지원 Becton 디킨슨 기술에 의해 제공되었다. 이 제출로 표현 전망 저자 분들이며 미국 정부의 공식 정책을 반영하는 취지하지 않습니다. 연구는 동물 복지 법령 및 동물 실험 동물의 관리 및 사용, 국립 연구 협의회, 1996을위한 가이드에 명시된 원칙을 준수를 포함한 동물 실험에 관련된 다른 연방 법령과 규정을 준수 실시되었다. 본 연구가 실시되었다 시설은 실험실 동물 케어 인터내셔널의 평가와 인증을위한 협회 완전히 인정하고 있습니다.

1. NALT 수집 및 Culturing <ol><li> 승인 IACUC지도를 사용하여 쥐를 안락사시켜야. NALT에 영향을 미칠 수있는 흡입 anesthetics의 사용을 피하십시오. 무균 작업 공간이나 biosafety 캐비닛에 마우스를 전송합니다. 마우스 아래턱를 제거하고 알코올 및 요오드 잎사귀와 위쪽 미각 영역을 청소하십시오. </li><li> 신중하게 마우스 incisors와 어금니 치아의 내부 등고선을 따라 상류 미각을 잘라내어 소비세하는 수술 칼 손잡이로 11 호 외과 칼날을 사용합니다. </li><li> 미각을 찢어하지 않도록 신중하다고 포셉로 부드럽게 돌려 껍질 구개. </li><li> 이 단계는 문화의 오염을 줄이기 위해 필요한 여러 입맛을 처리하도록 설계되었습니다. 장소 입맛 멸균 48 잘 플레이트 완전한 배지 250 μL으로 미리 채워져의 첫 번째 열에있는 각각의 우물로 (37 ° C) 10 % 태아 소 혈청, 100 μg / ML 스트렙토 마이신, 100와 함께 보충 RPMI 1640으로 구성된 UI / ML 페니실린, 50 μg / ML gentamicin1 μg / ML fungizone / amphotericin. 미디어 입맛이 5 % CO 2 / 95% 습한 공기 배양기 (37 ℃), 또는 양자 택일이 아닌 CO 2 문화 10 밀리미터 HEPES의 산도 7.4을 사용으로 배양해 경우 버퍼 탄산 있어야합니다. </li><li> 입맛을 씻으려면 구개 여덟 세차장 총 중이며 때까지 신중하게, 세차장 사이에 접시를 태핑, 행에있는 각 연속 잘으로 입맛을 이동 집게를 사용합니다. </li><li> 우물의 신선 전체 문화 매체 (37 ° C) 250 μL를 포함하는 새로운 멸균 48 잘 판으로 입맛을 전송합니다. </li><li> 연구 기간 동안 culturing에 대해 37 ° C 배양기에 입맛이 들어있는 접시를 놓습니다. </li><li> 무균 신선한 37 ° C 배지 100 μL로 교체, Eppendorf 튜브 24 시간마다로 문화 우물에서 매체의 100 μL를 전송하여 분석을 위해 샘플을 수집합니다. </li><li> 펠렛의 파편까지 10 분, 4 ° C를 위해 380 XG에 문화 미디어 샘플을 원심 분리기. </li><li> 분석 준비 때까지 -20 ° C에서 신선한 Eppendorf 튜브 및 저장소에 centrifuged 샘플에서 뜨는을 전송합니다. </li><li> 항원 특정 IgG, IgM, 그리고 이가, 또는 분비 크린 시토킨은 표준 효소 결합 면역 assays (엘리사)에 의해 조직 문화의 supernatants로 측정됩니다. </li></ol> 2. NALT의 외과 절제 <ol><li> 여자 BALB / C 마우스, 연령 7-9주은 적합한 과목이지만 다른 변종도 허용합니다. 수술 후 실시됩니다 음식과 물을 대체할 마우스를 적응 사흘 전에 수술로 겔형 서부 유럽 표준시 음식을 제공한다. </li><li> 수술 이전 구강에 Metacam 통증 구호 약품 (1.5 밀리그램 / ML 또는 0.05 밀리그램 / 드롭) 중 하나에 드롭을 관리할 수 있습니다. </li><li> 케타민을, acepromazine 및 xylazine 혼합물 (KAX)로 예를 들면, 승인 IACUC지도를 이용하여 생쥐를 마취하고 건조 방지하기 위해 눈 위에 Puralube 투어뇌려의 연고를 적용합니다. NALT에 영향을 미칠 수있는 흡입 anesthetics의 사용을 피하십시오.nesthesia은 발가락의 부드러운 곤란에 대한 반사 반응의 부재에 의해 확인할 수 있습니다. </li><li> subcutaneously 수술 후 마우스의 잠재적인 탈수증을 방지하기 위해 22-28 게이지 바늘과 주사기를 사용하여 양어깨 사이로 한 ML 식염수 (0.9 %의 나트륨 염화물 분사 USP)을 관리할 수 있습니다. 또한 수술 도중과 이후 건강한 호흡을 촉진 22-28 게이지 바늘과 주사기를 사용하여 양어깨 사이 subcutaneously Respiram의 0.1 ML을 관리할 수 있습니다. </li><li> 이후의 모든 조작 중에 마우스로 열 지원을 제공합니다. </li><li> 위로 향한 자세로 anesthetized 마우스를 놓고, 가볍게 상부 구개를 노출, 구강을 억지로 위턱과 아래턱 incisors 주위에 수술 봉합의 두개의 루프를 사용합니다. </li><li> NALT의 사이트에있는 상부 구개의 중간선 아래 길이의 절개를 약 3mm를 만들기 위해 11 호 외과 칼날을 사용합니다. </li><li> 절개로 0.5 밀리미터 microcurette를 넣고 부드럽게으로 가장자리 아래 다쳤어요NALT를 중단. </li><li> 열 소작 장치의 직선 벌금 루프와 함께 출혈을 멈추게하기 위해 절개를 부식. </li><li> 마우스가 완전한 의식과 활동을 복구하는 동안 열 지원을 계속합니다. </li><li> 삼일 포스트 수술을 하루에 한 번 필요하고 경구 진통제로 탈수를 방지하기 위해 염분 subcutaneously 최대 하루에 세 번, 양어깨 사이에 주입 당 1 ML와 마우스를 제공합니다. 피부 turgor를 확인하기 위해 피부 텐트 테스트를 수행하여 탈수를 결정합니다. 그것까지 덮고되도록 어깨 블레이드 사이의 피부와 모피를 파악. 피부가 빠르게 정상, 이전 위치로 반환하는 경우 마우스가 건조하지 않습니다. 피부가 상승된 남아 천천히 움직이면 마우스는 탈수 상태에 있으며 염분이 필요합니다. 회복을위한 충분한 시간을 허용하도록 수술 후 최소한 사흘 동안 서부 유럽 표준시 음식을 제공한다. </li><li> 모든 실험 절차에 앞서, 체중 증가를 추적하여 8~10일에 대한 쥐를 관찰합니다. 불쌍한 체중 회복보통 불완전한 구개의 치유를 나타내는,이 생쥐는 더 연구에서 철회되어야한다. </li></ol> 3. 조직학을 위해 NALT 준비하고 NALT 수술의 성공 여부를 평가 <ol><li> 아래에 설명된대로 NALT 수술의 성공은 조직학에 의해 ascertained이어야합니다. 모든 실험 연구를 완료하면 승인 IACUC지도를 사용 euthanizing하여 두개골 컬렉션을 위해 생쥐를 준비합니다. NALT에 영향을 미칠 수있는 흡입 anesthetics의 사용을 피하십시오. </li><li> euthanized 마우스 목 목덜미를 파악. 양쪽 가위로 condylar 프로세스를 통해 snipping 의해 두개골의 나머지 부분에서 낮은 아랫 턱이를 제거합니다. </li><li> 목 목덜미에서부터 천천히 필링과 두개의 복부 측면으로 절단하여 두개골로부터 피부와 모피를 제거합니다. </li><li> 조심스럽게 비강 주변 피부를 제거하고 완전히 제거하는 주둥이 끝의 오프 피부를 자르지. </li><li> 척추 지혜에서 두개를 분리가위 헥타르를 싹둑. </li><li> 구멍의 매그넘으로 가위를 삽입하고 고정하는 동안 부드러운 조직으로 포르말린의 침투를 허용하는 중간선에 따라 두개골 아래로 반을 잘라. </li><li> 중립 10 % 두개를 고정하는 것은 상온에서 24 시간 동안 (NBF) 포르말린 버퍼. </li><li> decalcify하려면 개미의 산성 혼합물과 병에 뼈를 만져서 Rexyn을 막기 위해 거즈에 싸서 샘플 및 별도의 카세트를 넣습니다. 상온에서 12 시간 동안 부화 후 약 20 분 동안 수돗물하에 지속 린스. </li><li> 면도날과 심장 그리고 과거 눈 궤도에 샘플을 트림. </li><li> 샘플 및 카세트는 10 % NBF에 단기간 동안 저장할 수 있습니다. </li><li> 하룻밤 처리를위한 조직 프로세서에 샘플을 놓습니다. 이것은 파라핀의 삽입을위한 준비 표본에서 물을 제거하기위한 것입니다. </li><li> 아래로 주둥이를 가진 파라핀 블록에 포함할 처리 조직을 제거하고 냉각 수 있습니다. </li><li> r을 손질NALT의 대략적인 위치를 접근하는 자동 마이크로톰있는 블록의 ough 15 μm의 크로스 - 섹션 다음, 44.3 ° C 물 목욕에 유리 슬라이드에 장착에 5 μm의 섹션에 절단 계속합니다. </li><li> Hematoxylin과 eosin (H &amp; E) 조직학의 염색법은 NALT 절제를 평가하는 데 사용해야합니다. </li></ol> 4. 마우스에서 생물 학적 샘플의 수집 4.1 세럼 <ol><li> 조심스럽게 가열 램프와 함께 체온을 앞질렀어 것은 혈액 흐름을 증가합니다. 수술용 칼날과 측면 꼬리 정맥을 nicking하여 혈액을 수집합니다. 혈액 Microtainer 혈청 분리관로 자유롭게 드립하도록 허용합니다. </li><li> 혈액의 흐름을 중지하는 등 거즈 또는 수건 등의 흡착제로 닉에 부드러운 압력을 적용합니다. </li><li> 30 분 Microtainers의 응고에 혈액을 허용 후 최소 90 초 동안 6-15 X 1,000그램 사이에 원심 분리기. </li><li> 위해 깨끗한 Eppendorf 튜브에 Microtainer에서 혈청 분리 전송보관 -80시 ° C. </li></ol> 4.2 타액 <ol><li> 20-30 μL 멸균 인산을 pipetting하면 뺨에와 잇몸 라인 사이에 식염수 (PBS)를 버퍼링하는 동안 수직 anesthetized 마우스를 잡아. 뺨에와 잇몸 라인 사이에 피펫 팁을 지시에 의해 희석 타액을 수집합니다. </li><li> -20 ° C.에 2X 테아제 억제제 및 매장의 10 μL를 포함하는 새로운 튜브로 희석 타액을 전송 </li></ol> 4.3 네이절 분비물 <ol><li> 승인된 IACUC지도를 이용하여 비강 분비물을 수집하기 전에 마우스를 안락사. NALT에 영향을 미칠 수있는 흡입 anesthetics의 사용을 피하십시오. </li><li> 마우스를 개최하는 것은 수직으로 조심스럽게 한 콧구멍에 무균 PBS의 30 μL를 피펫 및 기타 콧구멍에서 린스 수집합니다. </li><li> -20 ° C.에 2X 테아제 억제제 및 매장의 10 μL를 포함하는 새로운 튜브로 헹굼 전송 </li></ol> 4.4 질 분비물 <ol><li> 회의 개통으로 micropipette의 팁을 삽입euthanized 마우스의 전자 외음부는 멸균 PBS의 50 μL와 음부를 씻어 micropipette하여 모든 유체를 수집합니다. </li><li> -20 ° C.에 2X 테아제 억제제 및 매장의 10 μL를 포함하는 새로운 튜브로 헹굼 전송 </li></ol> 5. 수집된 샘플의 항원에 특정한 항체 또는 크린 시토킨은 엘리사 또는 다른 정량 방법에 의해 측정할 수있다. 6. 대표 결과 그림 1은 전직 생체내 분석을위한 NALT 함유 조직을 처리 관여 단계의 일반적인 설계도를 제공합니다. 그림 2 (A, B)에서 구개의 크기가 아니라 점선으로 표시, 절제 수술시 절개의 위치 (A)뿐만 아니라, 표시됩니다. NALT의 위치는 병렬 조직을 보여주는 그림 2에서 excised hematoxylin-스테인드 구개 (C)에 소구 치의 영역에서 화살표로 표시됩니다. 그림 3상단 NALT에 액세스 구개 (A, B), 절제 (C)와 절개 (D)의 최종 소작의 노출을 보여주 NALT 중단 수술의 단계를 제공합니다. 직접 수술 후 microcurette 의한 NALT 혼란의 이미지가 그림 3 층에 나타나는 동안 수술 전에 NALT를 둘러싼 비강 부비동 지역의 전형적인 H &amp; E 단면은 그림 3E에 표시됩니다. 수술에서 회복을위한 충분한 시간을 허용, incisions은 폐쇄되어야하고 NALT (그림 3G)의 비강 찾아볼 수없는. 이러한 기술을 사용하여 얻은 전형적인 실험 결과는 포도상 구균 subunit 백신 (STEBVax)의 연구에서 조직 문화 supernatants 및 생물 학적 샘플을 비교, 그림 4에 표시됩니다. 마우스는 비강 (IN) 또는 intraperitoneal (IP) 경로로 인해 STEBVax을 투여했다. 예방 접종은 수신자와 같은 수용체 4 통로 3,1를 활성화 도움이되는과 함께 공식화되었다<html> 4, 그리고 컨트롤은 염분이나 백신이 도움이되는없이 받았습니다. 실험 집단에서 얻은 교양 NALT는 엘리사에 의해 측정했습니다 중간에 항원에 특정한 면역 글로불린을 분비. 이 예제에서 (그림 4A), 결과는 이가의 가장 큰 금액이 도움이되는 결합 subunit 백신으로 예방 접종을 생쥐에서 얻은 NALT에 의해 발표된 것으로 나타났습니다. 컨트롤이나 NALT없는 생쥐에서 획득한 생물 학적 시료 (예 : 혈청, 타액, 비강 분비물, 질 분비물 등) 조직 배양 결과와 비교를위한 비강 항원에 대한 생체내 면역 반응 프로필에 사용할 수 있습니다. 예방 접종의에 대한 그림 4B에서 이가와 IgG는 응답이 크게 기능성 NALT없이 감소했다. 항원에 특정한 이가의 수준은 예방 접종을 생쥐의 점막 분비물의 IgG (타액, 비강의 세차장)보다 일반적으로 더 있었다. upload/3960/3960fig1.jpg &quot;/&gt; 그림 1. NALT 수집 및 전직 생체내의 culturing의 도식. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3960/3960fig2.jpg" /> 그림 2. NALT 및 수술 절개의 위치를 나타내는 마우스 구개의 시각화. 크기와 점선 ()으로 표시 수술 절개와 상부 구개의 위치, 상부 구개가 excised (B) 또는 구개의 소구치 영역 (구개의 앞부분 측면에 얼룩진 어두운 자주색으로 병렬 NALT를 볼 수 hematoxylin (C)에 묻다 ). NALT는 화살표로 표시. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3960/3960fig3.jpg" /> 그림 3. 외과 NALT 장애. NALT 중단 수술의 주요 단계 : 수술 전에 마우스 상부 구개의 나태한보기 (); NALT (B)를 액세스하는 상위 입맛에 만들어진 중간선 절개;에 NALT 구조를 방해하는 중간선 절개를 통해 삽입 microcurette 프로브tegrity (C), 수술 (D)의 끝 부분 절개의 소작. 수술 (E) 전에 비강 충치, H &amp; E 스테인드의 미세한 이미지, 즉시 수술 (F) 이후, 그리고 성공적으로 치유, NALT없는 마우스 (G). <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3960/3960fig4.jpg" /> 그림 4. 교양 NALT, 타액, 그리고 예방 접종을 생쥐에서 수집한 비강 분비물에서 백신에 특정한 항체. NALT - 무료 또는 정상적인 제어 생쥐에 또는 STEBVax과 IP를 접종하고, 생물 학적 샘플이 수집되었다. 세중의 샘플 항체 수준은 엘리사를 사용하여 측정되었다. () NALT는 컨트롤 마우스 (수술 조작되지 않음)에서 제거하고 항체 반응을 검사하는 배양해되었다. 예방 접종을 생쥐에서에 대한 문화의 백신 전용 이가 응답 (학생의 T-테스트, P ≤ 0.01, 아니 도움이되는 없거나 전혀없는 백신에 비해) 컨트롤에서 통계적으로 달랐어요. (B) NALT 장애는 크게 특정 항체 반응을 감소예방 접종 IN합니다. 특정 항체 수준 간의 큰 차이가있었습니다 NALT 및 NALT 타액 IgG 결과 (학생의 T-테스트, P ≤ 0.05)를 제외한 모든 비교 + 그룹 (아무 수술이나 컨트롤 수술).

<ol>
	<li>Wiley, J. A., Tighe, M. P., Harmsen, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upper+respiratory+tract+resistance+to+influenza+infection+is+not+prevented+by+the+absence+of+either+nasal-associated+lymphoid+tissue+or+cervical+lymph+nodes.">Upper respiratory tract resistance to influenza infection is not prevented by the absence of either nasal-associated lymphoid tissue or cervical lymph nodes.</a> J. Immunol. 175, 3186-3196 (2005).</li><li>W, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intranasal+immunisation+with+conjugate+vaccine+protects+mice+from+systemic+and+respiratory+tract+infection+with+Pseudomonas+aeruginosa.">Intranasal immunisation with conjugate vaccine protects mice from systemic and respiratory tract infection with Pseudomonas aeruginosa.</a> Vaccine. 24, 4333-4342 (2006).</li><li>Fernandez, S., Cisney, E. D., Hall, S. I., Ulrich, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal+immunity+to+staphylococcal+toxic+shock+is+controlled+by+the+nasopharynx-associated+lymphoid+tissue.">Nasal immunity to staphylococcal toxic shock is controlled by the nasopharynx-associated lymphoid tissue.</a> Clin. Vaccine Immunol. 18, 667-675 (2011).</li><li>Asanuma, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+mouse+nasal-associated+lymphoid+tissue.">Isolation and characterization of mouse nasal-associated lymphoid tissue.</a> J. Immunol. Methods. 202, 123-131 (1997).</li><li>Casteleyn, C., Broos, A. M., Simoens, P., Van den Broeck, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NALT+(nasal+cavity-associated+lymphoid+tissue)+in+the+rabbit.">NALT (nasal cavity-associated lymphoid tissue) in the rabbit.</a> Vet. Immunol. Immunopathol. 133, 212-218 (2010).</li><li>Debertin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal-associated+lymphoid+tissue+(NALT):+frequency+and+localization+in+young+children.">Nasal-associated lymphoid tissue (NALT): frequency and localization in young children.</a> Clin. Exp. Immunol. 134, 503-507 (2003).</li><li>Csencsits, K. L., Jutila, M. A., Pascual, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal-associated+lymphoid+tissue:+phenotypic+and+functional+evidence+for+the+primary+role+of+peripheral+node+addressin+in+naïve+lymphocyte+adhesion+to+high+endothelial+venules+in+a+mucosal+site.">Nasal-associated lymphoid tissue: phenotypic and functional evidence for the primary role of peripheral node addressin in naïve lymphocyte adhesion to high endothelial venules in a mucosal site.</a> J. Immunol. 163, 1382-1389 (1999).</li><li>Zuercher, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal-associated+lymphoid+tissue+is+a+mucosal+inductive+site+for+virus-specific+humoral+and+cellular+immune+responses.">Nasal-associated lymphoid tissue is a mucosal inductive site for virus-specific humoral and cellular immune responses.</a> J. Immunol. 168, 1796-1803 (2002).</li><li>Park, H. S., Francis, K. P., Yu, J., Cleary, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membranous+cells+in+nasal-associated+lymphoid+tissue:+a+portal+of+entry+for+the+respiratory+mucosal+pathogen+group+A+streptococcus.">Membranous cells in nasal-associated lymphoid tissue: a portal of entry for the respiratory mucosal pathogen group A streptococcus.</a> J. Immunol. 171, 2532-2537 (2003).</li><li>Tyrer, P., Foxwell, A. R., Cripps, A. W., Apicella, M. A., Kyd, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+pattern+recognition+receptors+mediate+M-cell+uptake+of+a+gram-negative+bacterium.">Microbial pattern recognition receptors mediate M-cell uptake of a gram-negative bacterium.</a> Infect. Immun. 74, 625-631 (2006).</li><li>Wu, A. W., Russell, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal+lymphoid+tissue,+intranasal+immunization,+and+compartmentalization+of+the+common+mucosal+immune+system.">Nasal lymphoid tissue, intranasal immunization, and compartmentalization of the common mucosal immune system.</a> Immunol. Res. 16, 187-201 (1997).</li><li>Harmsen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+organogenesis+of+nasal-associated+lymphoid+tissue+(NALT)+occurs+independently+of+lymphotoxin-alpha+(LT+alpha)+and+retinoic+acid+receptor-related+orphan+receptor-gamma,+but+the+organization+of+NALT+is+LT+alpha+dependent.">Cutting edge: organogenesis of nasal-associated lymphoid tissue (NALT) occurs independently of lymphotoxin-alpha (LT alpha) and retinoic acid receptor-related orphan receptor-gamma, but the organization of NALT is LT alpha dependent.</a> J. Immunol. 168, 986-990 (2002).</li><li>Rangel-Moreno, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+CXC+chemokine+ligand+13,+CC+chemokine+ligand+(CCL)+19,+and+CCL21+in+the+organization+and+function+of+nasal-associated+lymphoid+tissue.">Role of CXC chemokine ligand 13, CC chemokine ligand (CCL) 19, and CCL21 in the organization and function of nasal-associated lymphoid tissue.</a> J. Immunol. 175, 4904-4913 (2005).</li><li>Morefield, G. L., Hawkins, L. D., Ishizaka, S. T., Kissner, T. L., Ulrich, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+Toll-like+receptor+4+agonist+enhances+vaccine+efficacy+in+an+experimental+model+of+toxic+shock+syndrome.">Synthetic Toll-like receptor 4 agonist enhances vaccine efficacy in an experimental model of toxic shock syndrome.</a> Clin. Vaccine Immunol. 14, 1499-1504 (2007).</li></ol>

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

우리는 생물 학적 샘플 및 NALT - 관련 면역 반응에게 1-4 조사를위한 assays를 얻어, 동물 모델을 개발하기 위해 집단적 방법을 제시했습니다. 이러한 방법의 성능 기간 동안 고려해야 할 추가적인 요인이 있습니다. 수술 및 조직 배양을위한 표준 무균 기법을 따라야한다. 격리와 문화뿐만 아니라 소독기구, 작업 공간, 그리고 감염되지 않았소 입맛을 유지하는 동안 사용되는 항균 및 antifungal 대리인의 조합은 오염의 위험을 훨씬 줄일 수 있습니다. 혈청 항체는 일반적으로 높은 농도에서 발견되는대로 타액, 비강 세차장 및 유사한 점막 분비 샘플은 피로 잠재적인 오염 물질에 대한 검사를해야합니다. 항체의 낮은 농도는 혈청에 비해 이러한 샘플에 존재하기 때문에 또한, 점막 분비물은 약간 분석을 위해 희석되어야한다. 마우스는 사전에 직접 수술 후에 따뜻한 보관해야합니다잠재적인 마취 유도된 저체온증을 빼낼. 그들의 측면에서 대체 휴식 마우스는 수술 후 회복 기간 동안 불규칙한 호흡을 최소화합니다. 수술은 이러한 작업을 완료하기 위해 함께 일하는 세 개인가 더 효율적이다 : 쥐가 마취에서 회복으로 수술을 수행하는 하나 입을 열어 쥐고을 지원 하나, 그리고 하나는 사후 수술 치료를 제공합니다. 그것은 각각의 마우스에 대한 수술의 성공 여부를 확인하기위한 모든 실험 과정이나 연구 끝에 두개골 크로스 섹션의 H ​​&amp; E 염색법을 사용해야합니다. 가능한 수술 결과는 다음과 같습니다 완전하고 양국 NALT 절제, 불완전 절제하거나 손상되지 NALT. 모든 수술이 잔류하거나 그대로 NALT 갖춘 NALT 손실, 동물 얻을 수 있기 때문에이 내부 통제로 사용될 수 있습니다. 또 다른 잠재적인 결과는 구개는 비강 및 구강 충치를 연결 개통을 떠나, 완전히 치유하는 데 실패한다는 것입니다. 불완전한구개의 치유는 낮은 무게와 번성하는 고장의 원인이되며, 이러한 개인들은 연구에서 제외되어야한다. 마우스 모델 첫번째 백신 반응을 검사하는 것은 의도된 학습 결과 (항체 반응, 생존 등)에 NALT위한 역할을 확립하기 위해이 될 것입니다. 수술 NALT를 제거하면 로컬 및 전신 면역로 비강 기부의 결정을 용이하게합니다. 여기에 설명된 수술 접근법 NALT을 찾아볼 수없는이 마우스 모델을 얻기위한 가장 직접적인 방법입니다. 노크 아웃 선택 마우스 모델은 부족 NALT에게보고하지만,이 동물은 또한 크린 시토킨 또는 기타 보조 림프 조직의 발전에 필수적인 chemokines에 결함이며, 추가적인 결함에게 12,13을 품다 수있다. 또한, 여기에 설명된 방법은 비강 내에 발생하는 면역 반응의 여러 측면을 검토하기 위해 개발되었다. 우리의 실험 결과는 전체 상위 palat을 사용하여 연구를 기반으로조직 배양을위한 마우스에서 전자, 그것이 섹션 사용할 수있다는 것을 가능하지만. 마지막으로, 교양 NALT 모델은 조직 문화에 완전히 실험을 수행하는 데 유용합니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 스테인레스 무균 외과 블레이드, 11 호 </td><td> Miltex </td><td> 4-311 </td><td></td></tr><tr><td> 칼 손잡이, 제 3 호 </td><td> Miltex </td><td> 4-7 </td><td></td></tr><tr><td> 48도 세포 배양 플레이트 </td><td> Costar </td><td> 3548 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 11875-093 </td><td></td></tr><tr><td> 태아 소 혈청, Inactivated 히트 </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 16000-044 </td><td> 최종 Conc : 문화 매체 볼륨에 의해 10% </td></tr><tr><td> 스트렙토 마이신 황산 </td><td> 시그마 </td><td> S9137 </td><td> 최종 Conc : 100 μg / ML </td></tr><tr><td> 페니실린 </td><td> 시그마 </td><td> P7794 </td><td> 최종 Conc : 100 UI / ML </td></tr><tr><td> Gentamicin </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> G1397-10ML </td><td> 최종 Conc : 50 μg / ML </td></tr><tr><td> Fungizone </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 15290-018 </td><td> 최종 Conc : 1 μg / ML </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> H0887 </td><td> 최종 Conc : 10 MM </td></tr><tr><td> Eppendorf의 Microcentrifuge 튜브 </td><td> Eppendorf </td><td> 022,364,111 </td><td></td></tr><tr><td> Nutra-겔 체리 맛 마우스 습식 식품 </td><td> 바이오 서빙 </td><td> S4798-트레이 </td><td></td></tr><tr><td> Metacam </td><td> Boehringer Ingelheim </td><td> 601,531,000 </td><td> 1.5 MG / ML 사정 서스펜션 한방울 </td></tr><tr><td> 케타민을 </td><td> 화이자 </td><td> 00856440301 </td><td> 최종 공동NC : 6.06 밀리그램 / ML </td></tr><tr><td> Acepromazine </td><td> Vedco </td><td> VEDC207 </td><td> 최종 Conc : 0.061 밀리그램 / ML </td></tr><tr><td> Xylazine </td><td> 로이드 </td><td> 4811 </td><td> 최종 Conc : 0.667 밀리그램 / ML </td></tr><tr><td> Puralube의 투어뇌려의 연고 </td><td> Pharmaderm 동물 건강 </td><td> 1621 </td><td></td></tr><tr><td> 0.9 %의 나트륨 염화물 사출 USP </td><td> 벡스터 </td><td> 2B1302 </td><td></td></tr><tr><td> 0.5 mm Microcurette </td><td> Roboz </td><td> RS-6350 </td><td></td></tr><tr><td> 열 소작 단위 </td><td> 가이 </td><td> 150-S/150A-S </td><td></td></tr><tr><td> 통신실 교체 팁, 스트레이트 파인 루프 </td><td> 가이 </td><td> 214 </td><td></td></tr><tr><td> 외과 가위 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 중립 10 % 포르말린 버퍼 </td><td> 시그마 </td><td> HT501128 </td><td></td></tr><tr><td> 개미의 산성 </td><td> 어부 </td><td> A119P-4 </td><td> 1,047 ML의 수돗물로 426 ML 개미의 산성을 혼합 후 45 ML Rexyn 101 (H)을 추가 </td></tr><tr><td> Rexyn 101 (H) </td><td> 어부 </td><td> R231-500 </td><td></td></tr><tr><td> 조직 - 테크 VIP E150/E300 </td><td> 사쿠라 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 로타리 마이크로톰 </td><td> Leica </td><td> RM2255 </td><td></td></tr><tr><td> 메이어의 Hematoxylin </td><td> 시그마 </td><td> MHS16-500ML </td><td></td></tr><tr><td> 길 위 Hematoxylin </td><td> 시그마 </td><td> GHS116 </td><td></td></tr><tr><td> Eosin B </td><td> 시그마 </td><td> 2853 </td><td></td></tr><tr><td> Microtainer 세럼 구분 기호 </td><td> BD Medical </td><td> 365,956 </td><td></td></tr><tr><td> 인산염은 염분 버퍼 </td><td></td><td></td><td> 100 MM 아뇨 2 PO 4, 140 MM NaCl, 산도 7.4 </td></tr><tr><td> 테아제 억제제 칵테일, EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 무료 </td><td> 써모 과학 </td><td> 78,415 </td><td></td></tr></tbody></table>

examining the role of nasopharyngeal-associated lymphoreticular tissue (nalt) in mouse responses to vaccines

인간, 설치류, 그리고 다른 포유류에서 발견 nasopharyngeal - 관련 lymphoreticular 조직 (NALT)는, 1-3 비강 sinuses의 면책 특권에 기여한다. NALT는 하드 구개 위의 비강에에 두개의 평행 종 모양의 구조물이며, 일반적으로 점막 - 관련 림프 시스템 4-6의 보조 구성 요소로 간주됩니다. 돌기 세포에게 4,7,8를 항원 제시와 함께 interspersed B 및 T lymphocytes의 이산 구획은 NALT 내에 위치하고 있습니다. 이러한 전지는 공기 통로 9,10의 점막 표면에서 항원 검색에 대한 책임은 M-세포와 intercalated 상피 세포 레이어로 둘러싸여있다. NALT 통해 순환 나이브 lymphocytes는 호흡기 병원균 7 첫번째 조우에 대응하기 위해 서 있습니다. NALT 두 세 의해 인간 사라지는 동안 Waldeyer의 반지와 마찬가지로 구조화된 림프 기관은 일을 지속 계속생활 6 roughout. 인간와는 달리, 생쥐 따라서 비강 sinuses 11 이내에 발생하는 면역 반응 연구를위한 편리한 동물 모델을 제공하고, 생명에 걸쳐 NALT을 유지합니다. NALT의 단일 세포 현탁액의 문화로 인해 mononuclear 세포의 낮은 수율에 대한 실용적 없습니다. 그러나 NALT 생물학은 그대로 기관의 전직 생체내의 culturing을 면밀히 검토하고,이 방법은 자연적인 조직 구조를 유지하는 추가적인 장점을 가지고 있습니다. 생체내 연구에 들어 NALT하도록 제한 결함을 보여주고 유전자 녹아웃 모델은 개발 경로의 가난한 이해로 인해 현재는 사용할 수 없습니다. 림프 독소-α 녹아웃 마우스는 NALT을 위축시키는 반면, 예를 들어, Peyer의 패치, 주변 림프절, follicular의 돌기 세포 및 다른 림프 조직은 또한이 유전자 조작 생쥐 12,13으로 변경됩니다. 유전자 녹아웃 마우스에 대한 대안, 수술 절제 P로ermanently 다른 조직에 영향을주지 않고 비강 통로에서 NALT을 없애줍니다. 그 결과 마우스 모델은 백신 1,3에 NALT와 면역 반응 간의 관계를 설정하는 데 사용되었습니다. 혈청, 타액, 비강 세차장과 질 분비물의 시리얼 컬렉션 NALT에서 직접 발생하는 면역 반응은 조직 배양에 의해 확인할 수 있습니다 반면, 예방 접종에 호스트 응답의 기초를 확립 필요합니다. 다음 절차는 필요 수술, 조직 문화 및 샘플 수집은 비강 (IN) 예방 접종에 대한 로컬 및 조직의 체액성 면역 반응을 조사하기 위해 설명합니다.

Watch this Scientific Journal Video about Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue NALT in Mouse Responses to Vaccines at JoVE.com

Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue NALT in Mouse Responses to Vaccines

비강 백신에 대한 생쥐의 비강 및 전신 면역 반응에 nasopharyngeal - 관련 lymphoreticular 조직 (NALT)의 공헌을 검사하는 방법이 설명되어 있습니다. 우리는 NALT 종속 마우스 모델을 수립하기 위해 수술을 발휘하고<em&gt; 예 생체내</em추출 NALT의&gt; 문화.

백신에 마우스 응답 Nasopharyngeal - 관련 Lymphoreticular 조직 (NALT)의 역할을 검토

The nasopharyngeal-associated lymphoreticular tissues (NALT) found in humans, rodents, and other mammals, contribute to immunity in the nasal sinuses1-3. ...

examining-role-nasopharyngeal-associated-lymphoreticular-tissue-nalt

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue (NALT) in Mouse Responses to Vaccines

25.4K 조회수.  U.S. Army Medical Research Institute of Infectious Diseases. 비강 백신에 대한 생쥐의 비강 및 전신 면역 반응에 nasopharyngeal - 관련 lymphoreticular 조직 (NALT)의 공헌을 검사하는 방법이 설명되어 있습니다. 우리는 NALT 종속 마우스 모델을 수립하기 위해 수술을 발휘하고 예 생체내 문화.

비디오: Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue NALT in Mouse Responses to Vaccines

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of Listeria, which results in systemic infection2. After injection, Listeria quickly disseminates to the spleen and liver due to uptake by CD8&alpha;+ dendritic cells and Kupffer cells3,4. Once phagocytosed, various bacterial proteins enable Listeria to escape the phagosome, survive within the cytosol, and infect neighboring cells5. During the first three days of infection, different innate immune cells (e.g. monocytes, neutrophils, NK cells, dendritic cells) mediate bactericidal mechanisms that minimize Listeria proliferation. CD8+ T cells are subsequently recruited and responsible for the eventual clearance of Listeria from the host, typically within 10 days of infection6.
Successful clearance of Listeria from infected mice depends on the appropriate onset of host immune responses6	. There is a broad range of sensitivities amongst inbred mouse strains7,8. Generally, mice with increased susceptibility to Listeria infection are less able to control bacterial proliferation, demonstrating increased bacterial load and/or delayed clearance compared to resistant mice. Genetic studies, including linkage analyses and knockout mouse strains, have identified various genes for which sequence variation affects host responses to Listeria infection6,8-14. Determination and comparison of infection kinetics between different mouse strains is therefore an important method for identifying host genetic factors that contribute to immune responses against Listeria. Comparison of host responses to different Listeria strains is also an effective way to identify bacterial virulence factors that may serve as potential targets for antibiotic therapy or vaccine design.
We describe here a straightforward method for measuring bacterial load (colony forming units [CFU] per tissue) and preparing single-cell suspensions of the liver and spleen for FACS analysis of immune responses in Listeria-infected mice. This method is particularly useful for initial characterization of Listeria infection in novel mouse strains, as well as comparison of immune responses between different mouse strains infected with Listeria. We use the Listeria monocytogenes EGD strain15 that, when cultured on blood agar, exhibits a characteristic halo zone around each colony due to &beta;-hemolysis1 (Figure 1). Bacterial load and immune responses can be determined at any time-point after infection by culturing tissue homogenate on blood agar plates and preparing tissue cell suspensions for FACS analysis using the protocols described below. We would note that individuals who are immunocompromised or pregnant should not handle Listeria, and the relevant institutional biosafety committee and animal facility management should be consulted before work commences.

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a model organism for studying immune responses and genetic susceptibility to intracellular bacteria in mice. This method enables one to measure bacterial load and generate single-cell suspensions of the liver and spleen from mice for FACS analysis to determine changes in immune cells due to Listeria infection.

감염된 마우스에 세균 하중과 면역 응답 측정 리스테리아 monocytogenes</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

연구

면역학 및 감염병학

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the physiological mechanisms that mediate immune responses to vaccines perhaps due to the overall success of vaccination, which has reduced interest into the molecular and physiological mechanisms of vaccine immunity. However, several important human pathogens including influenza virus still pose a challenge for vaccination, and may benefit from immune-based strategies. 
Although influenza reverse genetics has been successfully applied to the generation of live-attenuated influenza vaccines (LAIVs), the addition of molecular tools in vaccine preparations such as tracer components to follow up the kinetics of vaccination in vivo, has not been addressed. In addition, the recent generation of mouse models that allow specific depletion of leukocytes during kinetic studies has opened a window of opportunity to understand the basic immune mechanisms underlying vaccine-elicited protection. Here, we describe how the combination of reverse genetics and chimeric mouse models may help to provide new insights into how vaccines work at physiological and molecular levels, using as example a recombinant, cold-adapted, live-attenuated influenza vaccine (LAIV). We utilized laboratory-generated LAIVs harboring cell tracers as well as competitive bone marrow chimeras (BMCs) to determine the early kinetics of vaccine immunity and the main physiological mechanisms responsible for the initiation of vaccine-specific adaptive immunity. In addition, we show how this technique may facilitate gene function studies in single animals during immune responses to vaccines. We propose that this technique can be applied to improve current prophylactic strategies against pathogens for which urgent medical countermeasures are needed, for example influenza, HIV, Plasmodium, and hemorrhagic fever viruses such as Ebola virus.

There is an overall lack of knowledge about how vaccines work. Here we propose the combined use of reverse genetics and bone marrow chimeric mice to gain insight into the early host immune responses to vaccines with a special focus on dendritic cells and T cell immunity.

키메라 마우스 모델에서 재조합 인플루엔자 백신의 비강 관리는 점막 면역을 연구하기 위해

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. Although understanding the disease dynamics for each of these pathogens independently is vital, it is also important that the interactions between these pathogens are investigated and understood. 
We have developed a versatile in vitro model of HIV-malaria co-infection to study host immune responses to malaria in the context of HIV infection. Our model allows the study of secreted factors in cellular supernatants, cell surface and intracellular protein markers, as well as RNA expression levels. The experimental design and methods used limit variability and promote data reliability and reproducibility. 
All pathogens used in this model are natural human pathogens (Plasmodium falciparum and HIV-1), and all infected cells are naturally infected and used fresh. We use human erythrocytes parasitized with P. falciparum and maintained in continuous in vitro culture. We obtain freshly isolated peripheral blood mononuclear cells from chronically HIV-infected volunteers. Every condition used has an appropriate control (P. falciparum parasitized vs. normal erythrocytes), and every HIV-infected donor has an HIV uninfected control, from which cells are harvested on the same day. This model provides a realistic environment to study the interactions between malaria parasites and human immune cells in the context of HIV infection.

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Human co-infection is difficult to replicate in vitro. However, human malaria parasites can readily be cultured in vitro, as can freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells naturally infected with HIV. This provides an excellent model for studying early immune responses to malaria parasites in the context of HIV co-infection.

<em&gt; 체외</em&gt; HIV 공동 감염의 맥락에서 말라리아에 면역 반응을 측정하기위한 모델

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa

Xylella fastidiosa is a Gram-negative non-flagellated bacterium that causes a number of economically important diseases of plants. The twitching motility provides X. fastidiosa a means for long-distance intra-plant movement and colonization, contributing toward pathogenicity in X. fastidiosa. The twitching motility of X. fastidiosa is operated by type IV pili. Type IV pili of Xylella fastidiosa are regulated by pilG, a chemotaxis regulator in Pil-Chp operon encoding proteins that are involved with signal transduction pathways. To elucidate the roles of pilG in the twitching motility of X. fastidiosa, a pilG-deficient mutant Xf&#916;pilG and its complementary strain Xf&#916;pilG-C containing native pilG were developed. A microfluidic chambers integrated with a time-lapse image recording system was used to observe twitching motility in Xf&#916;pilG, Xf&#916;pilG-C and its wild type strain. Using this recording system, it permits long-term spatial and temporal observations of aggregation, migration of individual cells and populations of bacteria via twitching motility. X. fastidiosa wild type and complementary Xf&#916;pilG-C strain showed typical twitching motility characteristics directly observed in the microfluidic flow chambers, whereas mutant Xf&#916;pliG exhibited the twitching deficient phenotype. This study demonstrates that pilG contributes to the twitching motility of X. fastidiosa. The microfluidic flow chamber is used as a means for observing twitching motility.

Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa

In this study, a nano-microfluidic flow chamber was employed to visualize and functionally characterize the twitching motility of Xylella fastidiosa, a bacterium that causes Pierce&#39;s disease in grapevine.

의 역할의 꿈틀 운동성의 시각화 및 특성<em&gt; PilG</em&gt;에서<em&gt; Xylella의 fastidiosa</em

Xylella fastidiosa is a Gram-negative non-flagellated bacterium that causes a number of economically important diseases of plants. The twitching motility ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

호중구의 분리 및 분석 치료제에 림프종 세포 감도에서 자신의 역할을 확인하는 방법

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the pro-inflammatory capabilities of various factors is challenging and requires terminal procedures, such as bronchoalveolar lavage and the removal of lungs for in situ analysis, precluding longitudinal visualization in the same mouse. Here, lung inflammation is induced through the intratracheal instillation of Pseudomonas aeruginosa culture supernatant (SN) in transiently transgenized mice expressing the luciferase reporter gene under the control of a heterologous IL-8 bovine promoter. Luciferase expression in the lung is monitored by in vivo bioluminescent image (BLI) analysis over a 2.5- to 48-h timeframe following the instillation. The procedure can be repeated multiple times within 2 - 3 months, thus permitting the evaluation of the inflammatory response in the same mice without the need to terminate the animals. This approach permits the monitoring of pro- and anti-inflammatory factors acting in the lung in real time and appears suitable for functional and pharmacological studies.

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

The method described here allows for the visualization of IL-8 promoter-dependent inflammation activation in the lungs of mice through non-invasive bioluminescence imaging (BLI). The same animal can be subjected to BLI multiple times for up to two months from the time of delivery of the luciferase reporter construct.

IL-8 transiently Transgenized 마우스 모델<em&gt; In Vivo</em&gt; 염증 반응의 장기 모니터링

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

인간의 과발현과 정제<em&gt; 시스</em&gt; - 프레 닐 트랜스퍼 라제<em&gt; 대장균</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

살 모 넬 라 typhimurium의 절연-대 식 세포에서 Phagosomes를 포함 하

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Immunization of Adult Zebrafish for the Preclinical Screening of DNA-based Vaccines

The interest in DNA-based vaccination has increased during the past two decades. DNA vaccination is based on the cloning of a sequence of a selected antigen or a combination of antigens into a plasmid, which enables a tailor-made and safe design. The administration of DNA vaccines into host cells leads to the expression of antigens that stimulate both humoral and cell-mediated immune responses. This report describes a protocol for the cloning of antigen sequences into the pCMV-EGFP plasmid, the immunization of adult zebrafish with the vaccine candidates by intramuscular microinjection, and the subsequent electroporation to improve intake. The vaccine antigens are expressed as green fluorescent protein (GFP)-fusion proteins, which allows the confirmation of the antigen expression under UV light from live fish and the quantification of expression levels of the fusion protein with ELISA, as well as their detection with a western blot analysis. The protective effect of the vaccine candidates is tested by infecting the fish with Mycobacterium marinum five weeks postvaccination, followed by the quantification of the bacteria with qPCR four weeks later. Compared to mammalian preclinical screening models, this method provides a cost-effective method for the preliminary screening of novel DNA-based vaccine candidates against a mycobacterial infection. The method can be further applied to screening DNA-based vaccines against various bacterial and viral diseases.

Here we describe a protocol for the immunization of the adult zebrafish (Danio rerio) with a DNA-based vaccine and demonstrate the validation of a successful vaccination event. This method is suitable for the preclinical screening of vaccine candidates in various infection models.

DNA 기반 백신의 임상 검사에 대 한 성인 Zebrafish의 예방접종

The interest in DNA-based vaccination has increased during the past two decades. DNA vaccination is based on the cloning of a sequence of a selected ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

호스트 병원 체 응답 및 쥐에 백신의 효능 평가

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...