이 작품은 폴 D. Wellstone 협동 연구 센터 (AR052646)에 의해 지원되었다.

모든 절차는 펜실베니아 IACUC 대학에 의해 검토 및 승인되었습니다. 1. 편집 판단리스트 해부 및 준비 (약 30 분) <ol><li> 그 절차 기간 동안 통증이나 고통을 경험하지 않도록하기 위해 마우스를 마취 만 잘 순환하여 근육 유지 산소. 우리는 정기적으로 IP를 통해 주입 케타민 / xylazine 칵테일 (10분의 100 밀리그램 / kg)을 사용합니다. 마취의 수술 비행기가 페달 또는 palpedral 탈퇴 반사, 또는 귀 트 응답의 부족의 완전한 부재에 의해 결정됩니다. </li><li> 의료 테이프를 사용하여 hindlimbs을 고정,이 지역의 근육을 노출 할 수있는 낮은 앞 hindlimb의 피부를 제거합니다. 정기적으로 PBS의 응용 프로그램과 함께 근육이 촉촉하세요. </li><li> 박리 범위에서 편집 판단리스트 근육의 근위 힘줄을 노출하기 위해 무릎에 옆 작은 절개를합니다. 가이 지역에 두 개의 힘줄이 있는데, 모두 재를 사용하도록 절단해야편집 판단리스트의 moval. </li><li> 안쪽 발목에서 메타 tarsals 따라 연장 편집 판단리스트의 말초 힘줄을 노출 TA 근육의 힘줄을 잘라. 편집 판단리스트 아래에를 잘라내거나 만지지 않도록주의하는 것 방법 TA 근육을 들어 봐요. , 편집 판단리스트의 말초 힘줄로 돌아 가기 싹둑 각각 다음 힘줄을 쥐었고, 발목을 통해 그려, 부드럽게 다리의 나머지 부분에서 떨어져 편집 판단리스트를 당깁니다. 그것은 자유롭게 근위 끝에서 출시하지만,하지 않을 경우, 힘줄이 절단되도록 옆 절개로 돌아합니다. 차가운 산소를 Ringers로 가득 해부 접시에있는 근육과 장소를 제거합니다. 생체에서 발견 된 길이는 약 휴식 길이의 힘줄을 통해 근육을 핀. 근육이 해부 핀을 당기는 경우 길이는 근육이 접시에 이완 할 때 너무 짧습니다, 그리고 너무 깁니다. </li><li> 자궁 경부 전위에 의한 근육 제거 후 즉시 마우스를 안락사시켜야. </li><li> 10에 봉합을 묶을가까이 가능한 한 근육에, 그러나 근육을 터치하지 dons. 봉합을 사용하여 약 휴식 기간에 근육을 핀. </li></ol> 2. 격막 해부 및 준비 (약 30 분) <ol><li> 같은 마우스가 모두 dissections를 받게되는 경우, 마취하에 자궁 경부 전위에 의해 이전 절차에 마우스를 안락사시켜야하거나, CO 2에 의해 자궁 경부의 전위와 확인이 나타납니다. </li><li> 복부와 가슴 캐비티를 노출하기 위해 피부에 절개를합니다. 복강을 열고 그냥 갈비뼈 아래 몸을 벽에 상처를 냈어. 뼈 가위를 사용하고, 척추를 통해 격막 립 라인에 따라 전체 흉곽 주위에 잘라내 삽입, 그리고 컷 위에 시작합니다. 가로막 쉽게 제거 할 수 있도록 격막의 중심을 실행하는 혈관을 자른다. </li><li> 마우스에서 격막 및 산소를 Ringers로 가득 해부 접시에 장소를 제거합니다. 부드럽게 diap을 선동피를 씻어 할 수있는 요리에 hragm. 필요에 따라 새로 고침 솔루션을 Ringers. </li><li> 측면 hemidiaphragms의 중앙 부분에있는 섬유의 방향을 따라 중앙 힘줄에서 갈비뼈에 격막의 작은 스트립을 잘라. 스트립 폭 2~4mm 사이 여야합니다. 뼈 가위 사용하여 격막 스트립의 양쪽에 갈비뼈의 약 1~2mm의 오버행을두고, 스트립의 양쪽에 갈비뼈를 잘라. </li><li> 중앙 힘줄에 봉합을 묶어주세요. 옆으로 돌출 리브 엔드 각각 봉합을 묶어하고 큰 루프를 만들기 위해 함께 이것들을 묶어. </li><li> 두 스트립은 특정 다이어프램 (각 측면에서 하나)에서 얻을 수있다. </li></ol> 3. 기계 욕조에 장착 근육 <ol><li> 봉합을 잡고 한쪽 끝에서 강성 게시물에 근육을 첨부하려면 다음을 사용하고 다른 끝에서 힘 변환기에. </li><li> 근육이 이완 아니라, 긴장되지 않는지 확인의 길이를 조정합니다. 좋은 근사값은 휴식 musc입니다1.4에서와 같이 르 길이 - 1.5. </li><li> 목욕은 ° C 테스트에 대한 근육의 안정성을 연장 22에서 유지 산소를 Ringers 솔루션으로 가득해야합니다. 근육 온도 22 ° C.에 equilibrated하도록 근육 전에 기능 테스트이 욕조에서 5 분 휴식을 취한다 </li></ol> 4. Isometric 진통 <ol><li> Supramaximal 자극 조건을 설정합니다. 근육이 목욕탕에 배치 한 후 트를 생성하는 단일 0.5 밀리 초를 자극 펄스를 사용하며, 강제 출력을 모니터링 할 수 있습니다. 힘이 최대하지만 꾸준한 수준을 달성 할 때까지 점차적으로 현재 높일 수 있습니다. 나머지 실험이 수준보다 10 % 더 많은 전류 높입니다. </li><li> 최적의 길이를 설정합니다. 최대 힘을​​ 얻을 때까지 isometric 트의 stimulations를 사용하여 서서히 근육의 길이를 조정합니다. 각 수축 사이의 근육에게 ~ 10 초를 놓습니다. 트 팀은 최대 일 때 최적 근육의 길이 (L O)이 달성된다. 기록 근육 길이 (길이가 수십대 초반은 myotendinous 편집 판단리스트에 접합하고, 중앙 힘줄이 myotendinous 접합 및 버니어 캘리퍼스를 사용하여 늑골에 근육 삽입) 사이에 있습니다. </li><li> 최대 Isometric 파상풍의 힘. supramaximal 자극에서 0.5 밀리 초 펄스의 일련와 퓨전 주파수 (주파수 힘의 관계 (예 : 심판의 고원에서의 500 밀리 초 기간 동안 L O로 설정 근육을 자극 :. 8) 편집 판단리스트 근육의 대지는 일반적으로 120 Hz에서와, 100 Hz에서와 격막 근육에 달성했습니다. 모든 근육에 대한 자극을 관찰 사이의 5 분의 휴식 시간과 각각의 주파수에서 3 번을 자극한다. </li></ol> 5. 편심 진통 <ol><li> 근육이 isometric 및 편심 수축을 수행하는 사이 5 분 휴식 할 수 있습니다. </li><li> 최종 200 밀리 초를 자극에서 10 %의 L O 스트레치 (0.5 L O의 신축성 속도에 이어 최초의 500 밀리 초에 대한 isometrically 80 Hz에서 근육을 자극/ 초)입니다. </li><li> 편심 수축의 원하는 번호 사이에 5 분 쉼표로 자극 패턴을 반복합니다. </li><li> 스트레치 이전 기간의 각 수축에 힘을 측정합니다. 처음이자 마지막 수축 사이의 힘의 드롭을 계산합니다. </li></ol> 6. 장치에서 근육 제거 <ol><li> 변환기에서 근육의 부드러운 제거 할 수 있도록하고 게시하고 Ringers과 해부 접시에 돌아갑니다 근육 길이를 단축. </li><li> 근육에서 봉합을 제거합니다. </li><li> 편집 판단리스트 근육을 보려면 다음 (예 : 냉동, 고정 등) 이후에 처리하기 전에, 그것을 무게, 두 번 근육을 되리. 이것은 단면적, 그리고 특정 힘을 계산하는 것이 중요합니다. </li><li> 격막 근육의 경우 0.1 % procion 오렌지, 15-20 분을위한 멤브레인 impermeant의 염료에 몸을 담그고. 이 해부 손상의 색인을 제공 할 것입니다. </li><li> 거리에 뼈 삽입의 근육을 해부뿐만 아니라 센트역 학 힘줄. 이 근육의 정확한 무게를 제공 할 필요가 있습니다. 무게 및 이후 준비하기 전에 위의 점이 되리. </li><li> 단면적 (CSA)을 건너 계산 : CSA (mm 2) = 질량 (MG) ​​/ [(L O mm) * (L / L O) * (1.06 밀리그램 / mm 3)], L / L O는 섬유입니다 근육의 길이 비율 (편집 판단리스트에 0.45, 가로막을위한 1.0)에 5 1.06 근육의 밀도입니다. </li></ol>

<ol>
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B., Maguire, H. C., Panettieri, R. A., Petrof, B., Narusawa, M., Leferovich, J. M., Sladky, J. T., Kelly, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mdx+mouse+diaphragm+reproduces+the+degenerative+changes+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">The mdx mouse diaphragm reproduces the degenerative changes of Duchenne muscular dystrophy.</a> Nature. 352, 536-539 (1991).</li><li>Welch, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTC124+targets+genetic+disorders+caused+by+nonsense+mutations.">PTC124 targets genetic disorders caused by nonsense mutations.</a> Nature. 447 (7140), 87-91 (2007).</li></ol>

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편집 판단리스트와 격막 -이 문서의 목적은 쥐에서 두 개의 근육에 격리 된 근육 기능을 수행하기위한 지침을 제공하는 것입니다. 이러한 근육의 평가는 근육 질환에 대한 치료 후보가 도움 여부에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 두 근육의 경우 강력한 데이터를 취득의 주요 요소는 깨끗한 절개입니다. 따라서 연습하고 초기 절연 단계를 완성하면 기능 테스트에 이동하기 전에 필수적입니다. 또한, 일반 근육에 대한 기능 벤치 마크를 설정하면 이전 dystrophic 근육에 비교하는, 또는 트리트먼트를 사이에 중요합니다. 이 연구 결과는 실험을 수행하는 사람의 능력에 의해 이수 높은 다양성의 대상이 아니라는 것을 보장합니다. 막 impermeant의 염료의 사용은 염료는 대부분 손상된 섬유를 표시합니다 포함 된 솔루션의 모든 근육의 부화를 들어, 분해 준비를 최적화에 도움이 수 있으며, D의 인덱스로 제공 할 수issection 성공. 근육에 손상 섬유의 수를 최소화하면 측정을 최적화하는 데 도움이 될 것입니다. 해부에 의해 손상 섬유는 편심 수축에 의해 손상보다 훨씬 더 밝게을 형광 및 염색도 기계 과정에서 사용하는면, 하나는 손상의 두 가지 유형을 구별하기 염색의 강도를 사용할 수 있습니다. 격막 스트립의 해부는 거의 항상 섬유의 길이를 따라 절단하여 일부 불가피하게 파괴하게하기 때문에, 섬유 손상을 갖게됩니다. 염료 이해는 그 손상된 섬유에 강한이며, 이러한은 일반적으로 준비의 바깥 가장자리으로 제한됩니다. 평균적으로, 우리는 근육 스트립​​의 양쪽에 폭 ~ 3 섬유 (~ 120 μm)입니다 손상된 섬유의 밴드를 관찰합니다. 손상된 밴드 근육의 15 % 이상을 포함하는 경우, 데이터가 삭제됩니다. 다이어프램 준비는 기능 측정을위한 최적의 크기에 제약이 있습니다. 우리는 발견 한 그 D 조각중앙 힘줄이 넥타이가 한 지점에 불과하기 때문에 5mm보다 폭 아르 iaphragm은 자신에 접어 시작합니다. 에있는이 결과는 준비에서 특정 힘을 감소. 우리는 또한 절개하는 동안 손상 섬유의 숫자가 전체 섬유 번호의 큰 비율을 구성하기 때문에 좁은 스트립은 또한 우리가 믿고 낮은 특정 힘을 가지고 것으로 나타났습니다. 예를 들어, 각면에 0.1 mm가 손상되면, 그건 강제로 기여하지 않는 근육 준비의 5 % (2x0.1 mm / 4 밀리미터 스트립)입니다 반면 스트립는 단 1mm, 20 인 경우 근육 준비 %가 손상되었습니다. 따라서, 손상된 영역의 폭뿐만 아니라 전체 준비의 폭을 모두 제어 할 중요한 요소입니다. 최대 isometric 긴장 측정은 근육의 모든 근육 섬유가 자극해야합니다. 함수 장치의 구성 요소에 엄청난 변화가 있기 때문에, 이것은 각 세트에 대해 결정되어야한다까지. 예를 들어, 욕조 크기 또는 stimulator의 유형은 자극의 강도에 영향을 미칠 수 있습니다. 트의 자극은 supramaximal 자극 조건을 결정하는 합리적인 방법입니다. 이것은 특정 설치 및 근육에 설립되면, 후속 연구에 활용 될 수있다. 반면, 특정 근육의 최적 길이는 위에서 설명한 반복 프로세스를 사용하여 각 준비를 위해 측정해야합니다. 이것은 두께 얇은 필라멘트 중복 최적이고 최대 잠재적 인 힘을 창출 능력이 측정됩니다 보장합니다. 다른 절차는 근육 강선과 관련된 회절 패턴에 의존 할 수 있지만이 여기에 설명되지 않은 추가 장비가 필요합니다. 우리는 정기적으로이 분야의 다른 조사에 의해 사용이 매개 변수의 중간 범위에 속하는 500 밀리 초를 자극 기간을 사용합니다. 이 자궁이 수축하는 동안 근육의 일부 피로가 발생할 수 있지만, 이는 분명하다최대 힘 생산에 &quot;처지&quot;로, 그 자체가이 정보를 제공 할 수 있습니다. 예를 들어, 피로의 차이는 따라서 활성 자궁이 수축하는 동안 힘의 처지가 개선을위한 인덱스로 제공 할 수있는 그 대상 칼슘 처리를 포함한 요법의 다른 유형에 의해 달성 될 수있다. 또는 힘의 손실이 힘줄에 봉합이 충분히 빡빡하지 나타냅니다, 그리고 그들이 자궁이 수축하는 동안 미끄러지는 것을 수 있습니다. 근육은 목욕탕에서 제거해야하며이 경우 봉합이 다시 묶여해야합니다. 우리는 또한 준비의 안정성을 평가하는 데 도움이 3 파상풍의 수축, 일련의를 사용합니다. 다시 봉합 용지는 다시 봉합을 필요로 묶는, 수축 사이의 힘의 손실로 이어질 것입니다. 대형 근육은 또한 프로토콜 중 힘의 손실로 이어질있는 anoxic 코어를 생성 할 수 있습니다. 근육 크기가 분리 된 근육 기능 테스트를 수행하기위한 제한 요소입니다, 어디서 20 밀리그램보다 더 큰 질량과 편집 판단리스트 근육은 각 contrac과 힘을 잃게기, 욕조에 superfusion에서 지원 할 수 없습니다. 사람들이 목욕탕에서 장시간 생존을 할 수있을만큼 얇은 때문에 격막 스트립 같은 합병증으로 고통하지 않습니다. 다른 근육은 일반적으로 사용되는 soleus 근육을 포함한 절연 근육 기능에 대한 활용하지만, 여기에 설명 된 수는 없습니다. 동일한 절차의 많은 준비와 기능 테스트의 측면에서 soleus을 위해 채택 할 수 있습니다. 그러나, 주된 차이점은 자극 주파수에 있으며, 편심 수축에 대한 매개 변수입니다. 함수의 soleus를 사용 다른 두 근육의 것을을 보완, 그래서는 dystrophic 마우스에게 7 4 평가 &quot;표준 패키지&quot;의 일부로 간주해야합니다. 편심 수축은 수축 취약성의 색인을 제공하며,이 프로토콜을 사용하는 것이 중요합니다 그 wildtype 동물의 근육에 힘 겸손한 손실 및에 힘 상당한 손실 결과치료 dystrophic 근육 비교에 대한 다양한 동적 범위가되도록. 정상적인 근육에 힘 손실의 부족은 편심 수축이 너무 온화 것을 제안하고, 효과적이지 않을 테라피와 진정으로 도움이되어있는 사이에 구별하기에 충분한 수 없습니다. 그러나, 편심 수축을 받게 일반 근육의 힘 극적인 손실이 질병과 관련된 차이를 올리지 너무 큰 수 있습니다. 편집 판단리스트와 격막에 대한 프로토콜은 10 %의 길이 변화를 생산하기 위해 0.5 소호 / 초 신축성 속도를 사용합니다. 우리는 일반적으로 5 편심 수축, 정상적인 근육의 힘의 작은 손실 및 dystrophic 근육의 힘의 상당한 손실 결과를 수행합니다. 물론, 이러한 매개 변수 중 모든 병에 걸린하고 건강한 근육 사이의 차이뿐만 아니라, 돌연변이의 특정 유형의 영향에를 구별하기 위해 전체 길이의 변화, 신장의 속도, 또는 편심 수축의 수를 늘리기 위해 다양 할 수 있습니다 또는 treatment 하나는 공부하고 있습니다. 그 동안 정상과 병에 걸린 근육 사이에 현저한 차이가 있으므로 다음 트리트먼트 측면에서에 접근 할 수있는 황금 표준이 있습니다. 요약이 프로토콜은 isometric 및 편심 수축을 수행하기위한 지침을 수립하고, 운이 좋다면 당신 실험실에서이 기법을 설정할 때 방지하기 위해 잠재적 인 함정을 식별합니다.

근육 기능 측정은 근육 병리학뿐만 아니라이 조직의 생리를 근간 메커니즘의 결정에 대한 잠재적 인 치료의 평가에 기여합니다. 근육 질환의 경우, 마우스 모델의 사용은 잠재적 인 치료학의 설계 및 테스트에 그 지식을 확장하는 유전자형과 표현형 사이의 링크를 이해하는 중앙 구성 요소가 있습니다. 근육 dystrophies는 특히,이 에이전트를 평가하고 환자의 시련으로 이동하는 데 필요한 사전 임상 데이터를 설정하는 마우스에 의존하고 있습니다. 자주 결과 측정은 연구의 다양한 적용됩니다 강도를 측정하기 위해 절연 근육 기능을 사용합니다. 또 다른 조치가 편심, 또는 길이를 사용하는 것입니다, 수축이 Duchenne 근육질 영양 장애에 결함이 근육 막 무결성의 변화,이 질환 (MDX)의 마우스 모델을 결정합니다. 따라서 measurem 이러한 유형의에 필수적입니다엔트 민감하고 재현 할 수 있습니다. 마우스 신근 digitorum longus의 (편집 판단리스트) 근육이 균일 한 섬유 방향 및 최종 힘줄 2, 5, 6, 10, 12를 포함한 이상적인 형상과 크기로 인해 절연 근육 기능에 광범위하게 사용되었습니다. 편집 판단리스트 근육 isometric 기능 측정 방법은 치료 - NMD SOP 1 이전 주피터 간행물 8,뿐만 아니라에 설명되어 있습니다. 우리는 isometric와 편심 수축을 모두 포함하려면 다음 방법의 설명을 연장했다. 질병의 특징은 변성 / 재생 및 감소 힘 출력 heighted 사이클을 포함, 편집 판단리스트에 분명합니다. 마우스 다이어프램은 마우스 11의 다른 근육에 비해 근육 영양 장애의 가장 빠른 병적 진행을 전시하고 있습니다. 생후 6 개월 누적 섬유증은 근육의 약 50 %로 구성되어 있습니다. 크게 impaire이 결과D 강제로 출력 11. 따라서, fibrotic 침투를 방지 할 수 있습니다 치료 요원의 입장에서 효율적으로 평가 될 수있다. 근육의 dystrophin의 손실은 모든 근육이 9 증가 취약성과 상승 수축성 피해로 연결됩니다. Duchenne 근육질 영양 장애에 대한 따라서 많은 치료는 dystrophin 교체를 위해 준비되어 있습니다. 따라서 이러한 전략을 평가하는 중요한되고있다 분석 할뿐만 아니라 수축성 손상 2, 3, 4에서 dystrophic 근육을 보호하기위한 특정 전략을 한 혜택을할지 결정으로, 정상 및 dystrophic 근육을 구별 할 수 편심 수축,이 12. 이 절차는 / 레코드 길이와 힘, 또는 힘 변환기에서 빠르게 별도의 길이를 조정하는 방법을 조절 할 수 있습니다 중 듀얼 모드 서보 모터가 필요합니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 / 재료의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> 체외 근육 테스트 시스템에서 </td><td> 오로라 과학 </td><td> 1200A </td><td></td></tr><tr><td> 현미경을 해부 </td><td> Leica </td><td> MZ6 </td><td></td></tr><tr><td> ACE 광원 </td><td> SCHOTT-Fostec </td><td> A20500 </td><td></td></tr><tr><td> 해부 가위 </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 14060-11 </td><td></td></tr><tr><td> 각진 해부 가위 </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 15006-09 </td><td></td></tr><tr><td> 메스 핸들 </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 10003-12 </td><td> 대체 해부 도구 </td></tr><tr><td> 구부러진 메스 블레이드 # 12 </td><td> 정밀 과학도구 </td><td> 10012-00 </td><td> 대체 해부 도구 </td></tr><tr><td> 뼈 가위 </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 16044-10 </td><td></td></tr><tr><td> S &amp; T 봉합 매는 포셉 </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 00272-13 </td><td></td></tr><tr><td> 뒤몽 SS 포셉 - 각진 </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 11203-25 </td><td></td></tr><tr><td> 합 사형 실크 봉합 크기 6-0 </td><td> Teleflex 의료 </td><td> 07-30-10 </td><td></td></tr><tr><td> 의료 테이프 </td><td> Transpore </td><td> 3M </td><td></td></tr><tr><td> 케타민 염산염 100 MG / ML </td><td> Hospira </td><td> NDC 0409-2051-05 </td><td> 최종 투여 량은 80 밀리그램 / kg이다 </td></tr><tr><td> TranquiVed 사출 (xylazine 100 MG / ML) </td><td> Vedco </td><td> NDC 50989-234-11 </td><td> 최종 투여 량은 10 밀리그램 / kg이다 </td></tr><tr><td> 대응 오렌지 14 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> R-8254 </td><td></td></tr><tr><td> 솔루션 구성 요소를 Ringers </td><td></td><td></td><td> 솔루션는 95 % O 2 5 % CO 2, 최종 pH를 7.4로 equilibrated 가스입니다 </td></tr><tr><td> 나트륨 염화물 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> S7653 </td><td> 최종 농도 : 118 MM </td></tr><tr><td> 염화칼륨 </td><td> 피셔 과학 </td><td> P217-3 </td><td> 최종 농도 : 4.7 MM </td></tr><tr><td> 칼슘 염화물 이수화 </td><td> 피셔 과학 </td><td> C79-500 </td><td> 최종 농도 : 2.5 MM </td></tr><tr><td> 인산 칼륨 일 염기의 </td><td> 피셔 과학 </td><td> P-285 </td><td> 최종 농도 : 1.2 MM </td></tr><tr><td> 황산 마그네슘 </td><td> JT 베이커 </td><td> 2500-01 </td><td> 최종 농도 : 0.57 MM </td></tr><tr><td> 4 - (2 - 히드 록시 에틸) 파이프razine-1-ethanesulfonic 산 (HEPES) </td><td> 피셔 과학 </td><td> BP310-500 </td><td> 최종 농도 : 5.95 g ​​/ L </td></tr><tr><td> 포도당 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> G8270 </td><td> 최종 농도 : 5.5 MM </td></tr></tbody></table>

isometric and eccentric force generation assessment of skeletal muscles isolated from murine models of muscular dystrophies

근육 질환에 대한 잠재적 치료학의 평가에 중요한 근육 기능의 민감하고 재현 생리적 평가입니다. 많은 사전 임상 실험이 질환 마우스 모델에 의존하기 때문에, 절연 근육 기능은 환자에 앞으로 약물 후보를 이동에서 이동 / NoGo 결정을위한 기준의 하나가되었습니다. 우리는이 연구에 활용 지배적 인 근육 아르 기능 테스트를위한 신근 digitorum longus의 (편집 판단리스트)과 격막 근육의 준비를 보여줍니다. 편집 판단리스트 근육 구조는 두 쉽게 접근 할 수 힘줄 및 욕조에서 superfusion에서 지원 할 수있는 작은 크기로, 분리 된 근육 준비에 이상적입니다. 다이어프램은 dystrophic 동물에 깊은 진보적 인 병리학을 전시하고, 섬유증을 countering 많은 잠재적 인 치료를 평가하고, myofiber의 안정성을 홍보하기위한 플랫폼 역할을 할 수 있습니다. isometric와 eccen 등의 일상적인 테스트 프로토콜,tric 수축이 표시됩니다. Isometric 힘은 힘의 평가를 제공하며, 편심 수축이 근육 dystrophies 많은 종류의에서 중단되어 sarcolemma의 안정성을 평가하는 데 도움이됩니다. wildtype 및 dystrophic 근육에서 근육 사이의 예상 결과의 비교도 제공됩니다. 이러한 조치는 조직 항상성의 형태학 및 생화학 측정뿐만 아니라, 근육 기능의 전체 동물 평가를 보완 할 수 있습니다.

12주 오래된 동물 편집 판단리스트 근육의 isometric 세력에 대한 예상 값은 그림 1에 표시됩니다. MDX 근육 보상 비대를 전시하기 때문에, 총 파상풍의 힘은 나이와 일치하는 wildtype 컨트롤을 비교하여 MDX 근육의 상위가 될 수 있습니다. 그러나, 기능 출력의 더 적절한 조치는 힘이이 값을 계산 단면적에 대한 표준화되어 특정 힘 (그림 2)입니다. 특정 힘은 절대 힘과 단면적이 모두 차지 때 dystrophic 근육의 약점에 더 명백 근육의 고유 기능 용량에 따라 달라집니다. 손에서 MDX 마우스에서 편집 판단리스트 근육은 약 20를 생성 - 연령 26 주 - 10 일부터 wildtype 쥐를 일치 시대의 사람들보다 25 % 낮은 특정 힘을. 준비가 아까 그 바 말인데, 의존 근육의 한 부분이기 때문에 가로막를 들어, 특정 힘이 비교 관련ction. wildtype 및 MDX의 격막 근육 사이의 특정 힘의 비교는이 조직의 진보적 인 병리를 반영합니다. Isometric 강제 출력은 생후 6 개월, MDX 마우스의 격막 근육이 더 이상 연령 일치 wildtype 컨트롤을에서 격막 스트립의 기능 출력의 절반 이상을 생산하지 않도록, 나이 (그림 3)와 감소. 다이어프램 테스트에서 편심 수축의 예는 그림 4에 표시됩니다. 이후의 각 편심 수축을 통해 강제 출력 wildtype (C57) 및 MDX 마우스 모두에서 격막 스트립에 감소. 그러나, 힘의 손실이 dystrophin과 관련된 단백질의 부재에서 추측 컨데, MDX 마우스의 근육 샘플에 더 극적인입니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/50036/50036fig1.jpg" /> 그림 1. wildtype 및 MDX 편집 판단리스트 근육 F 조에서 Isometric 파상풍의 힘<html> ROM 12주 오래된 마우스. 절대 힘이 보상 비대로 인해 나이와 일치하는 MD​​X 편집 판단리스트 근육의 상위가 될 수 있습니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/50036/50036fig2.jpg" /> 근육 단면적에 의해 표준화 그림 2. Isometric 파상풍의 힘은 특정 힘이며, wildtype 마우스의 그에 비해 MDX 마우스에서 편집 판단리스트 근육의 우울 기능 용량을 드러내고있다. 흔적은 그림 1에서와 같이 동일한 쥐에서 있습니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/50036/50036fig3.jpg" /> 그림 3. 특정 힘에 의해 평가 힘 생성 능력의 진보적 인 손실은 (파란색 줄에 C57) wildtype에 비해 MDX 마우스 (적색 바)의 입장에서 가장 명백합니다. 36/50036fig4.jpg &quot;/&gt; 그림 4. 12 세 주 C57 및 MDX 마우스의 격막 근육을위한 편심 수축 번호의 함수로 힘의 손실. 데이터는 뜻 이죠 ± 유전자형 당 N에 대한 SEM은 = 4 근육.

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Isometric and Eccentric Force Generation Assessment of Skeletal Muscles Isolated from Murine Models of Muscular Dystrophies

근육 기능 측정은 근육 병리에 대한 잠재적 인 치료학의 평가뿐만 아니라,이 조직의 생리를 근간 메커니즘의 결정에에 기여합니다. 우리는 기능 테스트를위한 신근 digitorum longus의와 격막 근육의 준비를 보여줍니다. isometric 및 편심 수축을위한 프로토콜은 병적 인 상태를 나타내는 dystrophic 근육 사이에 결과의 차이, 그리고 wildtype 근육뿐만 아니라 표시됩니다.

골격 근육의 Isometric 나기도하고 강제로 생성 평가는 절연 근육질 Dystrophies의 손쥐 모델에서

Critical to the evaluation of potential  therapeutics for muscular disease are sensitive and reproducible physiological  assessments of muscle function. ...

isometric-eccentric-force-generation-assessment-skeletal-muscles

Research

JoVE Journal

Biology

32.5K 조회수.  School of Dental Medicine, University of Pennsylvania. 근육 기능 측정은 근육 병리에 대한 잠재적 인 치료학의 평가뿐만 아니라,이 조직의 생리를 근간 메커니즘의 결정에에 기여합니다. 우리는 기능 테스트를위한 신근 digitorum longus의와 격막 근육의 준비를 보여줍니다. isometric 및 편심 수축을위한 프로토콜은 병적 인 상태를 나타내는 dystrophic 근육 사이에 결과의 차이, 그리고 wildtype 근육뿐만 아니라 표시됩니다....

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DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant variants) in order to investigate their endogenous distribution and functional relevance. An interesting approach that has been implemented to fulfill this objective in fully differentiated cells is the in vivo transfection of plasmids by various methods into specific tissues such as liver1, skeletal muscle2,3, and even the brain4. We present here a detailed description of the steps that must be followed in order to efficiently transfect genetic material into fibers of the flexor digitorum brevis (FDB) and interosseus (IO) muscles of adult mice using an in vivo electroporation approach. The experimental parameters have been optimized so as to maximize the number of muscle fibers transfected while minimizing tissue damages that may impair the quality and quantity of the proteins expressed in individual fibers. We have verified that the implementation of the methodology described in this paper results in a high yield of soluble proteins, i.e. EGFP and ECFP3, calpain, FKBP12, &beta;2a-DHPR, etc. ; structural proteins, i.e. minidystrophin and &alpha;-actinin; and membrane proteins, i.e. &alpha;1s-DHPR, RyR1, cardiac Na/Ca2+ exchanger , NaV1.4 Na channel, SERCA1, etc., when applied to FDB, IO and other muscles of mice and rats. The efficient expression of some of these proteins has been verified with biochemical3 and functional evidence5. However, by far the most common confirmatory approach used by us are standard fluorescent microscopy and 2-photon laser scanning microscopy (TPLSM), which permit to identify not only the overall expression, but also the detailed intracellular localization, of fluorescently tagged protein constructs. The method could be equally used to transfect plasmids encoding for the expression of proteins of physiological relevance (as shown here), or for interference RNA (siRNA) aiming to suppress the expression of normally expressed proteins (not tested by us yet). It should be noted that the transfection of FDB and IO muscle fibers is particularly relevant for the investigation of mammalian muscle physiology since fibers enzymatically dissociated from these muscles are currently one of the most suitable models to investigate basic mechanisms of excitability and excitation-contraction coupling under current or voltage clamp conditions2,6-8.

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

We describe detailed procedures for the efficient transfection of plasmid DNA into the fibers of foot muscles of live mice using electroporation and the subsequent visualization of protein expression using fluorescence microscopy.

사용 포유류 골격 근육의 유전자 Transfection VIVO에서 Electroporation

 A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant ...

연구

생물학

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes. More than 700 human miRNAs have been identified so far with each having up to hundreds of unique target mRNAs. Computational tools, expression and proteomics assays, and chromatin-immunoprecipitation-based techniques provide important clues for identifying mRNAs that are direct targets of a particular miRNA. In addition, 3'UTR-reporter assays have become an important component of thorough miRNA target studies because they provide functional evidence for and quantitate the effects of specific miRNA-3'UTR interactions in a cell-based system. To enable more researchers to leverage 3'UTR-reporter assays and to support the scale-up of such assays to high-throughput levels, we have created a genome-wide collection of human 3'UTR luciferase reporters in the highly-optimized LightSwitch Luciferase Assay System. The system also includes synthetic miRNA target reporter constructs for use as positive controls, various endogenous 3'UTR reporter constructs, and a series of standardized experimental protocols.
Here we describe a method for co-transfection of individual 3'UTR-reporter constructs along with a miRNA mimic that is efficient, reproducible, and amenable to high-throughput analysis.

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3&#039;UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and have been shown to play a role in numerous biological processes. To better understand miRNA-UTR interactions, we have created a genome-wide collection of 3 UTR luciferase reporters paired with a novel luciferase gene and assay reagent, the LightSwitch system.

3&#39;UTR - 기자의 구성과 microRNA를 사용하여 LightSwitch의 루시페라제 분석 시스템과 인간 microRNAs의 확인 대상이 자기편 세포의 모방

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes.  More than 700 human miRNAs have been ...

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

The isolated microvessel preparation is an ex vivo preparation that allows for examination of the different contributions of factors that control vessel diameter, and thus, perfusion resistance1-5. This is a classic experimental preparation that was, in large measure, initially described by Uchida et al.15 several decades ago. This initial description provided the basis for the techniques that was extensively modified and enhanced, primarily in the laboratory of Dr. Brian Duling at the University of Virginia6-8, and we present a current approach in the following pages. This preparation will specifically refer to the gracilis arteriole in a rat as the microvessel of choice, but the basic preparation can readily be applied to vessels isolated from nearly any other tissue or organ across species9-13. Mechanical (i.e., dimensional) changes in the isolated microvessels can easily be evaluated in response to a broad array of physiological (e.g., hypoxia, intravascular pressure, or shear) or pharmacological challenges, and can provide insight into mechanistic elements comprising integrated responses in an intact, although ex vivo, tissue. The significance of this method is that it allows for facile manipulation of the influences on the integrated regulation of microvessel diameter, while also allowing for the control of many of the contributions from other sources, including intravascular pressure (myogenic), autonomic innervation, hemodynamic (e.g., shear stress), endothelial dependent or independent stimuli, hormonal, and parenchymal influences, to provide a partial list. Under appropriate experimental conditions and with appropriate goals, this can serve as an advantage over in vivo or in situ tissue/organ preparations, which do not readily allow for the facile control of broader systemic variables. 
The major limitation of this preparation is essentially the consequence of its strengths. By definition, the behavior of these vessels is being studied under conditions where many of the most significant contributors to the regulation of vascular resistance have been removed, including neural, humoral, metabolic, etc. As such, the investigator is cautioned to avoid over-interpretation and extrapolation of the data that are collected utilizing this preparation. The other significant area of concern with regard to this preparation is that it can be very easy to damage cellular components such as the endothelial lining or the vascular smooth muscle, such that variable source of error can be introduced. It is strongly recommended that the individual investigator utilize appropriate measurements to ensure the quality of the preparation, both at the initiation of the experiment and periodically throughout the course of a protocol.

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

An ex vivo preparation is described for isolation of the largest gracilis muscle resistance arterioles for interrogation of both vascular responses to vasoactive stimuli and the assessment of basic structural properties via passive wall mechanics.

예 생체내</em혈관 반응성 조사를위한> 절연 골격 Microvessel 준비

The isolated  microvessel preparation is an ex vivo preparation that allows for examination of the different contributions of  factors that control vessel ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, fatigability, and recovery after fatigue can be obtained to assess specific aspects of the excitation-contraction coupling (ECC) process such as excitability, contractile machinery and Ca2+ handling ability. This method removes the nerve and blood supply and focuses on the isolated skeletal muscle itself. We routinely use this method to identify genetic components that alter the contractile property of skeletal muscle though modulating Ca2+ signaling pathways. Here, we describe a newly identified skeletal muscle phenotype, i.e., mechanic alternans, as an example of the various and rich information that can be obtained using the in vitro muscle contractility assay. Combination of this assay with single cell assays, genetic approaches and biochemistry assays can provide important insights into the mechanisms of ECC in skeletal muscle.

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

We describe a method to directly measure muscle force, muscle power, contractile kinetics and fatigability of isolated skeletal muscles in an in vitro system using field stimulation. Valuable information on Ca2+ handling properties and contractile machinery of the muscle can be obtained using different stimulating protocols.

절연 골격근의 수축성, Fatigability 및 Alternans의 예 VIVO 평가

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in the striated muscle fibers that appear as highly localized Ca2+ release events mediated by ryanodine receptor (RyR) Ca2+ release channels on the sarcoplasmic reticulum (SR) membrane. Proper assessment of muscle Ca2+ sparks could provide information on the intracellular Ca2+&#160;handling properties of healthy and diseased striated muscles. Although Ca2+ sparks events are commonly seen in resting cardiomyocytes, they are rarely observed in resting skeletal muscle fibers; thus there is a need for methods to generate and analyze sparks in skeletal muscle fibers.
Detailed here is an experimental protocol for measuring Ca2+ sparks in isolated flexor digitorm brevis (FDB) muscle fibers using fluorescent Ca2+ indictors and laser scanning confocal microscopy. In this approach, isolated FDB fibers are exposed to transient hypoosmotic stress followed by a return to isotonic physiological solution. Under these conditions, a robust Ca2+ sparks response is detected adjacent to the sarcolemmal membrane in young healthy FDB muscle fibers. Altered Ca2+ sparks response is detected in dystrophic or aged skeletal muscle fibers. This approach has recently demonstrated that membrane-delimited signaling involving cross-talk between inositol (1,4,5)-triphosphate receptor (IP3R) and RyR contributes to Ca2+ spark activation in skeletal muscle. In summary, our studies using osmotic stress induced Ca2+ sparks showed that this intracellular response reflects a muscle signaling mechanism in physiology and aging/disease states, including mouse models of muscle dystrophy (mdx mice) or amyotrophic lateral sclerosis (ALS model).

Described here is a method to directly measure calcium sparks, the elementary units of Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum&#160;in intact skeletal muscle fibers. This method utilizes osmotic-stress-mediated triggering of Ca2+ release from ryanodine receptor in isolated muscle fibers. The dynamics and homeostatic capacity of intracellular Ca2+ signaling can be employed to assess muscle function in health and disease.

칼슘의 평가는 그대로 골격 근육 섬유에서 불꽃

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which requires specific protocols for tissue collection to obtain optimal results from functional, cellular, molecular, and pathological evaluations. Due to the subtlety of some pathological abnormalities seen in congenital muscle disorders and the potential for fixation to interfere with the recognition of these features, pathological evaluation of frozen muscle is preferable to fixed muscle when evaluating skeletal muscle for congenital muscle disease. Additionally, the potential to produce severe freezing artifacts in muscle requires specific precautions when freezing skeletal muscle for histological examination that are not commonly used when freezing other tissues. This manuscript describes a protocol for rapid freezing of skeletal muscle using isopentane (2-methylbutane) cooled with liquid nitrogen to preserve optimal skeletal muscle morphology. This procedure is also effective for freezing tissue intended for genetic or protein expression studies. Furthermore, we have integrated our freezing protocol into a broader procedure that also describes preferred methods for the short term triage of tissue for (1) single fiber functional studies and (2) myoblast cell culture, with a focus on the minimum effort necessary to collect tissue and transport it to specialized research or reference labs to complete these studies. Overall, this manuscript provides an outline of how fresh tissue can be effectively distributed for a variety of phenotypic studies and thereby provides standard operating procedures (SOPs) for pathological studies related to congenital muscle disease.

The analysis of skeletal muscle tissues to determine structural, functional, and biochemical properties is greatly facilitated by appropriate preparation. This protocol describes appropriate methods to prepare skeletal muscle tissue for a broad range of phenotyping studies.

조직의 우선 순위 구분과 골격근 질환 모델에 대한 동결

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which requires specific protocols for tissue collection to obtain optimal ...

Design and Development of Aptamer&#8211;Gold Nanoparticle Based Colorimetric Assays for In-the-field Applications

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field applications was examined. Target selective AuNP based color assays have been developed in controlled proof-of-concept laboratory settings. However, these schemes have not been exerted to a point of failure to determine their practical use beyond laboratory settings. This work describes a generic approach to design, develop, and troubleshoot an aptamer-AuNP colorimetric assay for small molecule analytes and using the assay for in-the-field settings. The assay is advantageous because adsorbed aptamers passivate the nanoparticle surfaces and provide a means to reduce and eliminate false positive responses to non-target analytes. Transitioning this system to practical uses required defining not only the shelf-life of the aptamer-AuNP assay, but establishing methods and procedures for extending the long-term storage capabilities. Also, one of the recognized concerns with colorimetric readout is the burden placed on analysts to accurately identify often subtle changes in color. To lessen the responsibility on analysts in the field, a color analysis protocol was designed to perform the color identification duties without the need for performing this task on laboratory grade equipment. The method for creating and testing the data analysis protocol is described. However to understand and influence the design of adsorbed aptamer assays, the interactions associated with the aptamer, target, and AuNPs require further study. The knowledge gained could lead to tailoring aptamers for improved functionality.

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field applications was examined. Additionally, a smart-device colorimetric application (app) was validated and long-term storage of the assay was established for use in the field.

인 - 더 - 필드 응용 프로그램에 대한 설계 및 앱 타머 - 금 나노 입자 기반 비색 분석법 개발

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field ...

Isolating Myofibrils from Skeletal Muscle Biopsies and Determining Contractile Function with a Nano-Newton Resolution Force Transducer

Striated muscle cells are indispensable for the activity of humans and animals. Single muscle fibers are comprised of myofibrils, which consist of serially linked sarcomeres, the smallest contractile units in muscle. Sarcomeric dysfunction contributes to muscle weakness in patients with mutations in genes encoding for sarcomeric proteins. The study of myofibril mechanics allows for the assessment of actin-myosin interactions without potential confounding effects of damaged, adjacent myofibrils when measuring the contractility of single muscle fibers. Ultrastructural damage and misalignment of myofibrils might contribute to impaired contractility. If structural damage is present in the myofibrils, they likely break during the isolation procedure or during the experiment. Furthermore, studies in myofibrils provide the assessment of actin-myosin interactions in the presence of the geometrical constraints of the sarcomeres. For instance, measurements in myofibrils can elucidate whether myofibrillar dysfunction is the primary effect of a mutation in a sarcomeric protein. In addition, perfusion with calcium solutions or compounds is almost instant due to the small diameter of the myofibril. This makes myofibrils eminently suitable to measure the rates of activation and relaxation during force production. The protocol described in this paper employs an optical force probe based on the principle of a Fabry-P&#233;rot interferometer capable of measuring forces in the nano-Newton range, coupled to a piezo length motor and a fast-step perfusion system. This setup enables the study of myofibril mechanics with high resolution force measurements.

Presented here is a protocol to assess the contractile properties of striated muscle myofibrils with nano-Newton resolution. The protocol employs a setup with an interferometry-based, optical force probe. This setup generates data with a high signal-to-noise ratio and enables the assessment of the contractile kinetics of myofibrils.

골격 근육 생검에서 Myofibrils를 분리하고 나노 뉴턴 해상도 포스 트랜스듀서로 수축 기능을 결정합니다.

Striated muscle cells are indispensable for the activity of humans and animals. Single muscle fibers are comprised of myofibrils, which consist of ...

Measurement of Insulin- and Contraction-Stimulated Glucose Uptake in Isolated and Incubated Mature Skeletal Muscle from Mice

Skeletal muscle is an insulin-responsive tissue and typically takes up most of the glucose that enters the blood after a meal. Moreover, it has been reported that skeletal muscle may increase the extraction of glucose from the blood by up to 50-fold during exercise compared to resting conditions. The increase in muscle glucose uptake during exercise and insulin stimulation is dependent on the translocation of glucose transporter 4 (GLUT4) from intracellular compartments to the muscle cell surface membrane, as well as phosphorylation of glucose to glucose-6-phosphate by hexokinase II. Isolation and incubation of mouse muscles such as m. soleus and m. extensor digitorum longus (EDL) is an appropriate ex vivo model to study the effects of insulin and electrically-induced contraction (a model for exercise) on glucose uptake in mature skeletal muscle. Thus, the ex vivo model permits evaluation of muscle insulin sensitivity and makes it possible to match muscle force production during contraction ensuring uniform recruitment of muscle fibers during measurements of muscle glucose uptake. Moreover, the described model is suitable for pharmacological compound testing that may have an impact on muscle insulin sensitivity or may be of help when trying to delineate the regulatory complexity of skeletal muscle glucose uptake.
Here we describe and provide a detailed protocol on how to measure insulin- and contraction-stimulated glucose uptake in isolated and incubated soleus and EDL muscle preparations from mice using radiolabeled [3H]2-deoxy-D-glucose and [14C]mannitol as an extracellular marker. This allows accurate assessment of glucose uptake in mature skeletal muscle in the absence of confounding factors that may interfere in the intact animal model. In addition, we provide information on metabolic viability of incubated mouse skeletal muscle suggesting that the method&#160;applied possesses some caveats under certain conditions when studying muscle energy metabolism.

Intact regulation of muscle glucose uptake is important for maintaining whole body glucose homeostasis. This protocol presents assessment of insulin- and contraction-stimulated glucose uptake in isolated and incubated mature skeletal muscle when delineating the impact of various physiological interventions on whole body glucose metabolism.

마우스로부터 단리되고 배양된 성숙한 골격근에서의 인슐린- 및 수축-자극된 글루코스 흡수의 측정

Skeletal muscle is an insulin-responsive tissue and typically takes up most of the glucose that enters the blood after a meal. Moreover, it has been ...

Generation of Murine Primary Colon Epithelial Monolayers from Intestinal Crypts

The intestinal epithelium is comprised of a single layer of cells that act as a barrier between the gut lumen and the interior of the body. Disruption in the continuity of this barrier can result in inflammatory disorders such as inflammatory bowel disease. One of the limitations in the study of intestinal epithelial biology has been the lack of primary cell culture models, which has obliged researchers to use model cell lines derived from carcinomas. The advent of three dimensional (3D) enteroids has given epithelial biologists a powerful tool to generate primary cell cultures, nevertheless, these structures are embedded in extracellular matrix and lack the maturity characteristic of differentiated intestinal epithelial cells. Several techniques to generate intestinal epithelial monolayers have been published, but most are derived from established 3D enteroids making the process laborious and expensive. Here we describe a protocol to generate primary epithelial colon monolayers directly from murine intestinal crypts. We also detail experimental approaches that can be used with this model such as the generation of confluent cultures on permeable filters, confluent monolayer for scratch wound healing studies and sparse and confluent monolayers for immunofluorescence analysis.

In this protocol, we describe how to generate murine primary epithelial colon monolayers directly from intestinal crypts. We provide experimental approaches to generate confluent monolayers on permeable filters, confluent monolayers for scratch wound healing and biochemical studies, and sparse and confluent monolayers for immunofluorescence analysis.

장 내 토굴에서 뮤린 기본 결장 상피 단층의 세대

The intestinal epithelium is comprised of a single layer of cells that act as a barrier between the gut lumen and the interior of the body. Disruption in ...