이 프로토콜은 다양한 병원체 및 백신 제형에 대한 숙주 반응의 평가를 가능하게 한다. 이 기술의 주요 장점은 인가 성 동물 모델을 사용하여 생체 내에서 세균적 부담과 면역 반응을 평가할 수 있다는 것입니다. 이 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 대학원생 인 Kacy Yount입니다.
예방 접종을 위해, 마취, 6-12 주 된 마우스에 발가락 핀치에 대한 반응의 부족을 확인하고, 관심의 백신의 0.1 밀리리터와 28.5 게이지 바늘을 장착 한 1 밀리리터 인슐린 주사기를로드. 주사기를 45도 각도로 잡고, 벨이 위로 향하도록, 마우스의 망상에 약 5밀리미터 바늘을 삽입하고 백신을 주입한다. 5~10초 동안 근육에 삽입된 바늘을 유지한 다음 주사기 180도 회전하여 벨이 아래로 향하도록 밀봉을 만들고 백신 누출을 방지한 후 주사 부위에서 바늘을 천천히 철회합니다.
그런 다음 마우스를 전체 복구할 때까지 모니터링하여 케이지에 반환합니다. 증폭 후 약 2 주, 면역 마우스를 감염. 등대 흉부의 스크러프에 의해 마취 된 마우스를 잡고, 견갑골과 목 뒤에 마우스를 똑바로 배치하여 코에 액세스합니다.
200 마이크로리터 파이펫 팁을 사용하여, 동물의 각 nare에 관심있는 세균 접종의 20 ~ 25 마이크로 리터를 천천히 적용하여 전체 접종이 흡입 될 때까지 마우스를 유지합니다. 그런 다음 음의 대조군으로서 한 무리의 마우스에 멸균 PBS의 동일한 부피를 전달한다. 적절한 실험 적 종점에서 감염된 마우스 복부 면을 해부 보드에 올려 놓고 팔다리를 고정시하십시오.
70%에탄올로 몸을 적시고, 집게를 사용하여 골반 의 중앙에 있는 복부 아래 피부를 걸이세요. 날카로운 가위를 사용하여 하악까지 수직으로 자르고 피부가 수막 벽에서 해부합니다. 시체를 옆으로 이동하여 멸균 기관 수확을 위한 방해받지 않는 필드를 만들고 간 에서 또는 그 근처에서 흉곽 아래의 그대로 회대를 잡습니다.
관장을 흉곽쪽으로 자르고 하부 소화관을 노출시키고 결장을 왼쪽으로 이동하여 비장을 드러냅니다. 구부러진 집게를 사용하여 비장을 잡고 결합 조직을 가위로 해부합니다. 그런 다음 비장을 RPMI 3 밀리리터, 5%의 태아 소 혈청이 들어 있는 15밀리리터 원추형 튜브에 놓습니다.
집게를 사용하여 xyphoid 공정에서 흉곽을 안정화하고 다이어프램을 열어 줍니다. 폐는 수축하고 척추쪽으로 떨어져야 합니다. 유방판을 제거하기 위해 측면에 흉곽을 열고, 폐 동맥과 정맥을 잘라 오른쪽 폐의 우수한 엽을 분리하고 제거합니다.
15밀리리터 원내 형질관에서 10% 중성 버퍼링 포머린을 실온에서 24시간 이상 고정하고, 좌우 폐의 나머지 엽을 분리한다. 그런 다음 15 밀리리터 원내 튜브에 로브를 배치하여 PBS에서 1%의 카제인 2마리를 얼음 위에 놓습니다. 팁이 있는 1밀리리터 피펫맨을 사용하여 가슴 구멍을 채우는 혈액을 수집하고 혈액을 얼음 위에 1.5 밀리리터 미세센심분리기 튜브로 이송합니다.
기관지를 덮고 있는 파로티드, 설하 및 하막및 림프절을 제거하고 기관 주변의 보호 막을 열고 제거합니다. 미세 한 집게와 가위를 사용 하 여, 정중 하 게 식도에서 기관, 그리고 다른 결합 조직 쇄골의 상단에서 하악의 바닥에. 집게를 사용하여 기관지의 상단에서 기관을 잘라냅니다.
기관체를 아래로 당겨 탄력을 극대화하고 하악의 바닥에있는 기관체를 후두 바로 위에 자르고 조직의 약 1 센티미터를 격리시합니다. 그런 다음 전자 제품PBS에서 1%카제인의 0.3 밀리리터를 함유한 사전 라벨이 부착된 1.5 밀리리터 미세원심분리기 튜브에 기관을 놓습니다. 이제 마우스를 돌려 코에 대한 명확한 접근을 하고 머리를 70%에탄올로 스프레이합니다.
두개골 바로 뒤에 동물을 수동으로 잡고 가위를 사용하여 주둥이의 부드러운 살을 잘라 코 바닥에서 시작하여 위쪽으로 이동합니다. 코 주위에서 모피, 피부, 수염을 제거하고 곡선이 아래쪽으로 뾰족한 나레에 곡선한 가위 쌍의 팁을 삽입합니다. 눈을 향해 비강 통로를 열어 V와 같은 형성을 만듭니다.
그런 다음 미세 포셉을 사용하여 비강 중격및 형성 내의 연조직을 수집하고, PBS에서 1%카제인의 0.3 밀리리터를 함유한 사전 표지된 1.5 밀리리터 미세원심분리기 튜브에 얼음에 배치한다. 폐 조직을 처리하기 위해, 전체 폐 샘플 튜브 내용을 멸균 15 밀리리터 두근화제로 옮기고 유봉을 사용하여 조직을 균질화한다. 조직의 큰 입자가 남아 있지 때까지 샘플을 해리하고, 원래 15 밀리리터 튜브에 균질화 현탁액을 반환합니다.
도금 콜로니 성형 유닛에 대한 0.3 밀리리터 알리쿼트를 제거하고 원심분리에 의해 나머지 균동형을 수집합니다. Aliquot 0.5 밀리리터는 엘리자에 의한 사이토카인 발현 분석전까지 섭씨 20도에서 보관하기 위해 미리 표지된 미세 원심분리기 튜브로 고정합니다. 이어서, 희석당 멸균 PBS0.9 밀리리터에서 균질화된 폐 현탁액을 따로 0.1 밀리리터 알리쿼트, 멸균 삼각형 스프레더를 사용하여 각 경험적으로 선택된 10%의 희석제에 10%의 보르데-겐구플러스 스트렙토미크플레이트를 부착한다.
여기서, 대표적인 광학밀도(600)는 1개의 광학 밀도 세균현탁액을 달성하기 위한 측정 및 계산을, 마우스에 전달되는 100배의 희석된 세균 접종을 제조하는 것으로, 도시된다. 7일간의 백신 항원 자극 후, 조합 백신 그룹에서 면역비진 세포는 인터페론 감마및 IL17을 생성하며, IL5를 크게 조절하고 T 도우미를 촉진하고, 1T 도우미 17편광은 B 백일해 감염 시 면역 반응의 편광을 일으킨다. B 백일해 감염 마우스의 호흡기 문제로부터 회수된 박테리아의 콜로니 형성 단위 열거형은 관심 있는 백신의 보호 효과를 평가하는 데 사용될 수 있다.
조직 괴사를 피하기 위해 가능한 한 신속하고 효율적으로 작동하고, 복구 된 박테리아의 생존력을 보존하기 위해 얼음에 고립 된 조직을 저장합니다. ELISpot 흐름 세포질과 DNA 및 RNA 격리는 면역 세포, 분석 생성을 평가하고 후생유전학 및 전사 분석을 가능하게 하기 위해 수행될 수 있다. 보르데텔라 등일해와 같은 전염성 제제와 함께 작업할 때는 적절한 PPE를 착용하고 병원균 전염을 방지하기 위해 인증된 생물 안전 캐비닛에서 일하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.
이 프로토콜은 호흡기, 특히 비강 인두에서 CFU 열거를 자세히 설명합니다. 백신 및 전염병 분야에서 코의 세균 성 식민지를 대상으로하는 것에 대한 질문을 해결합니다.
