로빈슨의 실험실에서 연구 Aging-Associated 질병, 쾰른 대학, 독일에서에서 세포질 긴장 응답에 쾰른 우수 클러스터에서 자금에 의해 지원 됩니다 (CECAD; 독일 연방의 우수 이니셔티브에서 DFG, 투자 및 정부 국가)와 도이치 가운데 (SFB 670), 쾰른 재산, 그리고 쾰른, 독일의 대학의 마리아 Pesch 재단에서 교부 금.

병원 성 미의 사용을 포함 하는 모든 단계 typhimurium BSL-2 또는 더 높은 생물 학적 보안 수준의 시설에서 실시 해야 합니다. 문화와 미의 코팅 골 수 유래 세포 (BMDMs)의 감염 뿐 아니라 Typhimurium, 오염을 방지 하기 위해 층 류 후드에서 수행 되어야 합니다. 미의 격리 typhimurium-phagosomes를 포함 하는 어떤 BSL-2 실험실 벤치에 수행할 수 있습니다.
 대 식 세포로의 분화에 대 한 쥐에서 골의 추출에 동물 복지 기관 지침에 따라 수행 되었고 자연, 북쪽 라인 강 Westphalian 국가 기관에 의해 승인 환경 및 소비자 보호 [Landesamt 위한 Natur, Umwelt 및 Verbraucherschutz (LANUV) 노르 트 베스트 팔 렌; 파일 번호: 84-02.05.40.14.082와 84-02.04.2015.A443]와 쾰른 대학.
 1. Culturing S. typhimurium <li>Inoculate S. <ol> typhimurium (SL1344 스트레인) 세균성 루프를 사용 하 여 두뇌 심 혼 주입 (BHI) 국물의 5 mL로 단일 세균성 식민지에서.</li>
	<li>떨고와 하룻밤 37 ° C에서 인큐베이터에서 세균성 정지를 품 어.</li>
	<li>다음 날, 세균 현 탁 액의 1 mL 원뿔 플라스 크에서 BHI 국물의 19 mL로 하 고 떨고와 인큐베이터에서 37 ° C에서 품 어.</li>
	<li>모니터링 미 600에서 광학 밀도 (OD)를 측정 하 여 typhimurium 성장 nm (OD 600)는 분 광 광도 계. 측정 30 분 마다 약을 복용 해야</li>
	<li>때 세 600 1.0에 도달할 때, 인큐베이터 및 50 mL 튜브에 전송에서 세균 현 탁 액을 제거 합니다. 4에서 15 분 동안 5400 x g에서 박테리아를 원심 ° c.</li>
	<li>상쾌한을 제거 하 고 10 mL의 멸 균 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)에서 resuspend.</li>
	<li>4 ° c.에 15 분 동안 5400 x g에서 원심 분리기</li>
	<li>는 상쾌한을 제거 하 고 살 균 PBS의 4.9 mL에 박테리아 resuspend.</li>
</ol> 2. S. typhimurium NHS-비오 틴/Streptavidin-활용 자석 구슬의 코팅 <ol><li>10 mg/mL의 추가 100 µ L biotin 연결 솔루션 (NHS-비오 틴 디 메 틸 sulfoxide, DMSO에에서 용 해) 갓 준비, 세균 현 탁 액 이전 단계에서 준비. 예를 들어 메 마른 DMSO의 0.5 mL에 NHS-비오 틴의 5 mg을 희석. 제대로 몇 번 위아래로 pipetting으로 믹스.</li>
	<li>5 1.5 mL 튜브에 믹스를 분할.</li>
	<li>350 rpm에서 일정 한 동요와 함께 실 온 (RT)는 thermoblock에에서 2 h에 대 한 품.</li>
	<li>튜브 RT에서 10 분 동안 15000 x g에서 원심 및 삭제는 상쾌한.</li>
	<li>살 균 PBS, RT에서 10 분 동안 15000 x g에서 원심 분리기의 1 mL에 resuspend 및 삭제는 상쾌한.</li>
	<li>솔루션 연결 초과 biotin을 완전히 제거 하려면 단계 2.5 두 번 더 반복.</li>
	<li>마지막 세척 후 살 균 PBS의 1 mL에 펠 릿 resuspend.</li>
	<li>1.5 mL 튜브에 10 mg/mL streptavidin 활용 자석 구슬 솔루션의 100 µ L를 전송 하 고 5 분에 대 한 자석 선반에 두고</li>
	<li>는 피 펫과 용 매를 제거, 자기 선반에서 streptavidin-활용 자석 구슬 솔루션 고 biotin 코팅 세균 현 탁 액 단계 2.7에서에서 준비의 1 mL와 함께 그것을 resuspend.</li>
	<li>350 rpm에서 일정 한 동요와 thermoblock에 RT에 1 시간에 대 한 품.</li>
	<li>솔루션에 자석 랙; 5 분 기다려 놓고 다음 벽에 고착 하지 않았다 박테리아는 피 펫으로 제거 (튜브로 계속 &#34; 비 코팅 박테리아 &#34;). 자석 접촉 튜브의 벽에 준수 하는 분수는 비오 틴/streptavidin 입히는 박테리아.</li>
	<li>자석 선반에서 레이블이 박테리아를 포함 하는 튜브를 제거 하 고 살 균 PBS의 1 mL에 resuspend.</li>
	<li>자석 선반에 그것을 다시 배치, 5 분 대기 고는 피 펫을 사용 하 여 PBS를 제거.</li>
	<li>는 streptavidin 활용 자석 구슬에 입힌 모든 박테리아를 제거 하 2.13, 2.14 단계 두 번 더 반복.</li>
	<li>마지막 세척 후 코팅-박테리아 살 균 PBS의 500 µ L에 resuspend 하 고로 튜브 라벨 &#34; 박테리아 코팅 &#34;.</li>
	<li>계산 콜로 니 형성 단위 (cfu) 둘 다의 &#34; 비 코팅 박테리아 &#34; 및 &#34; 박테리아 코팅 &#34; BHI 한 천 배지에서 직렬 희석 도금 솔루션. 대략 2 x 10 8 cfu/mL 코팅-박테리아의 1.0의 OD 600와 초기 세균 현 탁 액의 20 mL에서 얻을 수 있습니다. 코팅-박테리아 정지 대 식 세포를 감염 하는 다음 날에 사용 될 4 ° C에서 유지.</li>
</ol> 3. BDMDs의 감염 <ol><li>완전히 접시 때 박테리아 biotin와 streptavidin 활용 자석 구슬 코팅은 같은 날 6 cm 요리 접시 당 5 x 10 6 세포의 밀도에서 차별화 된 BMDMs 22.</li>
	<li>다음 날, 4에 5 분 동안 15000 x g 코팅-박테리아 정지 원심 ° c.</li>
	<li>는 상쾌한을 제거 하 고 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 보충 로스웰 파크 기념 연구소 (RPMI) 매체에서 10 x 10 6 cfu/mL의 농도에서 resuspend.</li>
	<li>10, 감염 (MOI)의 다양성에 대 식 세포를 감염 하는 BMDMs에서 매체를 제거 하 고 코팅-박테리아 정지 준비의 5 mL을 추가. 최적의 나 모든 셀 또는 격리 된 phagosomes의 실험 목적에 대 한 평가 수 있습니다.</li>
	<li>먹어서 동기화 10 분 RT에서 품.</li>
	<li>품 먹어서 시작 30 분 5% CO 2 배양 기에서 37 ° C에서. 다른 세포 유형 다른 보육 시간 박테리아의 국제화를 위해 필요할 수 있습니다.</li>
	<li>요리에서 박테리아를 포함 하는 매체를 제거 하 고 비 내 면 박테리아를 제거 하 RPMI 셀 세 번 세척.</li>
	<li>마지막으로 어떤 비 phagocytized 박테리아를 죽 일 10 %FBS 및 50 µ g/mL gentamycin 포함 된 RPMI의 10 mL을 추가.</li>
	<li>원하는 시간 까지는 5% CO 2와 37 ° C에서 감염 된 BMDMs를 품 어. 원하는 시간 포인트 박테리아 및 셀 형식 사용 및 분석의 목적에 따라 실험적으로 결정 되어야 합니다. 미에서 초기 phagosome endosome 퓨전 이벤트의 연구에 대 한 Typhimurium 감염 BMDMs 30 분 부 화는 것이 좋습니다. 나중에 이벤트의 분석을 위한 phagosomes 2 h 또는 외피의 4 h 후 추출할 수 있습니다. 미와 대 식 세포의 장기 배양 24 시간 넘어 Typhimurium 대 식 세포의 죽음에서 발생합니다. 확장 세포내 감염 전에 phagosome 추출 아마 비오 틴 분자의 저하로 이어질 수 있습니다. 그러나, 우리가 않았다 관찰 하지 코팅-박테리아에 biotin의 손실까지 24 h.</li>
</ol> 4. 미의 격리 typhimurium-Phagosomes 포함 된 <ol><li>준비 필요한 phagosome 볼륨 절연 버퍼는 (50 m m 파이프, pH.7, 50 mM MgCl 2, 5mm EGTA) 1 m m, Cytochalasin B는 최종의 최종 농도를 dithiothreitol (DTT)을 추가 하 여 제조업체에서 권장 하는 대로 10 µ M, 프로 테아 제와 인산 가수분해 효소 억제제의 농도. 
	참고: DTT와 Cytochalasin B에 추가 되어야 합니다 phagosome 절연 버퍼는 사용 전에 항상 즉시. Cytochalasin B 방해 세포 골격, 세포 막의 파열을 촉진.</li>
	<li>원하는 시간에 포인트, 감염 된 세포에서 매체를 제거 하 고 실시간에 따뜻하게 살 균 PBS로 세척</li>
	<li>Phagosom의 추가 750 µ Le 절연 접시 당 A를 버퍼링 하 고 얼음에 20 분을 품 어. 다른 휴대폰 번호를 사용할 경우 절연 버퍼 A의 볼륨 비례적으로 조정 되어야 합니다.</li>
	<li>추가 250 µ L phagosome 절연 버퍼 B (50 m m 파이프, pH.7, 50 mM MgCl 2, 5mm EGTA, 220 mM 마 니 톨, 및 68 mM 자당). 버퍼는 접시의 전체 표면에 도달 되도록 접시 바위. 다른 휴대폰 번호를 사용할 경우 절연 버퍼 B 양의 비례적으로 조정 되어야 합니다.</li>
	<li>고무 경찰관을 사용 하 여 부드럽게 된다고 하 여 접시에서 셀을 제거 하 고 미리 냉장된 1.5 mL 튜브에 그들을 전송.</li>
	<li>세포 현 탁 액 26 G 바늘 1 mL 주사기를 사용 하 여 적어도 15 번 (한 포부와 한 번으로는 셀 서 스 펜 션의 한 방출) 통과. 이것은 BMDMs의 cytosolic 콘텐츠 공개 충분 하다. 바늘을 통해 전달 수 모든 세포 유형에 대 한 최적화 해야 합니다.</li>
	<li>자석 선반에 세포 현 탁 액을 배치 하 고 5 분을 기다립니다. 자석에 부착 된 입자는 포함 하는 코팅-미 phagosomes Typhimurium입니다. 세포 구성 성분의 나머지를 포함 하는 정지.</li>
	<li>정지로 1.5 mL 튜브에 전송 &#34; cytosol &#34;.</li>
	<li>자석 선반에서 분리 된 phagosomes와 튜브를 제거 하 고 살 균 PBS의 1 mL에 그들을 resuspend.</li>
	<li>Phagosome 정지 자석 선반에, 5 분 대기 장소와 PBS를 제거.</li>
	<li>4.9-4.10 격리 미를 씻어 반복 단계 typhimurium-포함 하는 phagosomes.</li>
	<li>는 마지막으로 PBS를 제거 하 고 필요한 버퍼; 예를 들어 단백질 분석에 대 한 radioimmunoprecipitation 분석 결과 (RIPA) 버퍼는 phagosomes resuspend. 단백질의 약 50-200 µ g 샘플 셀의 초기 금액 및 감염의 나에 따라,이 프로토콜에 따라 당 얻은 것입니다.</li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개 없다.

미 의 격리에 대 한 새로운 방법 typhimurium-여기 설명 biotin와 streptavidin 활용 자석 구슬 박테리아를 코팅 하 여 phagosomes를 포함 하. 부드러운 파괴 후 세포 막의, 포함 하는 박테리아 phagosomes 추출할 수 있습니다 쉽게 자기 선반을 사용 하 여. 우리는 박테리아의 라벨 염증을 유발 하는 병원 체의 용량을 유지 하 고 호스트 세포의 phagocytic 속성을 변경 하지 않습니다 보여줍니다. 중요 한 ?...

대 식 세포는 검색 하 고, 아마, 어떤 이물질 침입 박테리아 등 미생물까지 apoptotic 세포에서 주변 조직에 저하 전문된 phagocytic 세포 순환 하 고 있다. 병원 체 특정 마커 미생물 (병원 체 관련 된 분자 패턴 또는 PAMPs 라고도 함)의 표면에 일반적으로 존재의 표면 수용 체-중재 인식, 시 세포에서 세포 막의 복잡 한 개편 시작 서라운드 및 병원 체1phagocytize 순서입니다.
몸부림치 병원 체 라고 phagosome 세포내 소포에서 대 식 세포에 의해 다음 포함 되어 있습니다. 일련의 융해 및 분열 이벤트 endosomes 리소좀 등 다른 소포를 통해 병원 체 포함 phagosome phagosomal 콘텐츠 제거에 필요한 단백질의 집합을 가져옵니다. 따라서,는 phagosome의 효소 구성 phagosome 성숙2로 알려진이 프로세스 과정에서 매우 변수입니다.
식 균 작용, 복잡 한 vacuolar ATPase (v-ATPase) phagosome 막 endosomes3융합에 의해 통합 됩니다 multimeric 직후 이 복잡 한 phagosome4의 루멘에 cytosol에서 펌프 양성자에 ATP를 사용합니다. 산성화는 phagosome의 다른 소포5 퓨전 이벤트와 pH-종속 degradative 효소6의 큰 숫자의 활성화를 위해 필수적 이다. 또 다른 multimeric 효소 복잡 한 phagosome 멤브레인에 신속 하 게 조립 하는 NADPH 산화 효소 (NOX) 복잡 한이입니다. NOX 복잡 한 반응성 산소 종 (선생님)을 phagosome 루멘으로 은닉 되 고 몸부림치 미생물7의 살인에 크게 기여를 생성 하기 위하여 NADPH 산화 한다.
성숙의 초기 단계 동안 phagosomes Rab5 등 각각8v ATPase V0 소 단위와 함께 초기 및 늦은 endosomes의 Rab7 일반적으로 마커를 제시. Phagosomes 늦은 endosomes와 리소좀의 융합 결과 cathepsin 프로 테아 제, lipases, β-galactosidase9등 가수분해 효소의 다양 한 phagocytized 병원 체의 노출. 루멘의 산성화는 또한이 효소의 활성화를 위해 필요 합니다. 예를 들어 활성 약식 생산 cathepsin D의 분열 pH 의존10입니다. 이 효소는 병원 체를 저하 하 고 병원 체 파생 짧은 펩 티 드의 macrophage 중요 한 조직 적합성 복잡 한 (MHC) 클래스 II 분자 T 세포는 적합 한 면역 반응11하에서 제공 하는 생산을 중재.
따라서 phagosome 성숙은 타고 난 면역 반응에 대 한 중요 하 고 링크 타고 난 및 적응형 면역 시스템의 팔. 그것은 전혀 놀라운 병원 체 phagosome 성숙의 위 설명 된 과정을 통해 세포에 의해 제거 극복 하는 전략을 진화 했다. 예를 들어 결핵균 , 레지오 넬 라 pneumophila 세포내 박테리아 방지 억제 v ATPase 어셈블리 및 필연적인 루멘 산성화12,13 phagosome 성숙 . 다른 박테리아, Listeria monocytogenes 등 Shigella flexneri cytosol14,15로 탈출 phagosome 막에서 기 공 형성 유도. 다른 한편, 살 모 넬 라 enterica serovar typhimurium (S. typhimurium) 16의 복제 대 한 적당 한 위치에 그것을 변환 하는 공포에서 phagosome의 속성을 수정할 수 있다. 이 능력은 미 typhimurium phagosome 성숙의 병원 체 중재 간섭 공부에 매우 흥미로운 모델.
S. typhimurium 인간에서 위장염을 일으키는 facultative 세포내 박테리아 이다. Lamina propria, 미 의 침공 후 Typhimurium 박테리아 및 감지 신속 하 게는 대 식 세포에 의해 phagocytized 그리고 phagosomes17내 포함. 일부 보고서는 그 미 를 앞에서 설명한 typhimurium-포함 phagosomes 제시 endosomes와 리소좀18, 제조 업체 및 다른 연구 phagosome 리소좀 퓨전 S. 시 방해 발견 Typhimurium 감염19.
처음, phagosome 성숙 미 시 typhimurium 감염 면역 형광 검사 현미경 검사 법에 의해 조사 했다. 포함 하는 박테리아의 고립에 대 한 기술의 개발 phagosomes endosome와 리소좀 마커 점에서 phagosome 내용의 더 정확한 연구를 활성화. 날짜, 포함 하는 박테리아의 절연에 사용 되는 주요 방법 phagosomes 자당 단계 그라디언트18,20subcellular 분류입니다. 그러나,이 방법은 여러 원심 분리 단계를 phagosomes 기계적 손상 될 수 있습니다, phagosomal 구성 요소 (단백질, 지질)의 안정성에 영향을 미칠 수 있는 시간이 소요 됩니다 필요 합니다. 또한, 그것 요구는 ultracentrifuge의 사용: 모든 실험실에 대 한 액세스할 수 있는 특수 장비의 한 조각.
최근, 새로운 접근 포함 하는 박테리아의 고립에 적용 된 phagosomes, biotinylated lipopetide (Lipobiotin)와 나중 세균성 병원 체는 분류는 streptavidin 활용 자석 구슬21 사용 하 여 추출 . 우리는 streptavidin 활용 자석 구슬 이어서 세균성 표면 아민 함유 고분자 NHS-비오 틴의 라벨 다른 보완적인 방법을 제안 합니다. Phagosomes이 메서드에서 얻은 endosome와 리소좀 표식에 풍성 하 게 높은 고 분석 실험, omics 분석 단백질 분석에서의 광범위 한 범위에 사용할 수 있습니다. 또한, 그것은 ultracentrifuges 같은 전문된 장비를 필요 하지 않습니다. 또한, 원심 분리 단계를 제거 함으로써 phagosomes에 기계적 손상 및 고용 시간을 상당히 줄일 수 있습니다. 이 메서드는 phagosomes 포함 하는 다른 박테리아는 그람 양성 포도 상 구 균,이 원고에 포함 등의 절연에 대 한 쉽게 적응 될 수 있다. 요약 하자면, 미 의 격리에 대 한이 방법은 typhimurium-phagosomes를 포함 하는 단순 하 고, 비용 효율적인, 그리고 자당에 의해 클래식 격리 보다 소비 하는 시간이 적은 그라데이션-ultracentrifugation, 높은 렌더링 농축 박테리아 포함 된 phagosomes.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>EZ-Link NHS Biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>20217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluidMag Streptavidin</td>
			<td>Chemicell</td>
			<td>4205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9156.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>A537.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3054.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4621.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4175.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease and Phosphatase inhibitor cocktail</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1861280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DYNAL or DynaMag Magnet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SmartSpec 3000 Spectrophotometer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-2501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial loop (10&#181;l)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>86.1562.010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1344</td>
			<td>Leibniz Institute DSMZ-German collection of Microorganisms and Cell Cultures</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>FG1415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L1825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5-streptavidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>SA1011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-beta-actin antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-47778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mCherry antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PA5-34974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Rab5 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-46692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Rab7 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-10764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-v-ATPase (V0) antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-28801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-v-ATPase (V1) antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-20943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-cathepsin D antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-6486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Tomm20 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-17764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-calnexin antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-46669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GAPDH antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-20357</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages

살 모 넬 라 typhimurium 인간에서 위장염을 일으키는 facultative 세포내 박테리아 이다. Lamina propria S. 의 침공 후 typhimurium 박테리아 및 감지 신속 하 게는 대 식 세포에 의해 phagocytized 그리고 소포 저하 될 하기 위해 phagosomes로 알려진에 포함 된. 미 의 격리 typhimurium-포함 phagosomes 널리 사용 되었습니다 공부 어떻게 미 typhimurium 감염 세균 저하를 방지 하기 위해 phagosome 성숙의 과정을 변경 합니다. 고아 하 게, 포함 하는 박테리아의 격리 phagosomes 자당 기온 변화도 원심 분리에 의해 수행 되었습니다. 그러나,이 과정은 시간이 많이 걸리는, 이며 전문된 장비와 어느 정도의 손 재주. 여기에 설명 된은 미 의 격리에 대 한 간단 하 고 빠른 방법 typhimurium-자석 구슬 biotin streptavidin 활용 된 박테리아를 코팅 하 여 세포에서 phagosomes를 포함 하. Phagosomes이이 방법으로 얻은 분석 실험, 단백질, 대사 산물, 및 지질 분석 등의 광범위 한 범위에 대 한 격리 된 phagosomes의 사용을 허용 하는 선택의 어떤 버퍼에 중단 될 수 있습니다. 요약 하자면, 미 의 격리에 대 한이 방법은 typhimurium-phagosomes 포함 된 특정, 효율, 빠른, 최소 장비를 요구 이며 자당 기온 변화도-ultracentrifugation 격리의 고전적인 방법 보다 더 다양 한.

포함 하는 박테리아의 고립이이 프로토콜에 의해 phagosomes 필요한 첫 번째 단계는 박테리아의 biotinylation. 우리는 그러므로 미 의 효과 평가 BMDMs biotinylated 감염의 confocal 현미경 분석에 의해 typhimurium biotinylation mCherry-S. typhimurium Cy5 Streptavidin 표시입니다. 간단히, BMDMs mCherry-S와 함께이 프로토콜에서 설명 된 대로 감염 되었다. typhimurium ...

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Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

여기 살 모 넬 라 typhimurium의 격리에 대 한 간단 하 고 빠른 방법 설명-비타민 b 복합체와 streptavidin 박테리아를 코팅 하 여 세포에서 phagosomes를 포함 하.

살 모 넬 라 typhimurium의 절연-대 식 세포에서 Phagosomes를 포함 하

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

isolation-salmonella-typhimurium-containing-phagosomes-from

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

10.5K 조회수.  University of Cologne. 여기 살 모 넬 라 typhimurium의 격리에 대 한 간단 하 고 빠른 방법 설명-비타민 b 복합체와 streptavidin 박테리아를 코팅 하 여 세포에서 phagosomes를 포함 하.

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Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and food antigens while concomitantly remaining poised to mount inflammatory responses toward invasive pathogens1,2. Antigen presenting cells, particularly DCs and macrophages, play critical roles in maintaining intestinal immune homeostasis via their ability to sense and appropriately respond to the microbiota3-14. Efficient isolation of intestinal DCs and macrophages is a critical step in characterizing the phenotype and function of these cells. While many effective methods of isolating intestinal immune cells, including DCs and macrophages, have been described6,10,15-24, many rely upon long digestions times that may negatively influence cell surface antigen expression, cell viability, and/or cell yield. Here, we detail a methodology for the rapid isolation of large numbers of viable, intestinal DCs and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is carried out by directly staining isolated intestinal cells with specific fluorescence-labeled monoclonal antibodies for multi-color flow cytometric analysis. Furthermore, highly pure DC and macrophage populations are isolated for functional studies utilizing CD11c and CD11b magnetic-activated cell sorting beads followed by cell sorting.

Here, we detail a methodology for the rapid isolation of mouse intestinal dendritic cells (DCs) and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is performed using multi-color flow cytometric analysis while magnetic bead enrichment followed by cell sorting is used to yield highly pure populations for functional studies.

마우스 소장에서 돌기 세포 및 Macrophages의 분리 및 특성화

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and ...

연구

면역학 및 감염병학

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote its motility and dissemination. New work has shown that proteins involved in actin-based motility are also linked to autophagy, an intracellular degradation process crucial for cell autonomous immunity. Strikingly, host cells may prevent actin-based motility of S. flexneri by compartmentalizing bacteria inside &#8216;septin cages&#8217; and targeting them to autophagy. These observations indicate that a more complete understanding of septins, a family of filamentous GTP-binding proteins, will provide new insights into the process of autophagy. This report describes protocols to monitor autophagy-cytoskeleton interactions caused by S. flexneri in vitro using tissue culture cells and in vivo using zebrafish larvae. These protocols enable investigation of intracellular mechanisms that control bacterial dissemination at the molecular, cellular, and whole organism level.

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

To counteract pathogen dissemination, host cells reorganize their cytoskeleton to compartmentalize bacteria and induce autophagy. Using Shigella infection of tissue culture cells, host and pathogen determinants underlying this process are identified and characterized. Using zebrafish models of Shigella infection, the role of discovered molecules and mechanisms are investigated in vivo.

사용<em&gt; 시겔 flexneri</em&gt; 자식 작용 - 세포 뼈대의 상호 작용을 연구하는

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying Salmonella-host interactions are&#160;important to elucidate the molecular pathogenesis of Salmonella infection. The Gentamicin protection assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in phagocytic cells was adapted to allow high-throughput screening to define the roles of deletion mutants of Salmonella enterica serotype Typhimurium in host interactions using RAW 264.7 murine macrophages. Under this protocol, the variance in measurements is significantly reduced compared to the standard protocol, because wild-type and multiple mutant strains can be tested in the same culture dish and at the same time. The use of multichannel pipettes increases the throughput and enhances precision. Furthermore, concerns related to using less host cells per well in 96-well culture dish were addressed. Here, the protocol of the modified in vitro Salmonella invasion assay using phagocytic cells was successfully employed to phenotype 38 individual Salmonella deletion mutants for association, invasion and intracellular replication. The in vitro phenotypes are presented, some of which were subsequently confirmed to have in vivo phenotypes in an animal model. Thus, the modified, standardized assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in macrophages with high-throughput capacity could be utilized more broadly to study bacterial-host interactions.

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

A high-throughput assay to in vitro phenotype Salmonella or other bacterial association, invasion, and replication in phagocytic cells with high-throughput capacity was developed. The method was employed to evaluate Salmonella gene knockout mutant strains for their involvements in host-pathogen interactions.

표현형 높은 처리량 분석<em&gt; 살모넬라 엔테</em&gt; 티피 뮤 리움 협회, 침략, 그리고 대 식세포에서의 복제

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like Shigella flexneri and Francisella novicida need to induce the rupture of the phagosome. In contrast, Salmonella typhimurium replicates in a vacuolar compartment, known as Salmonella-containing vacuole (SCV). However certain mutants of Salmonella fail to maintain SCV integrity and are thus released into the cytosol. The percentage of cytosolic vs. vacuolar bacteria on the level of single bacteria can be measured by differential permeabilization, also known as phagosome-protection assay. The approach makes use of the property of detergent digitonin to selectively bind cholesterol. Since the plasma membrane contains more cholesterol than other cellular membranes, digitonin can be used to selectively permeabilize the plasma membrane while leaving intracellular membranes intact. In brief, following infection with the pathogen expressing a fluorescent marker protein (e.g. mCherry among others), the plasma membrane of host cells is permeabilized with a short incubation in digitonin containing buffer. Cells are then washed and incubated with a primary antibody (coupled to a fluorophore of choice) directed against the bacterium of choice (e.g. anti-Salmonella-FITC) and washed again. If unmarked bacteria are used, an additional step can be done, in which all membranes are permeabilized and all bacteria stained with a corresponding antibody. Following the staining, the percentage of vacuolar and cytosolic bacteria can be quantified by FACS or microscopy by counting single or double-positive events. Here we provide experimental details for use of this technique with the bacterium Salmonella typhimurium. The advantage of this assay is that, in contrast to other assay, it provides a quantification on the level of single bacteria, and if analyzed by microscopy provides the exact number of cytosolic and vacuolar bacteria in a given cell.

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

We describe the quantification of cytosolic and vacuolar Salmonella typhimurium in bone-marrow derived macrophages using differential digitonin permeabilization.

공포 성 대 세포질의 정량화<em&gt; 살모넬라</em&gt; 차동 투과성으로하여 기본 대 식세포에서

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal disease. Macrophages are heterogeneous cells that have been implicated in kidney injury. Macrophages may be classified into two different phenotypes: classically activated macrophages (M1 macrophages), that release pro-inflammatory cytokines and promote fibrosis; and alternatively activated macrophages (M2 macrophages) that are associated with immunoregulatory and tissue-remodeling functions. These macrophage phenotypes need to be discriminated and analyzed to determine their contribution to renal injury. However, there are scarce studies reporting consistent phenotypic and functional information about macrophage subtypes in inflammatory renal disease models, especially in rats. This fact may be related to the limited macrophage markers used in rats, contrary to mice. Therefore, novel strategies are necessary to quantify and characterize the renal content of these infiltrating cells in a reliable way. This manuscript details a protocol for kidney digestion and further phenotypic and quantitative analysis of macrophages from rat kidneys by flow cytometry. Briefly, kidneys were incubated with collagenase and total macrophages were identified according to the dual presence of CD45 (leukocytes common antigen) and CD68 (PAN macrophage marker) in live cells.This was followed by surface staining of CD86 (M1 marker) and CD163 (M2 marker). Rat peritoneal macrophages were used as positive control for macrophage marker detection by flow cytometry. Our protocol resulted in low cellular mortality and allowed characterization of different intracellular and surface protein markers, thus limiting the loss of cellular integrity observed in other protocols. Moreover, this procedure allows the use of macrophages for further techniques, including cell sorting and mRNA or protein expression studies, among others.

This manuscript describes a detailed protocol for phenotypic and quantitative analysis of resident macrophages from rat kidneys by flow cytometry. The resulting stained cells can be also used for other applications, including cell sorting, gene expression analysis or functional studies, thus increasing the information obtained in the experimental model.

유동 세포 계측법에 의해 쥐의 신장에서 대 식세포의 표현형 특성

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or directly into another cell, Gram-negative bacteria can also form outer membrane vesicles (OMVs). These membrane vesicles can deliver their cargo over long distances, and the cargo is protected from degradation by proteases and nucleases. 
Legionella pneumophila (L. pneumophila) is an intracellular, Gram-negative pathogen that causes a severe form of pneumonia. In humans, it infects alveolar macrophages, where it blocks lysosomal degradation and forms a specialized replication vacuole. Moreover, L. pneumophila produces OMVs under various growth conditions. To understand the role of OMVs in the infection process of human macrophages, we set up a protocol to purify bacterial membrane vesicles from liquid culture. The method is based on differential ultracentrifugation. The enriched OMVs were subsequently analyzed with regard to their protein and lipopolysaccharide (LPS) amount and were then used for the treatment of a human monocytic cell line or murine bone marrow-derived macrophages. The pro-inflammatory responses of those cells were analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay. Furthermore, alterations in a subsequent infection were analyzed. To this end, the bacterial replication of L. pneumophila in macrophages was studied by colony-forming unit assays. 
Here, we describe a detailed protocol for the purification of L. pneumophila OMVs from liquid culture by ultracentrifugation and for the downstream analysis of their pro-inflammatory potential on macrophages.

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Here, we describe the purification of Legionella pneumophila (L. pneumophila) outer membrane vesicles (OMVs) from liquid cultures. These purified vesicles are then used for the treatment of macrophages to analyze their pro-inflammatory potential.

레지오넬라 뉴모 필라 외부 막 소포 : 분리 및 대 식세포에 그들의 프로 - 염증 가능성 분석

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. Diet-induced obesity (DIO) is a valuable model in studying the role of macrophage heterogeneity; however, adequate macrophage isolations are difficult to acquire from inflamed tissues. In this protocol, we outline the isolation steps and necessary troubleshooting guidelines derived from our studies for obtaining a suitable population of tissue-resident macrophages from mice following 18 weeks of high-fat (HFD) or high-fat/high-cholesterol (HFHCD) diet intervention. This protocol focuses on three hallmark tissues studied in obesity and atherosclerosis including the liver, white adipose tissues (WAT), and the aorta. We highlight how dualistic usage of flow cytometry can achieve a new dimension of isolation and characterization of tissue-resident macrophages. A fundamental section of this protocol addresses the intricacies underlying tissue-specific enzymatic digestions and macrophage isolation, and subsequent cell-surface antibody staining for flow cytometric analysis. This protocol addresses existing complexities underlying fluorescent-activated cell sorting (FACS) and presents clarifications to these complexities so as to obtain broad range characterization from adequately sorted cell populations. Alternate enrichment methods are included for sorting cells, such as the dense liver, allowing for flexibility and time management when working with FACS. In brief, this protocol aids the researcher to evaluate macrophage heterogeneity from a multitude of inflamed tissues in a given study and provides insightful troubleshooting tips that have been successful for favorable cellular isolation and characterization of immune cells in DIO-mediated inflammation.

This protocol allows a researcher to isolate and characterize tissue-resident macrophages in various hallmark inflamed tissues extracted from diet-induced models of metabolic disorders.

절연, 특성화 및 비만 관련 염증에 의해 영향을 받는 조직에서 세포의 정화

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

고립과 Murine 인간과 치경 대 식 세포의 생체 외에서 문화

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Chronic Salmonella Infection Induced Intestinal Fibrosis

Tissue fibrosis characterized by the pathological accumulation of extracellular matrix such as collagen is the outcome of persistent inflammation and dysregulated repair. In inflammatory bowel disease (IBD), fibrosis leads to recurrent stricture formations for which there is no effective therapy other than surgical resection. Due to its late onset, the processes that drive fibrosis is less studied and largely unknown. Therefore, fibrotic complications represent a major challenge in IBD. In this protocol, a robust in vivo model of intestinal fibrosis is described where streptomycin pre-treatment of C57Bl/6 mice followed by oral gavage with vaccine grade Salmonella Typhimurium &#916;AroA mutant leads to persistent pathogen colonization and fibrosis of the cecum. Methodologies for preparing S. Typhimurium &#916;AroA for inoculation, quantifying pathogen loads in the cecum and spleen, and evaluating collagen deposition in intestinal tissues are explained. This experimental disease model is useful for examining host factors that either enhance or exacerbate CD-like intestinal fibrosis.

This protocol describes a mouse model of Salmonella driven intestinal fibrosis that resembles key pathological hallmarks of Crohn&#8217;s disease including transmural inflammation and fibrosis. This method can be used to evaluate host factors that alter fibrotic outcomes using mutant mice maintained on a C57Bl/6 genetic background.

만성 살모넬라 감염 유도 장 섬유증

Tissue fibrosis characterized by the pathological accumulation of extracellular matrix such as collagen is the outcome of persistent inflammation and ...

Production and Characterization of Human Macrophages from Pluripotent Stem Cells

Macrophages are present in most vertebrate tissues and comprise widely dispersed and heterogeneous cell populations with different functions. They are key players in health and disease, acting as phagocytes during immune defense and mediating trophic, maintenance, and repair functions. Although it has been possible to study some of the molecular processes involved in human macrophage function, it has proved difficult to apply genetic engineering techniques to primary human macrophages. This has significantly hampered our ability to interrogate the complex genetic pathways involved in macrophage biology and to generate models for specific disease states. An off-the-shelf source of human macrophages that is amenable to the vast arsenal of genetic manipulation techniques would, therefore, provide a valuable tool in this field. We present an optimized protocol that allows for the generation of macrophages from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) in vitro. These iPSC-derived macrophages (iPSC-DMs) express human macrophage cell surface markers, including CD45, 25F9, CD163, and CD169, and our live-cell imaging functional assay demonstrates that they exhibit robust phagocytic activity. Cultured iPSC-DMs can be activated to different&#160;macrophage states that display altered gene expression and phagocytic activity by the addition of LPS and IFNg, IL4, or IL10. Thus, this system provides a platform to generate human macrophages carrying genetic alterations that model specific human disease and a source of cells for drug screening or cell therapy to treat these diseases.

This protocol describes the robust generation of macrophages from human induced pluripotent stem cells, and methods for their subsequent characterization. Cell surface marker expression, gene expression, and functional assays are used to assess the phenotype and function of these iPSC-derived macrophages.

다능성 줄기 세포에서 인간 대식세포의 생산 및 특성화

Macrophages are present in most vertebrate tissues and comprise widely dispersed and heterogeneous cell populations with different functions. They are key ...