리 유용한 기술적인 토론과 소중한 의견에 대한 자신의 그룹 회원들에게 감사를드립니다.

1. 샘플 준비 및 산성 추출 <ol><li> 동결 건조 토양 샘플 필드 컬렉션 후. </li><li> 볼 밀, 토양 연삭기, 또는 박격포와 유봉을 사용하여 토양 샘플을 갈아서하고 homogenize. </li><li> 25 ML의 가수 분해 플라스크에 토양 샘플을 (&gt; 0.3 MG N을 포함)의 무게. </li><li> 각 가수 분해 플라스크에 10 ML 6M HCL을 추가 단단히 N 2 flasks의 가스, 뚜껑을 채운다. </li><li> 자동 타이머 스위치를 사용하여 8 시간 105 ° 인큐베이터에서 C에서 Hydrolyze. </li></ol> 2. 샘플 정제 <ol><li> 인큐베이터에서 flasks 제거, 실온에 좋아. </li><li> 소용돌이로 믹스, 각 플라스크 ~ 100 μL 내부 표준 myo-이노시톨을 (물 1 MG ML -1) 추가합니다. </li><li> ST / NS 24 / 안정성을위한 플라스틱 컵에 설정된 40 관절, 200 ML 배 모양의 flasks로 배수 플라스틱 유입​​ 경로를 설정합니다. </li><li> 공간 워트 먼지 # 2 질적 동아리 (11cm 직경) 숙소와 퍼널을에 세트로. </리&gt; <li> 소용돌이 각 가수 분해 플라스크를, 그리고 (당신이 더 이상의 물을 ~ 3 ML 각 플라스크를 헹굴 수 있음) 필터링 깔때기에 슬러리를 붓는다. </li><li> ~ 45 ° C, 신청 진공에서 회전 증발기를 사용하여 여과액 말리. </li><li> 3 ~ 5 ML 물 (필요한 경우 초음파 목욕을 사용) 각 배 플라스크에서 말린 잔류물을 Resuspend, 그리고 40 ML 테플론 튜브에 부어, 물과의 두 번째 나누어지는로 플라스크를 씻어. </li><li> 6.8 석출물 금속 이온과 다른 유기 분자로 1M 코이 솔루션을 사용하여 - 6.6로 산도를 조정합니다. </li><li> 10 분 2000 rcf에서 원심 분리하여 precipitates 제거합니다. </li><li> 40 ML 유리관에 뜨는을 붓고, -20에서 튜브 parafilm와 개방, 동결 ° C를 포함, 다음 parafilm에 구멍을 찌르지. </li><li> 모든 액체를 제거하는 냉동 뜨는을 동결 건조. </li><li> 3 ML 건조 메탄올과 찌꺼기를 해산 (원하는 경우 초음파 목욕을 사용하여) 철저 vortexing, 캡 튜브, 그리고 이주 10 분 동안 2,000 rcf에서 원심 분리기소금 아웃. </li><li> 3 ML 원뿔 반응 유리병에 뜨는 전송, 45 ° C (또는 원하는 경우 건조 질소 가스의 부드러운 스트림 이하)에서 RapidVap 기계 건조에 증발. </li><li> 각 유리병에,, 100 μL 복구 표준 N-methylglucamine (물 1 MG ML -1)과 1 ML H 2 O를 추가 -20시 유리병의 parafilm와 입을, 동결 ° C를 포함, parafilm을 구멍이 후 건조 동결 . </li><li> 표준을 만들기 : 100 μL muramic 산성 (메탄올의 0.5 MG ML -1), 100 μL 글루코사민 (물 1 MG ML -1), 100 μL myo - 이노시톨 (물 1 MG ML -1), 100 μL N을 추가 methylglucamine (물 1 MG ML -1), 1 ML H 2 O, parafilm 각 유리병, -20 ° C에서 꼼짝 다음, 동결 건조, parafilm을 구멍. </li></ol> 3. Derivati​​zation <ol><li> 32 MG ML -1 히드록 실 아민 하이드로 클로라이드 40 밀리그램 ML -1 4 - 디메틸 아미노 - 평을 포함 derivatization 시약을 준비한다의 ridine 피리딘 - 메탄올 (4시 1분 V / V). </li><li> 단단히 모자, 그리고 철저하게 와동, reactivials 각 derivati​​zation 시약 300 μL를 추가합니다. </li><li> 35분에 대해 75-80 ° C의 물 목욕 (물론 어떤 물이 튜브를 입력할 수 있도록 피하기 위해 튜브를 봉인)에 튜브를 넣고. </li><li> 물 목욕 및 실내 온도에 시원한에서 튜브를 제거합니다. </li><li> 3 ML의 reactivials, 단단히 캡, 그리고 철저히 와동 각 1 ML 아세트산 무수물를 추가한 후 75-80 25분 대한 ° C 물 목욕으로 재가열. </li><li> 물 목욕 및 실내 온도에 시원한에서 튜브를 제거합니다. </li></ol> 4. 분리 및 측정 <ol><li> 각 유리병, 단단히 캡, 그리고 철저하게 소용돌이에 1.5 ML의 dichloromethane을 추가합니다. </li><li> 솔루션은 두 개의 구문을 별도 때까지 그대로 앉아있을 수 있도록 각 유리병, 단단히 뚜껑 철저히 와동 1 ML 1M HCL을 추가, 기음 1000 μL pipettor를 사용하여 상위 (수성) 단계를 버리고. </li><li> 같은 F에서ashion, 유기농 단계 3 번씩를 추출하지만, 한 ML H 2 O와 (마지막 세척 단계와 수성 상위 단계의 모든이 제거되었음을 보장하기 위해 특별한 처리). </li><li> 45 RapidVap를 사용하여 최종 솔루션을 건조 ° C (또는 건조한 원하는 경우 질소 가스를 사용하여). </li><li> 300 μL 아세트산 에틸 헥산 (1:1 V / V) 및 소형 볼륨 넣고 단단히 뚜껑 2 개 ML 호박 나사 캡 튜브에 이송에 디졸브. </li><li> ; 고정 위상 5퍼센트 페닐 - 95 % 메틸 polysiloxane (DB-5 또는 동급) 수소와 30m 길이, 0.25 밀리미터 ID, 0.25 음 필름 두께 : 부량 들어, 융합된 실리카 무극 성 모세관 컬럼을 사용하여 GC-FID로 분석 또는 헬륨 캐리어 가스와 같은, 0.5 ML 분 -1 일정한 흐름에서. 크로마 토그래피는 프리미엄 &quot;불활성&quot;단계와 수소 캐리어 가스에 좋다지만,보다 일반적인 종류와 헬륨으로 허용됩니다. 감지기 설정은 300입니다 ° C, 400 ML 분 -1 공기 30 ML 분 -1 질소 및 모두수소 화장 가스. 사출 및 오븐 매개 변수는 다음과 같습니다 ° C ~ 250으로 설정 GC 입구 1 개 μL 분할 주입 (30:1), 초기 오븐 온도 120 ° C, 1 분 개최, 10 오븐 온도를 증가 ° C 분. -1 250 ° C, 2.5 분, 잡아;. 270까지 진입로 ° C ~ 20 ° C 분 -1, 2 분 개최, 290까지 진입로 ° C ~ 20 ° C 분 -1, 5 분 누르고 있습니다. 캐리어 가스 유량을 조절하므로 250 ° C에서 이노시톨, 글루코사민과 muramic 산 유도체 elute, 270에서 N-methylglucamine elutes ° C. </li></ol> 5. 파생 검증 <ol><li> 분자 이온을 파악하고 유도체의 분자량을 결정하는 소프트 이온화 LC-ESI-TOF-MS를 사용합니다. </li><li> 파생의 대상 이온을 조사하기 위해 감도 향상을위한 GC-EI-MS-SIM 또는 GC-EI-MSMS을 사용하십시오. </li><li> 파생 상품의 준비에 대해 여러 isotopically 라벨이 시약을 사용하고 대량 시프트를 사용하여MS의 이러한 isotopically 표시된 파생 상품의 분자 이온과 이온 조각을 조사합니다. </li></ol> 6. 대표 결과 방식의 프로토콜은 주로 4 단계를 구성되어 산성 소화, 샘플 정제, derivatization 및 GC 결정 (그림 1). 글루코사민 및 표준 주식과 토양 샘플에서 muramic 산성에 대한 분석의 예제는 그림 2에 표시됩니다. 글루코사민과 muramic 산, mannosamine 및 galactosamine (글루코사민의 두 isomers) 이외에도 메소드를 사용하여 동시에 확인할 수 있습니다. 내부 표준 myo - 이노시톨과 관련한 표준의 반응 요인에 따라 토양 샘플에서 이러한 생체를 정할 수 있습니다. 복구 기준은 질적 derivati​​zation 과정을 모니터링하는 데 사용되었습니다. aldononitrile 아세트산 derivatized 글루코사민과 muramic 산성 형성을위한 구조는 그림 3에 표시됩니다 </strong&gt;. 파생 상품의 제안된 구조는 감도 향상, 또는 소프트 이온화 LC-ESI-TOF-MS 8시 GC-기독교-SIM에 의해 결정되었다; 전자 이온화 따라 형성된 이온 조각 제안된 구조의 이온 스펙트럼을 비교하여 연구되었다 샘플은 다양한 동위 원소의 incorporations 11으로 준비했습니다. 그림 4는 지배적인 이온의 질량 변화를 보여주는 비 라벨 대리인, D-아세트산 경석고 및 U -13 C, 글루코사민 사용한 세 개의 시나리오에서 aldononitrile 아세테이트 derivatized 글루코사민의 M / Z 187.에게 기타 자세한 정보 및 설명은 우리의 최근 출판물 8, 11 참조된 수 있습니다. 이 전략은 파생 화학을 연구하는 모델이 될 수 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3767/3767fig1.jpg" /> 글루코사민의 분석 및 토양의 muramic 산성에 대한 프로토콜의 그림 1. 측정 플로우 차트샘플. 산성 소화, 정화, Derivati​​zation 및 GC 결정 : 프로토콜은 주로 4 단계가 포함되어 있습니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3767/3767fig2.jpg" /> 그림 2. 표준 및 토양에 대한 이노시톨, 글루코사민, muramic 산, mannosamine, galactosamine 및 methylglucamine의 aldononitrile의 acetates의 GC-FID chromatograms. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3767/3767fig3.jpg" /> 그림 3. aldononitrile 아세트산 derivatized 글루코사민과 muramic 산성의 형성 구성표. 숫자 1은 nitrile 반응을 나타냅니다. 숫자 2는 아세틸화를 나타냅니다. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3767/3767fig4_lg.jpg"><img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3767/3767fig4.jpg" /></a> 그림 4. 지배 이온 structur와 관련된 aldononitrile 아세테이트 derivatized 글루코사민의 질량 스펙트럼EI 모드 하에서 네;은 ()가 아닌 라벨이 대리인으로 준비, (B) D-아세트산 경석고, (C) U -13 C-글루코사민. 스타가 무거운 동위 원소 원자 또는 동위 원소 그룹을 나타냅니다.

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G., Emmerling, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+evaluating+human+impact+on+soil+microorganisms+based+on+their+activity,+biomass,+and+diversity+in+agricultural+soils.">Methods for evaluating human impact on soil microorganisms based on their activity, biomass, and diversity in agricultural soils.</a> Journal of Plant Nutrition and Soil Science. 169, 295-309 (2006).</li><li>Guggenberger, G., Frey, S. D., Six, J., Paustian, K., Elliott, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+and+fungal+cell-wall+residues+in+conventional+and+no-tillage+agroecosystems.">Bacterial and fungal cell-wall residues in conventional and no-tillage agroecosystems.</a> Soil Science Society of America Journal. 63, 1188-1198 (1999).</li><li>Amelung, W., Lal, R., Kimble, J. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric+characterization+of+amino+sugar+aldononitrile+acetate+derivatives+used+for+isotope+enrichment+assessment+of+microbial+residues.">Mass spectrometric characterization of amino sugar aldononitrile acetate derivatives used for isotope enrichment assessment of microbial residues.</a> Soil Biology and Biochemistry. 42, 904-909 (2010).</li><li>Liang, C., Pedersen, J. A., Balser, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminoglycoside+antibiotics+may+interfere+with+microbial+amino+sugar+analysis.">Aminoglycoside antibiotics may interfere with microbial amino sugar analysis.</a> Journal of Chromatography A. 1216, 5296-5301 (2009).</li></ol>

우리는 공개 할게 없다.

aldononitrile 아세트산 derivati​​zed 글루코사민과 muramic 산성의 분석을 위해 제시 GC 기반 방식은 토양에서 추출한 이러한 아미노산 설탕을 계량하기 위해 비교적 빠른 방법을 제공합니다. 파생 상품은 화학적으로 안정, 한 분석에서 확인할 수 있습니다. 방법은 토양 샘플에 국한되지 않고, 비 토양 매트릭스에서 샘플에 대해 간단하게 할 수 있습니다. 이 방법에 사용되는 진공 ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> Muramic 산 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> M2503-25MG </td></tr><tr><td> D-(+)-글루코사민 염산염 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> G1514-100G </td></tr><tr><td> N-메틸-D-glucamine </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> M2004-500G </td></tr><tr><td> Myo - 이노시톨 </td><td> 피셔 과학 </td><td> A307003G025 </td></tr><tr><td> 메탄올 (건조) </td><td> Acros의 유기물 </td><td> AC3269500​​10 </td></tr><tr><td> 4 - 디메틸 아미노 - 피리딘 </td><td> Acros의 유기물 </td><td> AC148270050 </td></tr><tr><td> 에틸 아세테이트 </td><td> VWR 인터내셔널 </td><td> BJGC100-4 </td></tr><tr><td> Hydroxlamine 하이드로 클로라이드 </td><td> 피셔 과학 </td><td> H330-100 </td></tr><tr><td> 피리딘 </td><td> 피셔 과학 </td><td> P368-500 </td></tr><tr><td> 아세트산 무수물 </td> &lt;TD&gt; 피셔 과학 </td><td> A10-100 </td></tr><tr><td> Dichloromethane (메틸렌 클로라이드) </td><td> 피셔 과학 </td><td> D37-500 </td></tr><tr><td> 헥산 </td><td> 피셔 과학 </td><td> H303-4 </td></tr><tr><td> 염산의 산성 (6M) </td><td> 피셔 과학 </td><td> S456-4 </td></tr><tr><td> 히드록 실 아민 하이드로 클로라이드 -15 N </td><td> 아이콘 서비스 </td><td> IN5280 </td></tr><tr><td> 아세트산 무수물 -2 H (D 6 C 4 O 3) </td><td> Acros의 유기물 </td><td> AC174670050 </td></tr><tr><td> D-글루코오스-U -13 C </td><td> 캠브리지 동위 원소 연구실 </td><td> CLM-1396-1 </td></tr><tr><td> 암모늄 sufate -15 N </td><td> 캠브리지 동위 원소 연구실 </td><td> NLM-713-1 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 장비의 명칭 </td><td> 회사 </td><td> 유형 </td></tr><tr><td> 급속 Vap </td&gt; <td> LabConco </td><td> 790,002 </td></tr><tr><td> Vacum 펌프 </td><td> KNF Neuberger </td><td> D-79112 </td></tr><tr><td> 가수 분해 플라스크 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 06 423A </td></tr><tr><td> Derivati​​zation의 microvial </td><td> 피셔 과학 </td><td> 06-100E </td></tr><tr><td> GC </td><td> 휴렛 팩커드 </td><td> 6890 </td></tr><tr><td> MS </td><td> 휴렛 팩커드 </td><td> 5972 </td></tr><tr><td> LC-ESI-TOF-MS </td><td> 애질런트 </td><td> 애질런트 1200 시리즈 HPLC 시스템은 애질런트 LC / MSD-TOF로 결합 </td></tr></tbody></table>

gc-based detection of aldononitrile acetate derivatized glucosamine and muramic acid for microbial residue determination in soil

특성화 미생물에 대한 양적 접근 방식은 생태계 내에서 미생물의 상태와 기능의 폭넓은 이해를위한 열쇠입니다. 미생물 분석을 위해 현재의 전략은 전통적인 실험실 문화에 종속적인 기술과 직접 추출 및 특정 생체 1, 2의 결정을 바탕으로 이들을 모두 포함합니다. 흙을 거주 미생물 종의 다양성 가운데 몇몇은 배양해 때문에 문화 종속적인 방법은 상당한 편견, biomarker 분석의 부재 제한을 소개합니다. 글루코사민, mannosamine, galactosamine 및 muramic 산성이 잘 토양 시스템 3의 가장 중요한 성분은 이러한 글루코사민 (가장 풍부)와 muramic 산성 (고유 세균 세포에서)으로 인해 생활과 죽은 미생물의 질량 모두 대책을 역임했습니다 4. 그러나 분석에 대한 지식의 부족은 과학적인 또래 간의 폭넓은 보급을 제한합니다. 모든 exi 중에서aldononitrile로 derivatization를 분석 방법을 아프게하는 것은 GC 기반의 분석을 다음 acetates 최적의 정밀도를 균형에 관하여 좋은 옵션으로 떠오르고, 감도, 단순, 샘플 보관 5시 좋은 색층 분리, 안정성. 여기서는 aldononitrile의 acetates에 대한 그들의 변환 후 토양에서 글루코사민과 muramic 산성의 안정적이고 비교적 간단한 분석을 위해 상세한 프로토콜을 소개합니다. 프로토콜은 주로 4 단계를 구성되어 산성 소화, 샘플 정제, derivati​​zation 및 GC 결정합니다. 단계별 절차는 옛 간행물 6, 7에 따라 수정됩니다. 또한 구조적으로 전자 이온화에 따라 형성 유도체와 그 이온 조각의 분자 이온의 유효성을 검사하기위한 전략을 제시한다. 우리는 aldononitrile 아세테이트 derivati​​zed 글루코사민과 mur의 분자량을 결정하기 위해 GC-EI-MS-SIM, LC-ESI-TOF-MS 및 isotopically 분류된 시약을 적용amic 산은, 우리는 각 파생 상품 8 이온 조각을 조사하기 위해 이온 스펙트럼에서 동위 원소 라벨이 표시된 파생 상품의 대량 교대를 사용했습니다. 이론적 해설과 더불어, 파생 및 이온 조각의 분자 이온의 유효성 검사 δ 13 C 또는 biogeochemical 연구 9, 10에서 이러한 생체 이온 조각을 사용하여 연구자에게 도움이 될 것입니다.

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GC-based Detection of Aldononitrile Acetate Derivatized Glucosamine and Muramic Acid for Microbial Residue Determination in Soil

우리는 글루코사민과 흙에서 추출한 muramic 산성의 aldonitrile 아세트산 유도체의 GC-기반의 분석을위한 메소드 프로토콜을 설명합니다. 화학적 메커니즘의 해설 들어, 우리는 또한 유도체와 전자 이온화 따라 형성된 이온 조각의 구조를 확인하기위한 전략을 제시한다.

토양에 미생물 잔류 결정을위한 Aldononitrile 아세트산 Derivati​​zed 글루코사민과 Muramic 산성의 GC 기반 탐지

Quantitative approaches to characterizing microorganisms are crucial for a broader understanding of the microbial status and function within ecosystems. ...

gc-based-detection-aldononitrile-acetate-derivatized-glucosamine

Research

JoVE Journal

Biology

16.8K 조회수.  University of Wisconsin, Madison. 우리는 글루코사민과 흙에서 추출한 muramic 산성의 aldonitrile 아세트산 유도체의 GC-기반의 분석을위한 메소드 프로토콜을 설명합니다. 화학적 메커니즘의 해설 들어, 우리는 또한 유도체와 전자 이온화 따라 형성된 이온 조각의 구조를 확인하기위한 전략을 제시한다.

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Methods for Facilitating Microbial Growth on Pulp Mill Waste Streams and Characterization of the Biodegradation Potential of Cultured Microbes

The kraft process is applied to wood chips for separation of lignin from the polysaccharides within lignocellulose for pulp that will produce a high quality paper. Black liquor is a pulping waste generated by the kraft process that has potential for downstream bioconversion. However, the recalcitrant nature of the lignocellulose resources, its chemical derivatives that constitute the majority of available organic carbon within black liquor, and its basic pH present challenges to microbial biodegradation of this waste material. Methods for the collection and modification of black liquor for microbial growth are aimed at utilization of this pulp waste to convert the lignin, organic acids, and polysaccharide degradation byproducts into valuable chemicals. The lignocellulose extraction techniques presented provide a reproducible method for preparation of lignocellulose growth substrates for understanding metabolic capacities of cultured microorganisms. Use of gas chromatography-mass spectrometry enables the identification and quantification of the fermentation products resulting from the growth of microorganisms on pulping waste. These methods when used together can facilitate the determination of the metabolic activity of microorganisms with potential to produce fermentation products that would provide greater value to the pulping system and reduce effluent waste, thereby increasing potential paper milling profits and offering additional uses for black liquor.

Industrial wastes can be collected and modified to analyze microbial growth. Lignocellulose extraction techniques provide components to analyze specific biodegradation ability. Gas chromatography-mass spectrometry identifies fermentation products of microorganisms grown on pulping waste. These methods determine the metabolic capacity of microorganisms to degrade pulping waste.

The kraft process is applied to wood chips for separation of lignin from the polysaccharides within lignocellulose for pulp that will produce a high ...

연구

환경과학

A Whole Cell Bioreporter Approach to Assess Transport and Bioavailability of Organic Contaminants in Water Unsaturated Systems

Bioavailability of contaminants is a prerequisite for their effective biodegradation in soil. The average bulk concentration of a contaminant, however, is not an appropriate measure for its availability; bioavailability rather depends on the dynamic interplay of potential mass transfer (flux) of a compound to a microbial cell and the capacity of the latter to degrade the compound. In water-unsaturated parts of the soil, mycelia have been shown to overcome bioavailability limitations by actively transporting and mobilizing organic compounds over the range of centimeters. Whereas the extent of mycelia-based transport can be quantified easily by chemical means, verification of the contaminant-bioavailability to bacterial cells requires a biological method. Addressing this constraint, we chose the PAH fluorene (FLU) as a model compound and developed a water unsaturated model microcosm linking a spatially separated FLU point source and the FLU degrading bioreporter bacterium Burkholderia sartisoli RP037-mChe by a mycelial network of Pythium ultimum. Since the bioreporter expresses eGFP in response of the PAH flux to the cell, bacterial FLU exposure and degradation could be monitored directly in the microcosms via confocal laser scanning microscopy (CLSM). CLSM and image analyses revealed a significant increase of the eGFP expression in the presence of P. ultimum compared to controls without mycelia or FLU thus indicating FLU bioavailability to bacteria after mycelia-mediated transport. CLSM results were supported by chemical analyses in identical microcosms. The developed microcosm proved suitable to investigate contaminant bioavailability and to concomitantly visualize the involved bacteria-mycelial interactions.

A whole cell bioreporter assay with Burkholderia sartisoli RP037-mChe was developed to detect fractions of an organic contaminant (i.e., fluorene) available for bacterial degradation after active transport by mycelia bridging air-filled pores in a water unsaturated model system.

전체 셀 Bioreporter 접근 물 불포화 시스템에서 유기 오염 물질의 운송과 생체 이용률을 평가하기 위해

Bioavailability of contaminants is a prerequisite for their effective biodegradation in soil. The average bulk concentration of a contaminant, however, is ...

Analysis of N-glycans from Raphanus sativus Cultivars Using PNGase H+

In recent years, the carbohydrate moieties of plants have received considerable attention, as they are a potential source of cross-reactive, allergy-provoking immune responses. In addition, carbohydrate structures also play a critical role in plant metabolism. Here, we present a simple and rapid method for preparing and analyzing N-glycans from different cultivars of radish (Raphanus sativus) using an N-glycanase specific for the release of plant-derived carbohydrate structures. To achieve this, crude trichloroacetic acid precipitates of radish homogenates were treated with PNGase H+, and labeled using 2-aminobenzamide as a fluorescent tag. The labeled N-glycan samples were subsequently analyzed by ultra performance liquid chromatography (UPLC) separation and matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight (MALDI-TOF) mass spectrometry for a detailed structural evaluation and to quantify relative abundancies of the radish-derived N-glycan structures. This protocol can also be used for the analysis of N-glycans from various other plant species, and may be useful for further investigation of the function and effects of N-glycans on human health.

Analysis of N-glycans from Raphanus sativus Cultivars Using PNGase H+

We describe a simple and rapid method for the preparation and analysis of N-glycans from different cultivars of radish (Raphanus sativus).

N-glycans Raphanus sativus Cultivars 사용 PNGase H+ 에서 분석

In recent years, the carbohydrate moieties of plants have received considerable attention, as they are a potential source of cross-reactive, ...

생화학

Enhanced Oil Recovery using a Combination of Biosurfactants

Biosurfactants are surface-active compounds capable of reducing the surface tension between two phases of different polarities. Biosurfactants have been emerging as promising alternatives to chemical surfactants due to less toxicity, high biodegradability, environmental compatibility and tolerance to extreme environmental conditions. Here, we illustrate the methods used for screening of microbes capable of producing biosurfactants. The biosurfactant producing microbes were identified using drop collapse, oil spreading, and emulsion index assays. Biosurfactant production was validated by determining the reduction in surface tension of the media due to growth of the microbial members. We also describe the methods involved in characterization and identification of biosurfactants. Thin layer chromatography of the extracted biosurfactant followed by differential staining of the plates was performed to determine the nature of the biosurfactant. LCMS, 1H NMR, and FT-IR were used to chemically identify the biosurfactant. We further illustrate the methods to evaluate the application of the combination of produced biosurfactants for enhancing residual oil recovery in a simulated sand pack column.

We illustrate the methods involved in screening and identification of the biosurfactant producing microbes. Methods for chromatographic characterization and chemical identification of the biosurfactants, determining the industrial applicability of the biosurfactant&#160;in enhancing residual oil recovery are also presented.

생체 계면활성제의 조합을 사용한 향상된 오일 회수

Biosurfactants are surface-active compounds capable of reducing the surface tension between two phases of different polarities. Biosurfactants have been ...

The Application of Open Searching-based Approaches for the Identification of Acinetobacter baumannii O-linked Glycopeptides

Protein glycosylation is increasingly recognized as a common modification within bacterial organisms, contributing to prokaryotic physiology and optimal infectivity of pathogenic species. Due to this, there is increasing interest in characterizing bacterial glycosylation and a need for high-throughput analytical tools to identify these events. Although bottom-up proteomics readily enables the generation of rich glycopeptide data, the breadth and diversity of glycans observed in prokaryotic species make the identification of bacterial glycosylation events extremely challenging.
Traditionally, the manual determination of glycan compositions within bacterial proteomic datasets made this a largely bespoke analysis restricted to field-specific experts. Recently, open searching-based approaches have emerged as a powerful alternative for the identification of unknown modifications. By analyzing the frequency of unique modifications observed on peptide sequences, open searching techniques allow the identification of common glycans attached to peptides within complex samples. This article presents a streamlined workflow for the interpretation and analysis of glycoproteomic data, demonstrating how open searching techniques can be used to identify bacterial glycopeptides without prior knowledge of the glycan compositions.
Using this approach, glycopeptides within samples can rapidly be identified to understand glycosylation differences. Using Acinetobacter baumannii as a model, these approaches enable the comparison of glycan compositions between strains and the identification of novel glycoproteins. Taken together, this work demonstrates the versatility of open database-searching techniques for the identification of bacterial glycosylation, making the characterization of these highly diverse glycoproteomes easier than ever before.

The Application of Open Searching-based Approaches for the Identification of Acinetobacter baumannii O-linked Glycopeptides

Open searching enables the identification of glycopeptides decorated with previously unknown glycan compositions. Within this article, a streamlined approach for undertaking open searching and subsequent glycan-focused glycopeptide searches are presented for bacterial samples using Acinetobacter baumannii as a model.

Acinetobacter baumannii O 결합 글리코 펩타이드의 확인을위한 개방형 검색 기반 접근법의 적용

Protein glycosylation is increasingly recognized as a common modification within bacterial organisms, contributing to prokaryotic physiology and optimal ...

Extraction of Non-Protein Amino Acids from Cyanobacteria for Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Analysis

Non-protein amino acids (NPAAs) are a large class of amino acids (AAs) that are not genetically encoded for translation into proteins. The analysis of NPAAs can provide crucial information about cellular uptake and/or function, metabolic pathways, and potential toxicity. &#946;-methylamino-L-alanine (BMAA) is a neurotoxic NPAA produced by various algae species and is associated with an increased risk for neurodegenerative diseases, which has led to significant research interest. There are numerous ways to extract AAs for analysis, with liquid chromatography-tandem mass spectrometry being the most common, requiring protein precipitation followed by acid hydrolysis of the protein pellet. Studies on the presence of BMAA in algal species provide contradictory results, with the use of unvalidated sample preparation/extraction and analysis a primary cause. Like most NPAAs, protein precipitation in 10% aqueous TCA and hydrolysis with fuming HCl is the most appropriate form of extraction for BMAA and its isomers aminoethylglycine (AEG) and 2,4-diaminobutyric acid (2,4-DAB). The present protocol describes the steps in a validated NPAA extraction method commonly used in research and teaching laboratories.

The present protocol describes the extraction of non-protein amino acids from biological matrices via trichloroacetic acid (TCA) protein precipitation and acid hydrolysis before analysis using liquid chromatography-tandem mass spectrometry.

액체 크로마토그래피-탠덤 질량분석 분석을 위한 시아노박테리아에서 비단백질 아미노산 추출

Non-protein amino acids (NPAAs) are a large class of amino acids (AAs) that are not genetically encoded for translation into proteins. The analysis of ...

화학

Headspace GC-MS를 이용한 동물 유래 의약품의 트리메틸아민 검출

An Improved Technique for Trimethylamine Detection in Animal-Derived Medicine by Headspace Gas Chromatography-Tandem Quadrupole Mass Spectrometry

Animal-derived medicines have distinctive characteristics and significant curative effects, but most of them have an obvious fishy odor, resulting in the poor compliance of clinical patients. Trimethylamine (TMA) is one of the key fishy odor components in animal-derived medicine. It is difficult to identify TMA accurately using the existing detection method due to the increased pressure in the headspace vial caused by the rapid acid-base reaction after the addition of lye, which causes TMA to escape from the headspace vial, stalling the research progress of the fishy odor of animal-derived medicine. In this study, we proposed a controlled detection method that introduced a paraffin layer as an isolation layer between acid and lye. The rate of TMA production could be effectively controlled by slowly liquefying the paraffin layer through thermostatic furnace heating. This method showed satisfactory linearity, precision experiments, and recoveries with good reproducibility and high sensitivity. It provided technical support for the deodorization of animal-derived medicine.

저자 스포트라이트: 헤드스페이스 가스 크로마토그래피-탠덤 사중극자 질량 분석법을 이용한 동물 유래 의학에서 트리메틸아민 검출을 위한 개선된 기법  

Here, a headspace gas chromatography-tandem quadrupole mass spectrometry (HS-GC-MS/MS) method suitable for the determination of trimethylamine (TMA) in animal-derived medicines is described. The protocol includes sample pretreatment, headspace treatment, analysis conditions, methodological validation, and the determination of TMA in animal-derived medicines.

헤드스페이스 가스 크로마토그래피-탠덤 사중극자 질량분석법에 의한 동물 유래 의학의 트리메틸아민 검출을 위한 개선된 기술

Animal-derived medicines have distinctive characteristics and significant curative effects, but most of them have an obvious fishy odor, resulting in the ...

Workflow Based on the Combination of Isotopic Tracer Experiments to Investigate Microbial Metabolism of Multiple Nutrient Sources

Studies in the field of microbiology rely on the implementation of a wide range of methodologies. In particular, the development of appropriate methods substantially contributes to providing extensive knowledge of the metabolism of microorganisms growing in chemically defined media containing unique nitrogen and carbon sources. In contrast, the management through metabolism of multiple nutrient sources, despite their broad presence in natural or industrial environments, remains virtually unexplored. This situation is mainly due to the lack of suitable methodologies, which hinders investigations.
We report an experimental strategy to quantitatively and comprehensively explore how metabolism operates when a nutrient is provided as a mixture of different molecules, i.e., a complex resource. Here, we describe its application for assessing the partitioning of multiple nitrogen sources through the yeast metabolic network. The workflow combines information obtained during stable isotope tracer experiments using selected 13C- or 15N-labeled substrates. It first consists of parallel and reproducible fermentations in the same medium, which includes a mixture of N-containing molecules; however,a selected nitrogen source is labeled each time. A combination of analytical procedures (HPLC, GC-MS) is implemented to assess the labeling patterns of targeted compounds and to quantify the consumption and recovery of substrates in other metabolites. An integrated analysis of the complete dataset provides an overview of the fate of consumed substrates within cells. This approach requires an accurate protocol for the collection of samples&#8211;facilitated by a robot-assisted system for online monitoring of fermentations&#8211;and the achievement of numerous time-consuming analyses. Despite these constraints, it allowed understanding, for the first time, the partitioning of multiple nitrogen sources throughout the yeast metabolic network. We elucidated the redistribution of nitrogen from more abundant sources toward other N-compounds and determined the metabolic origins of volatile molecules and proteinogenic amino acids.

This protocol describes an experimental procedure to quantitatively and comprehensively investigate the metabolism of multiple nutrient sources. This workflow, based on a combination of isotopic tracer experiments and an analytical procedure, allows the fate of consumed nutrients and the metabolic origin of molecules synthetized by microorganisms to be determined.

여러 영양소 소스의 미생물 대사를 조사 하기 위해 동위 원소 추적 실험의 조합에 따라 워크플로

Studies in the field of microbiology rely on the implementation of a wide range of methodologies. In particular, the development of appropriate methods ...

토양에 미생물 잔류 결정을위한 Aldononitrile 아세트산 Derivatized 글루코사민과 Muramic 산성의 GC 기반 탐지

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토양에 미생물 잔류 결정을위한 Aldononitrile 아세트산 Derivati​​zed 글루코사민과 Muramic 산성의 GC 기반 탐지

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