이 작품은 NIH에서 교부금에 의해 지원되었습니다 R03 DK089061-01 (VKY), NIH : K08 DK068391 (VKY), 당뇨병과 내분비학 연구 센터 - (DERC - P30DK079638) 의학 베일러 대학에서 파일럿 및 타당성 부여 DERC (VKY), 아동 당뇨병 연구 재단 : JDRF 상 # 5-2006-134 (VKY).

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	<li>Parks, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+helper-dependent+adenovirus+vector+system:+removal+of+helper+virus+by+Cre-mediated+excision+of+the+viral+packaging+signal.">A helper-dependent adenovirus vector system: removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 13565-13570 (1996).</li><li>Kim, I. H., Jozkowicz, A., Piedra, P. A., Oka, K., Chan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifetime+correction+of+genetic+deficiency+in+mice+with+a+single+injection+of+helper-dependent+adenoviral+vector.">Lifetime correction of genetic deficiency in mice with a single injection of helper-dependent adenoviral vector.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 13282-13287 (2001).</li><li>Belalcazar, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+stable+expression+of+human+apolipoprotein+A-I+mediated+by+helper-dependent+adenovirus+gene+transfer+inhibits+atherosclerosis+progression+and+remodels+atherosclerotic+plaques+in+a+mouse+model+of+familial+hypercholesterolemia.">Long-term stable expression of human apolipoprotein A-I mediated by helper-dependent adenovirus gene transfer inhibits atherosclerosis progression and remodels atherosclerotic plaques in a mouse model of familial hypercholesterolemia.</a> Circulation. 107, 2726-2732 (2003).</li><li>Oka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+stable+correction+of+low-density+lipoprotein+receptor-deficient+mice+with+a+helper-dependent+adenoviral+vector+expressing+the+very+low-density+lipoprotein+receptor.">Long-term stable correction of low-density lipoprotein receptor-deficient mice with a helper-dependent adenoviral vector expressing the very low-density lipoprotein receptor.</a> Circulation. 103, 1274-1281 (2001).</li><li>Nomura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-density+lipoprotein+receptor+gene+therapy+using+helper-dependent+adenovirus+produces+long-term+protection+against+atherosclerosis+in+a+mouse+model+of+familial+hypercholesterolemia.">Low-density lipoprotein receptor gene therapy using helper-dependent adenovirus produces long-term protection against atherosclerosis in a mouse model of familial hypercholesterolemia.</a> Gene Ther. 11, 1540-1548 (2004).</li><li>Ng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-efficiency+Cre/loxP-based+system+for+construction+of+adenoviral+vectors.">A high-efficiency Cre/loxP-based system for construction of adenoviral vectors.</a> Hum. Gene Ther. 10, 2667-2672 (1999).</li><li>Palmer, D., Ng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+system+for+helper-dependent+adenoviral+vector+production.">Improved system for helper-dependent adenoviral vector production.</a> Mol. Ther. 8, 846-852 (2003).</li><li>Oka, K., Chan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helper-Dependent+Adenoviral+Vectors.">Helper-Dependent Adenoviral Vectors.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , 16.24.1-16.24.23 (2005).</li><li>Yechoor, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenin3+is+sufficient+for+transdetermination+of+hepatic+progenitor+cells+into+neo-islets+in+vivo+but+not+transdifferentiation+of+hepatocytes.">Neurogenin3 is sufficient for transdetermination of hepatic progenitor cells into neo-islets in vivo but not transdifferentiation of hepatocytes.</a> Dev. Cell. 16, 358-373 (2009).</li><li>Yechoor, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Therapy+with+Neurogenin+3+and+Betacellulin+Reverses+Major+Metabolic+Problems+in+Insulin-Deficient+Diabetic+Mice.">Gene Therapy with Neurogenin 3 and Betacellulin Reverses Major Metabolic Problems in Insulin-Deficient Diabetic Mice.</a> Endocrinology. , (2009).</li></ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

HDAds는 초기 세대 광고의 약점을 극복하고 유전자 치료 응용 프로그램에 대한 활용하기 위해 개발되었습니다. 그러나, 기술적 인 문제가 남아 있습니다. 예를 들어, HDAd는 HDAd의 포장 및 벡터 증폭을위한 HV는 초기 세대 광고만큼 효율적이지 않습니다 필요합니다. HV는 1 세대 광고 및 HV 타협 HDAd의 효과의 오염입니다. 따라서, 고효율 transfection 각 직렬 통과에 대한 최적의 조건 중요합니다. 벡터 생산을위한 또 다른 중요한 매개 변수는 직접 정지 전지 inoculum로 사용됩니다 이후의 통로 5 사용되어야하는 통로 (P1-P4)입니다. 우리의 경험으로, 가장 좋은 결과는 HDAd 벡터 비율은 크게 다음과 같은 통로 (그림 2의 P3)에 증가되는이 통로를 사용하여 얻을 수 있습니다. HDAd 벡터의 수율은 transgene 카세트에 따라 달라집니다. 두 유전자가 아래에 있기 때문에 벡터 생산하는 동안 두 transgenes이 표현됩니다유비쿼터스 발기인. Ngn3는 전사 인자이며, Btc는 표현 성장 호르몬은 벡터 복제 및 포장에 도움이 동안 세포 계보 (Lineage)는 벡터 증폭을 억제 영향을 미칠 수 있다는 HDAd 벡터 표현 전사 인자를 제안 성장 인자입니다. 당뇨병은 전염병 비율을 가정으로, B-세포 질량을 복원 할 수있는 새로운 접근 방법이 필요합니다. 이 보고서에서, 우리는 작은 섬 성장 인자와 함께 작은 섬 계보 (Lineage) - 정의 전사 인자, Ngn3의 유전자 전달에 영향을 미치도록 HDAd 벡터의 장점을 활용하는 방법을 설명, betacellulin은 간 periportal 지역에서 작은 섬의 neogenesis를 유도합니다. 이 효능을 평가하기 위해, 그것은 안정 고혈당증있는 마우스를 선택하고 적절한 컨트롤이 항상 포함되어 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 이 유전자 전송 실험 빈 벡터는 당뇨병 마우스는 항상 활용해야 처리. 또한, HDAd - Ngn3 및 HDAd-Btc를 사용하여 개별적으로 당뇨병 MI에게 치료를CE는 작은 섬 neogenesis에서이 두 유전자의 개별 기여를 테스트하는 역할을한다. 우리의 데이터는 혼자 Ngn3이 작은 섬 neogenesis를 유도하기에 충분하지만, 성장 인자, Btc의 추가는 작은 섬 neogenesis의 강력한 유도로 이어지는 응답을 증가하는 역할을 증명 있습니다. 이 벡터 표현은 실제로 대상 조직, 간에서 달성하고 있으며, 치료를 생쥐의 플라즈마에서 assayed 인슐린은 췌장의 부재를 보여주는하여 췌장의 잔류 섬에서 오는되지 않습니다 있다는 것을 입증하는 것을 테스트하는 것도 중요합니다 당뇨병 쥐 섬. 요약하면, 유전자 전송에 대한 HDAd - 벡터 시스템의 장점은 호스트에 최소 만성 독성뿐만 아니라 벡터 게놈의 비 통합의 자연과 간에서 높은 복제 능력, 효율적인 전달과 긴 지속적인 유전자 발현에 있습니다 염색체. 기본 제한은 세대와 관련된 복잡한 단계의생체 응용 프로그램에서 주로 가장 인기있는 광고 혈청 형 5 간으로 제한됩니다. 작은 섬 neogenesis 완전히 작은 섬 성장 인자, betacellulin과 함께 작은 섬 계보 (Lineage) - 정의 전사 인자, Ngn3의 유전자 전달에 의해 간에서 췌장의 neogenesis을 유도하여 플라즈마 인슐린과 당뇨병 쥐에서 포도당 내성을 복원하도록 유도 할 수 있습니다. 이 보고서에서, 우리는 고품질 HDAd - Ngn3 및 HDAd-Btc를 생성하는 최적의 프로토콜을 표시하고, 고혈당증을 반대로 당뇨병 생쥐의 간에서 작은 섬 neogenesis를 유도하고 평가하는 기술을 보여줍니다. 각주 : 바이러스 성 벡터와 세포 라인이 여기서 설명은 벡터 생산 핵심 연구소, 당뇨병 연구 센터, 의학 베일러 대학 (에서 구입하실 수 있습니다 <a href="http://www.bcm.edu/mcb/index.cfm?pmid=7731" target="_blank">http://www.bcm.edu/mcb/index.cfm?pmid=7731</a> ). 일부 상용 키트 HDAd 바이러스 (예를 들면 Microbix biosyst 생성하기 위해 또한 이용 가능합니다EMS 주식회사).

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> ProFectionR 포유류의 Transfection 키트 </td><td> Promega </td><td> E1200 </td></tr><tr><td> DNeasy 혈액 및 조직 키트 (50) </td><td> Qiagen </td><td> 69,504 </td></tr><tr><td> PerfeCTa SYBR 그린 SuperMix, ROX </td><td> 콴타 Biosciences </td><td> 95055-500 </td></tr><tr><td> 나트륨 deoxycholate </td><td> 시그마 </td><td> D6750-25g까지 </td></tr><tr><td> 가상 분말 </td><td> Invitrogen </td><td> 61100087 </td></tr><tr><td> 페니실린의 스트렙토 마이신 </td><td> 시그마 </td><td> 15140122 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 애틀랜타 체액 </td><td> S11150 </td></tr><tr><td> L-글루타민 </td><td> Invitrogen </td><td> 25030-081 </td></tr><tr><td> Hygromycin B </td><td> 시그마 </td><td> H0654-1G </td></tr><tR&gt; <td> 가상 EAGLE JOKLIK </td><td> 시그마 </td><td> M0518-10L </td></tr><tr><td> Rnase </td><td> 로슈 </td><td> 10109169001 </td></tr><tr><td> DNase I, 등급 II </td><td> 로슈 </td><td> 10104159001 </td></tr><tr><td> Streptozocin </td><td> 시그마 </td><td> s0130 </td></tr><tr><td> 유리 스피너 플라스크 </td><td> 코닝 </td><td> 4500-3L </td></tr><tr><td> 유리 스피너 플라스크 </td><td> 코닝 </td><td> 4500-250 </td></tr><tr><td> A-lyzer casset 슬라이드 </td><td> 붙여 CH </td><td> PI66380 </td></tr><tr><td> 튜브 optiseal 폴리 allomer, 11.2 ML </td><td> Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날 </td><td> 362181 </td></tr><tr><td> 세슘 염화 1kg </td><td> JT4042-2 </td><td> VWR </td></tr><tr><td> Beckman LE-80K </td><td> Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날 </td><td> 최적의 LE-80K ultracentrifuge </td></tr><tr><td> 필터 </td><td> VWR </td><td> 28143-338 </td></tr><tr><td> 관 500m를 원심 분리기리터 </td><td> 코닝 </td><td> 431123 </td></tr><tr><td> tailveiner restrainer </td><td> Braintree 과학, INC </td><td> TV-150 </td></tr><tr><td> 인슐린, 마우스 엘리사 </td><td> Mercodia </td><td> 10-1247-01 </td></tr><tr><td> microvette CB300 </td><td> Sarstedt </td><td> 16.443.100 </td></tr><tr><td> D-글루코오스 </td><td> 시그마 </td><td> G8270 </td></tr><tr><td> 마우스 C-펩타이드 엘리사 키트 </td><td> 와코 순수 화학 산업 (주) </td><td> # 631-07231 </td></tr><tr><td> 기니 돼지 방지 인슐린 항체 </td><td> Abcam </td><td> ab7842 </td></tr><tr><td> 염소 안티 - Pdx1 항체 </td><td> 박사 크리스토퍼 라이트 선물 </td><td></td></tr><tr><td> 마우스 방지 Ngn3 항체 </td><td> 베타 세포 생물학 컨소시엄, 대학. 펜실베니아 </td><td> AB2013 </td></tr><tr><td> 마우스 방지 Nkx6.1 항체 </td><td> 베타 세포 생물학 컨소시엄, 대학. Pennsy의lvania </td><td> F64A6B4 </td></tr><tr><td> 안티 betacellulin 항체 </td><td> 세포 과학 </td><td> PAAQ1 </td></tr><tr><td> ALT (SGPT) 컬러 시약 SET. </td><td> Teco 진단 </td><td> A526 - 120 </td></tr><tr><td> 대서양 표준시 / (SGOT), 색상 엔드 포인트 시약 세트 </td><td> Teco 진단 </td><td> A561-120 </td></tr></tbody></table> 표 2. 특정 시약 및 장비.

neo-islet formation in liver of diabetic mice by helper-dependent adenoviral vector-mediated gene transfer

1 형 당뇨병은 췌장의 인슐린 생산 세포의 T 세포 매개 면역 파괴에 의해 발생합니다. 작은 섬 이식은 기증자의 가용성에 의해 및 장기 immunosuppression의 필요성에 의해 제한 되었기 때문에 지금까지 인슐린 대체 여전히 주요 치료입니다. Neuogenin3의 유전자 전송 (Ngn3), 작은 섬 계보 (Lineage) - 정의 특정 전사 인자와 Betacellulin (Btc)에 의해 유도 작은 섬 neogenesis는 작은 섬 성장 인자는 제 1 형 당뇨병을 치료 할 수있는 가능성이 있습니다. Adenoviral 벡터 (광고) 고효율 유전자 전달 벡터이다;하지만, 초기 세대 광고 생체 사용하는 몇 가지 단점이 있습니다. 도우미에 의존 광고 (HDAds) 광고의 조기 세대의 안전 프로필을 향상시키고 transgene 표현 한을 연장하기 위해 개발 된 가장 진보 된 광고입니다. 그들은 바이러스 코딩 시퀀스에게 2-5 부족하며 광고 CIS 엘을 유지하기 때문에 만성 독성이 부족벡터 복제 및 포장에 필요한 ements. 이 36 이하 유전자까지의 복제를 할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 HDAd - Ngn3 및 HDAd-Btc를 생성하고 STZ 유발 당뇨병 마우스에이 벡터를 제공하는 방법을 설명합니다. 우리의 결과는 HDAd-Ngn3, 간에서 HDAd - Btc 유도 &#39;네오 섬&#39;의 공동 주입하고하면 당뇨병 생쥐에서 고혈당증을 반대로 것을 보여줍니다.

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Neo-Islet Formation in Liver of Diabetic Mice by Helper-dependent Adenoviral Vector-Mediated Gene Transfer

우리는 간장 네오 작은 섬 STZ의 형성 (streptozotocin) 유도 도우미에 의존 adenoviral 벡터 (HDAd)과 고혈당증의 반전을 사용하여 유전자 Neurogenin3의 전송 (Ngn3)와 Betacellulin (Btc)에 의해 당뇨병 쥐를.을 설명 우리의 방법은 생체 전달하고 오래 지속 유전자 발현에서의 고효율과 도우미에 의존 adenoviral 벡터의 장점이 소요됩니다.

도우미에 의존 Adenoviral 벡터로 인한 유전자의 전송에 의한 당뇨 쥐의 간에서 네오 - 작은 섬 형성

Type 1 diabetes is caused by T cell-mediated autoimmune destruction of insulin-producing cells in the pancreas. Until now insulin replacement is still the ...

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11.7K 조회수.  Baylor College of Medicine. 우리는 간장 네오 작은 섬 STZ의 형성 (streptozotocin) 유도 도우미에 의존 adenoviral 벡터 (HDAd)과 고혈당증의 반전을 사용하여 유전자 Neurogenin3의 전송 (Ngn3)와 Betacellulin (Btc)에 의해 당뇨병 쥐를.을 설명 우리의 방법은 생체 전달하고 오래 지속 유전자 발현에서의 고효율과 도우미에 의존 adenoviral 벡터의 장점이 소요됩니다.