우리는 우리와 함께 TPLSM 시설을 공유 박사 T. 오티스, 신경 생물학, UCLA의 부, 감사, 박사 C. pEYFP - ClC1 플라스미드의 종류 기증 Fahlke, 생리학 연구소, RWTH 아헨, 독일, 그리고 미스터 기술 지원. R. 세라노. 이 작품은 NIH / NIAMS 부여 AR047664과 AR54816의 보조금에 의해 지원되었다.

FDB 및 IO 근육의 생체내 electroporation에 대한 실험 절차 <ol><li> . 생체내의 electroporation 프로토콜의를 시작하기 전에, 포유류의 표현 plasmids는 2-5 μg TE의 μl / 플라스미드 참고 범위의 농도를 얻을 수로 증폭해야합니다 우리는 정기적으로 상업 증폭 키트를 사용하여 제조 업체 &#39;절차를 따르십시오. 생체내 transfections의 골격근에서 매우 잘 CMV 프로 모터의 작동 실은 상업 표현 plasmids. </li><li> 나누어지는 필요한 플라스미드 솔루션의 볼륨 (10-20 μl)와 두 0.5 ML Eppendorf 튜브 (마우스의 각 발에 하나씩)에 저장합니다. </li><li> 무균 Tyrode 2 MG / ML hyaluronidase를 포함하는 솔루션을 준비합니다. </li><li> anesthetizing 상자를 사용하여, 깊이 승인 가스 마취 기계와 O2의 isoflurane 4 % 사용하여 마우스를 마취. 손난로 (37 ° C)에서 동물을 놓고 쥐 얼굴 마스크를 사용하여 마취를 유지합니다. 발가락 핀치 반사하여 마취 심도를 모니터링합니다. </li><li> 해부 현미경과 관찰에서 1 &quot;길이 33 게이지 바늘을 사용하여 살균 마우스 한발의 footpads 아래 hyaluronidase 용액 10 μL를 주입. 발 뒤꿈치에 가까운 지점에서 피부에 침투하고 ~ 1 / 4 &quot;에 대한 발가락의 기본 방향 subcutaneously 바늘을 전진. </li><li> 원할 경우 다른 발과 절차를 반복합니다. </li><li> 마취를 분리하고 새장에 마우스를 놓으십시오. 그것이 완전히 마취에서 회복하도록 허용합니다. </li><li> 일시간 후, 두 번째 시간 동안 동물을 마취하고 가열 패드에 놓으십시오. hyaluronidase 솔루션을 설명하는 동일한 절차에 따라, 플라스미드 DNA (플라스미드 구조의 크기에 따라)의 20-50 μg의 총 주입. 총 주사 량이 적은 20 μL / 도보해야합니다. 주 : 15-20 μ의 L가 필요한 경우, 그것은 조직 접착제로 바늘 진입 점에서 피부를 닫습하는 것이 좋습니다. </li><li> 마취를 분리하고 새장에 마우스를 놓으십시오. 그것이 완전히 마취에서 회복하고 10-15 분 기다리는 수 있습니다. </li><li> 세 번째 시간의 동물을 마취하고 가열 패드에 놓으십시오. </li><li> 동물의 한발을 선택합니다. 장소 하나는 금도금 침술의 발뒤꿈치에서 피부 밑에 바늘과 발가락의 바닥에 두 번째. 전극 기슭의 긴 축에 직각으로 서로 평행하고 지향하고 있습니다. </li><li> 마이크로 클립 커넥터를 사용하여 전기 자극기에 바늘 (전극)의 머리를 연결합니다. 1Hz 20 펄스, 기간 / 각 20 MS를 적용하여 근육을 Electroporate. . 전극의 간격에 따라 펄스 &#39;전압 진폭은 ~ 100 V / cm 참고 전기장 포기 (오실로 스코프로 모니터링하여) 조절 : 자극에 반응 없음 수축을 관찰해야하는 수준의 경우 마취가 적합합니다. </li><li> 원할 경우, 동물의 contralateral 기슭에 위의 절차를 반복하십시오. </li><li> 그 새장에 동물을 반환 한번 완전히 관찰하에 그것을 유지 마취에서 회복. 참고 : 프로 시저가 정상적으로된다면 동물이 30 분 이내에 완전한 이동성을 회복하고 나중 동식물 사육장의 동물 방으로 보낼 준비가됩니다. footpads에서 hyaluronidase와 DNA의 주사는 동물에 눈에 띄는 악영향이 없습니다. 일단 마취에서 회복 생쥐은 우리 주위에 정상적으로 앰버 수 있습니다. 추가 예방 차원에서, 0.0027 진통제로 2 일간 MG / ML에서 동물 Carprofen의 식수를 추가할 수 있습니다. </li><li> 단백질 표정은 2-8일 transfection 후 assayed 수 있습니다. 그러나, 많은 단백질의 지속적인 표현은 몇 달 동안 관찰되었습니다. </li></ol> 참고 : 동물 복지 법률과 실험실 동물의 동물 애호 관리 및 사용에 PHS 정책에 의해 위임된으로 모든 동물의 절차는 UCLA 는구나 동물 연구위원회에 의해 승인되었습니다. 대표 결과 : 위에서 설명한 생체내의 electroporation 절차에의 올바른 구현은 FDB 및 IO 근육에 plasmids의 효과적인 transfection을 초래한다. 그러나, 유전자 변형 단백질 변종 표현의 효율성이 플라스미드에 따라 달라집니다, 단백질, 단백질의 기능 특성, 그리고 통제 밖의 다른 변수의 숫자의 크기와 복잡. mCherry 단백질에 대한 상업적인 플라스미드 (PMR - mCherry) 인코딩의 존재에 electroporated FDB 근육을 위해 그림 1에서 그림과 같이 그들의 대부분은 적색 형광을 표시 사실에 의해 그림과 같이, 근육 섬유의 대부분은 우리의 프로토콜 transfected 있습니다. 이것은 각각의 섬유는 단백질 표현의 다른 학위를 전시 가능성을 배제하지 않거나 일부 섬유는 모두 3 transfected되지 않습니다. 그것은 B해야전자는 mCherry, EGFP, ECFP 및 EYFP 같은 형광 단백질의 대량의 효율적인 표현이 근육 섬유 &#39;흥분하고 여기 - 수축 결합 특성을 손상하지 않는 것을 지적했다. 사실, 그들은 가짜 transfected 근육 (결과가 표시되지 않음) 이들로부터 구별할 수 있습니다. 골격근 섬유의 찬란 - 태그 단백질의 언어 표현을 확인하는 데 사용되는 실용적인 접근. 디 노보 표현 유전자 변형 단백질의 세포내 지방화는 일상적으로 세포 구조를 잘 식별 마커의 각 태그 및 이미지의 TPLSM, 형광 이미지를 사용하여 인수 동시에 의해 평가됩니다. 이러한 후자의 가장 일반적인은 다음과 같습니다) 제 2 고조파 발생 (SHG) sarcomeric의 마이 오신 이방성 밴드 (M - 라인 중심) 9,10에서 발생하는 이미지, 그리고 B) DI - 8 - ANEPPS 형광 표면 및 가로 관을이 impermeant potentiometric dye11과 근육 섬유의 (T - 가느다란 관) 시스템 점막 라벨에 의해 얻을 수있다 이미지. DI - 8 - ANEPPS 물들일 근육 섬유의 형광 이미지에서 T - tubules는 섬유의 긴 축에 형광 지향 약 직교의 좁은 대역으로 나타납니다. 이 밴드는 unequally 서로 간격입니다 그들은 M - 라인에 걸쳐 걸쳐 장거리, 그리고 Z - 11 번 노선 전체에 걸쳐 짧은 하나에 의해 구분됩니다. 표현과 골격근 섬유의 α - actinin - EGFP의 지방화. 구조 근육 단백질의 태그 변종의 표현의 예제는 α - actinin은 그림 2에 표시됩니다. 이 단백질은 같은 정기적으로이 structure12의 표지로 사용, Z 라인의 주요 성분으로 알려진 것입니다. 우리는 α - actinin EGFP와 C 단자에 태그를 인간 (비 근육)에 대한 플라스미드 pEGFPN1 - α - actinin1 인코딩으로 FDB 및 IO 근육을 transfected. 엿새 transfection 후, 우리는 α - actinin은 대부분 동일 섬유 축을 따라 간격 좁은 밴드에서 표현 EGFP 형광 분포에 의해 평가, 것으로 나타났습니다. sarcomere 당 하나의 밴드는 (그림 2A &amp; 2D) 볼 수 있습니다. Z - 라인이 밴드의 colocalization은 SHG (그림 2B)와 D​​I - 8 - ANEPPS (그림 2E) 이미지 EGFP 형광의 분포를 비교하여 입증됩니다. 마찬가지로 그들이 Z - 라인의 위치와 동시, 연속 2 M - 밴드 사이의 중간에 위치하는 표시, SHG 밴드 α - actinin - EGFP 밴드 대체 오버레이 이미지 (그림 2C)에 의해 표시됩니다. DI - 8 - ANEPPS 물들일 transfected 근육 섬유에서 α - actinin - EGFP 밴드는 측면에 Z - 라인 (즉, 짧은 거리로 구분) 알려진 T - tubules (그림 2 층)의 모든 쌍 사이의 중심으로 보는 따라서 형질 α - actinin은 Z - 라인을 타겟으로하는 것을 나타냅니다. DHPRα1s 표현 EGFP와 N - 말단의 태그 pEGFPC1.1 - DHPR α 1S와 근육 transfection의 효율성은 그를 보여주는 TPLSM 이미지 (예 : 그림 3A)에서 확인할 수 있습니다 대부분의 섬유 표현 EGFP - DHPRα1s (transmembrane 단백질). transfected 섬유의 가장 두드러진 기능은 단백질이 T - tubules를 타겟으로하는 경우 예상했던대로 EGFP 형광 (그림 3A 및 3B)의 이중 줄무늬 패턴입니다. 또한 다른 섬유 형광 강도의 다양한 레벨을 표시하면서, 각 섬유의 줄무늬 형광 패턴이 섬유를 따라 균일 유지 것 같지만 그림 3에서 볼 수 있습니다. 높은 배율 (그림 3B)에서, 그것은 분명 밴드 간의 간격이 고르지 DI - 8 - ANEPPS (예 : 그림 2E) 스테인드 섬유에서 관찰하는 것과 비슷한 것을 볼 수 있습니다. 오버레이 이미지 (그림 3B &amp; 3E) SHG 밴드이 단백질은 T - tubules에서입니다 corroborating, EGFP - DHPRα1s 밴드 사이의 큰 간격 내에 있는지 보여줍니다. 추가가 아닌 형광 lipophilic 음이온과 측정을 걱정 DPA - (데이터가 표시되지 않음) 더 EGFP의 잔기가 T - tubules &#39;세포막의 내부 전단지의 몇 나노미터 이내입니다 보여줍니다. 현지화 및 EYFP - ClC1의 표현의 기능 평가 EGFP - DHPRα1s에 대한 관찰되는 비슷한 패턴으로 골격근 염화 채널 (ClC1), 디스플레이 EYFP 형광 밴드 (그림 4A)의 EYFP - 태그 구조를 (N - 터미널) 인코딩 pEYFP - ClC1와 transfected 섬유 &#39;표현 (그림 3A)와 DI - 8 - ANEPPS의 얼룩 (그림 2E)로 그림과 같이 T - 가느다란 관 배치에 해당. 예상대로, EYFP - ClC1 (그림 4A)과 SHG 이미지 (그림 4B) 오버레이 (그림 4C)에서와 같이의 superimposition은 SHG 밴드가 넓은 간격 O 중심 있다고 설명EYFP 형광 밴드 사이에 F. 같은 기능 염화 채널의 overexpression 기대 근육 섬유의 휴식 전도성에 상당한 증가 EYFP - ClC1 결과의 표현, 우리 transfected FDB 근육의 효소 dissociated 근육 섬유들이 electrophysiological 속성을 공부 여부를 평가하기 위해 두 microelectrodes를 사용하여 실험 설정은 이전에 6,11,13 설명했다. 표준 형광 현미경의 글로벌 형광 강도 측정 (표시되지 않음)에서 평가로 EYFP - ClC1 대량의 표현 하나, 다른이 아닌 transfected 컨트롤입니다 : 그림 5는 두 섬유의 결과를 보여줍니다. 그림 5A에서 전압 레코드 (EYFP - ClC1을 표현 근육 섬유에서 얻은) 과도한 휴식 전도성으로 인해 그것을 보여줍니다, 섬유는 거의 비 고르기입니다. 최대 400nA (0.5ms)의 전류 자극 펄스는 매우 작은 적극적인 반응을 (노 오버 슈트, 그림 5A) 이끌어하기 위해 사용할 수 있도록했습니다. 염화물 채널 차단 9 ACA 500 μm의를 포함 한 외부 Tyrode 솔루션의 교체 후, 200 NA 전류 펄스 (즉, 제어 섬유에 기록보다하지만 훨씬 느린와 광범위한 실천 가능성 (그림 5B)를 이끌어내는하기에 충분했다 그림 5C). 예상대로, 9 - ACA의 또한이 컨트롤 섬유 (그림 5D)에 최소한의 영향을했다. <img src="/files/ftp_upload/1520/1520fig1tmb.jpg" alt="그림 1" border="0" /> 그림 1. 인 - 생체내 electroporation 방법의 Transfection 효율. 브라이트 (A) 및 형광 (B) FDB 근육의 이미지는 PMR - mCherry와 transfected. electroporation 프로토콜 후 일 : 12 일. 하시기 바랍니다 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1520/1520fig1.jpg">여기를 클릭</a> 그림 1의 더 큰 버전을 위해. <img src="/files/ftp_upload/1520/1520figure2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. 표현과 FDB 섬유의 α - actinin - EGFP의 타겟팅. 패널 A와 B는 α - actinin - EGFP을 표현 섬유의 각각 EGFP의 형광 및 SHG 이미지,입니다. 패널 C는 A와 B. 패널 D와 E에있는 이미지의 중첩이다 각각 DI - 8 - ANEPPS과 α - actinin - EGFP와 스테인드을 표현하는 또 다른 섬유의 형광 이미지입니다. 육일 : 패널 F는 electroporation 프로토콜 후 D와 E 일 이내에 이미지의 중첩이다. <img src="/files/ftp_upload/1520/1520figure3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. 표현과 FDB 섬유에서 EGFP - DHPRα1s 타겟팅. 패널, EGFP - DHPRα1s을 표현 섬유 그룹의 EGFP 형광 이미지. 패널 B는 패널에서 사각형의 확대는 더 단백질 표현의 줄무늬 패턴을 보여주기 위해서. 패널 C는 패널 A. 패널 D의 이미지에 해당하는 SHG 이미지 것은 이미지의 오버레이는 A와 C. E가 패널 electroporation 프로토콜 후 패널 D. 날짜에 표시된 지역의 확대입니다 : 20 일. <img src="/files/ftp_upload/1520/1520figure4.jpg" alt="그림 4" /> 그림 4. 표현과 FDB 섬유의 EYFP - ClC1 타겟팅. 패널은 A와 B는 EYFP - ClC1을 표현 섬유의 각각 EYFP의 형광 및 SHG 이미지,입니다. 칠일 : 패널 C는 A와 B. 패널 D가 electroporation 프로토콜 후 패널 C. 날짜에 이미지의 강조 하얀 선을 따라 측정된 강도 프로파일입니다 패널에있는 이미지의 중첩이다. <img src="/files/ftp_upload/1520/1520figure5.jpg" alt="그림 5" /> 그림 5. 유전자 변형 EYFP - ClC1. 패널을 표현 Electrophysiological 평가 섬유 A와 B는 각각 9 ACA 치료 전후에 전류 펄스에 대한 응답으로 EYFP - ClC1을 표현 섬유의 전압을 기록하고 있습니다. 패널 C와 D가 아닌 transfected 섬유에 전류 펄스에 대한 응답으로 (행동 잠재력)가 elicited 전압 기록입니다 각각 9 - ACA와 치료 전후.

<ol>
	<li>Muangmoonchai, R., Wong, S., Smirlis, D., Phillips, I., Shephard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+liver+in+vivo+by+biolistic+particle+delivery.">Transfection of liver in vivo by biolistic particle delivery.</a> Molecular Biotechnology. 20 (2), 145-151 (2002).</li><li>DiFranco, M., Capote, J., Quinonez, M., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-dependent+dynamic+FRET+signals+from+the+transverse+tubules+in+mammalian+skeletal+muscle+fibers.">Voltage-dependent dynamic FRET signals from the transverse tubules in mammalian skeletal muscle fibers.</a> J Gen Physiol. 130 (6), 581-600 (2007).</li><li>DiFranco, M., Neco, P., Capote, J., Meera, P., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+evaluation+of+mammalian+skeletal+muscle+as+a+heterologous+protein+expression+system.">Quantitative evaluation of mammalian skeletal muscle as a heterologous protein expression system.</a> Protein Expression and Purification. 47 (1), 281-288 (2006).</li><li>Meera, P., Dodson, P. D., Karakossian, M. H., Otis, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+GFP-tagged+neuronal+glutamate+transporters+in+cerebellar+Purkinje+neurons.">Expression of GFP-tagged neuronal glutamate transporters in cerebellar Purkinje neurons.</a> Neuropharmacology. 49 (6), 883-889 (2005).</li><li>DiFranco, M., Capote, J., Quinonez, M., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+FRET+Signals+between+DPA+and+the+{alpha}1s+and+{beta}1a+Subunits+of+the+DHPR+of+Mammalian+Skeletal+Muscle.">Dynamic FRET Signals between DPA and the {alpha}1s and {beta}1a Subunits of the DHPR of Mammalian Skeletal Muscle.</a> Biophys. J. 94, 2633-2633 (2008).</li><li>Woods, C. E., Novo, D., DiFranco, M., Capote, J., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+in+the+transverse+tubular+system+and+voltage+dependence+of+calcium+release+in+normal+and+mdx+mouse+muscle+fibres.">Propagation in the transverse tubular system and voltage dependence of calcium release in normal and mdx mouse muscle fibres.</a> J Physiol. 568 (Pt 3), 867-880 (2005).</li><li>DiFranco, M., Woods, C. E., Capote, J., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophic+skeletal+muscle+fibers+display+alterations+at+the+level+of+calcium+microdomains.">Dystrophic skeletal muscle fibers display alterations at the level of calcium microdomains.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (38), 14698-14703 (2008).</li><li>Lueck, J. D., Mankodi, A., Swanson, M. S., Thornton, C. A., Dirksen, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+Chloride+Channel+Dysfunction+in+Two+Mouse+Models+of+Myotonic+Dystrophy.">Muscle Chloride Channel Dysfunction in Two Mouse Models of Myotonic Dystrophy.</a> J. Gen. Physiol. 129 (1), 79-94 (2007).</li><li>Zipfel, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+tissue+intrinsic+emission+microscopy+using+multiphoton-excited+native+fluorescence+and+second+harmonic+generation.">Live tissue intrinsic emission microscopy using multiphoton-excited native fluorescence and second harmonic generation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7075-7080 (2003).</li><li>Plotnikov, S. V., Millard, A. C., Campagnola, P. J., Mohler, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Myosin-Based+Source+for+Second-Harmonic+Generation+from+Muscle+Sarcomeres.">Characterization of the Myosin-Based Source for Second-Harmonic Generation from Muscle Sarcomeres.</a> Biophys J. 90 (2), 693-703 (2006).</li><li>DiFranco, M., Capote, J., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+and+functional+characterization+of+the+transverse+tubular+system+of+mammalian+muscle+fibers+using+the+potentiometric+indicator+di-8-ANEPPS.">Optical imaging and functional characterization of the transverse tubular system of mammalian muscle fibers using the potentiometric indicator di-8-ANEPPS.</a> J Membr Biol. 208 (2), 141-153 (2005).</li><li>Mills, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+the+actin-binding+proteins,+{{alpha}}-actinin-2+and+-3,+in+different+species:+implications+for+the+evolution+of+functional+redundancy.">Differential expression of the actin-binding proteins, {{alpha}}-actinin-2 and -3, in different species: implications for the evolution of functional redundancy.</a> Hum. Mol. Genet. 10 (13), 1335-1346 (2001).</li><li>Woods, C. E., Novo, D., DiFranco, M., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+action+potential-evoked+sarcoplasmic+reticulum+calcium+release+is+impaired+in+mdx+mouse+muscle+fibres.">The action potential-evoked sarcoplasmic reticulum calcium release is impaired in mdx mouse muscle fibres.</a> J Physiol. 557 (Pt 1), 59-75 (2004).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

우리는 여기서 생체내의 electroporation에 의해 골격 근육 섬유로의 DNA plasmids 효과 transfections을 달성하기 위해 따라야 할 자세한 단계를 설명합니다. 우리의 접근 방법의 주요 장점은 구현의 단순하고, 동물 무시할 건강 위험의 결과는 최소한의 invasiveness 있습니다. 현실에서는, 위에서 설명한 electroporation 프로토콜은 마취에서 동물에 의해 잘 용납하는 모든 중 전기 자극 프로토콜에 의해 뒤에...

dna transfection of mammalian skeletal muscles using in vivo electroporation

세포 생물학에 관심이 점점 자신의 내생적인 분포와 기능 관련을 조사하기 위해 필수적인 단백질 (예 : 찬란 태그를 구성 및 / 또는 돌연변이 변종)의 transgenically 수정된 형태를 표현하는 것입니다. 완전히 차별화된 세포에서이 목표를 성취하기 위해 구현되었습니다 흥미로운 접근 방식입니다<em&gt; 생체내에</em같은 간장과 같은 특정 조직에 다양한 방법으로 plasmids의&gt; transfection<sup&gt; 1</sup&gt;, 골격​​근<sup&gt; 2,3</sup&gt;, 그리고 심지어 두뇌<sup&gt; 4</sup&gt;. 우리는 여기서 효율적으로의 섬유로 유전 물질을 transfect하기 위해 따라야합니다 단계에 대한 자세한 설명을 제시<em&gt; flexor digitorum brevis</em&gt; (FDB)와<em&gt; interosseus</em를 사용하여 성인 마우스&gt; (IO) 근육<em&gt; 생체내에</em&gt; electroporation 접근. 실험 매개 변수는 각각의 섬유로 표현 단백질의 품질과 수량을 손상 수 있습니다 조직 손상을 최소화하면서 transfected 근육 섬유의 수를 최대화하기 위해처럼 최적화되었습니다. 우리는이 문서에서 설명하는 방법의 구현 수용성 단백질의 높은 수율, 즉 EGFP와 ECFP 결과 확인했습니다<sup&gt; 3</sup&gt; calpain, FKBP12, β2a - DHPR 등, 구조 단백질, 즉 minidystrophin과 α - actinin 및 막 단백질, 즉 α1s - DHPR, RyR1, 심장 나 / CA<sup&gt; 2 +</supFDB, IO와 생쥐와 쥐의 다른 근육에 적용&gt; 교환기, NaV1.4 나 채널, SERCA1 등. 이러한 단백질 중 일부의 효율적인 표현은 생화학과 함께 확인되었습니다<sup&gt; 3</sup&gt; 및 기능 증거<sup&gt; 5</sup&gt;. 그러나, 훨씬 우리가 사용하는 가장 일반적인 확실한 방법은 찬란 태그 단백질 구조의 표준 형광 현미경 및 2 광자 레이저 스캔 현미경 (TPLSM), 전반적인 표현뿐만 아니라 식별하도록 허용뿐만 아니라 세부적인 세포 로컬 리 제이션은 다음과 같습니다. 방법은 동일합니다 (여기에 표시) 생리 관련의 단백질의 표현을위한 인코딩 plasmids를 transfect하는 데 사용하거나, 간섭 RNA (siRNA)를 일반적으로 표현 단백질 (아직 저희가 테스트하지)의 표현을 억제하는 목표 수 있습니다. 그것은이 근육의 효소 dissociated 섬유 아래는 흥분하고 여기 - 수축 결합의 기본 메커니즘을 조사하기 위해 현재 가장 적합한 모델 중 하나이기 때문에 FDB 및 IO 근육 섬유의 transfection은 포유류의 근육 생리학의 조사에 특히 관련이 있다고 지적한다 전류 또는 전압 클램프 조건<sup&gt; 2,6-8</sup&gt;.

Watch this Scientific Journal Video about DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation at JoVE.com

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

우리는 electroporation과 형광 현미경을 사용하여 단백질 표현의 후속 시각화를 사용하여 라이브 생쥐의 발 근육의 섬유에 플라스미드 DNA의 transfection 효율에 대한 자세한 절차를 설명합니다.

사용 포유류 골격 근육의 유전자 Transfection VIVO에서 Electroporation

 A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant ...

dna-transfection-mammalian-skeletal-muscles-using-vivo

Research

JoVE Journal

Biology

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

17.7K 조회수.  David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles. 우리는 electroporation과 형광 현미경을 사용하여 단백질 표현의 후속 시각화를 사용하여 라이브 생쥐의 발 근육의 섬유에 플라스미드 DNA의 transfection 효율에 대한 자세한 절차를 설명합니다.

비디오: DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact tissue, including in vivo preparations. The distinct advantage of this technique is that experimental manipulations may be performed on individual cells while leaving the surrounding tissue unaltered, thereby distinguishing cell-autonomous effects from those resulting from global treatments. When combined with advanced in vivo imaging techniques, SCE of fluorescent markers permits direct visualization of cellular morphology, cell growth, and intracellular events over timescales ranging from seconds to days. While this technique is used in a variety of in vivo and ex vivo preparations, we have optimized this technique for use in Xenopus laevis tadpoles. In this video article, we detail the procedure for SCE of a fluorescent dye or plasmid DNA into neurons within the intact brain of the albino Xenopus tadpole. We also discuss methods to optimize yield, and show examples of live two-photon fluorescence imaging of neurons fluorescently labeled by SCE.

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact tissue, including in vivo preparations. Here we detail the procedure for SCE of a fluorescent dye or plasmid DNA into neurons within the intact brain of the Xenopus laevis tadpole.

완전한 개발 두뇌 속에 생체내에서 단일 세포 Electroporation

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact ...

연구

생물학

Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to immortalized cell lines. However, the post-mitotic nature of primary neurons prevents effective heterologous protein expression using common procedures such as electroporation or chemically-mediated transfection. Thus, other techniques must be employed in order to effectively express proteins in these non-dividing cells.
In this article, we describe the steps required to perform intranuclear injections of cDNA constructs into dissociated adult sympathetic neurons. This technique, which has been applied to different types of neurons, can successfully induce heterologous protein expression. The equipment essential for the microinjection procedure includes an inverted microscope to visualize cells, a glass injection pipet filled with cDNA solution that is connected to a N2(g) pressure delivery system, and a micromanipulator. The micromanipulator coordinates the injection motion of microinjection pipet with a brief pulse of pressurized N2 to eject cDNA solution from the pipet tip. 
This technique does not have the toxicity associated with many other transfection methods and enables multiple DNA constructs to be expressed at a consistent ratio. The low number of injected cells makes the microinjection procedure well suited for single cell studies such as electrophysiological recordings and optical imaging, but may not be ideal for biochemical assays that require a larger number of cells and higher transfection efficiencies. Although intranuclear microinjections require an investment of equipment and time, the ability to achieve high levels of heterologous protein expression in a physiologically relevant environment makes this technique a very useful tool to investigate protein function.

Direct intranuclear injection of cDNA is an effective transfection technique for post-mitotic cells. This method provides high levels of heterologous protein expression from single or multiple cDNA constructs and enables protein function to be studied in a physiologically relevant environment with a variety of single cell assays.

Dissociated 성인 포유류의 뉴런으로 DNA의 Microinjection Intranuclear

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death. Cells repair DSBs using two major pathways: nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR). Perturbations of NHEJ and HR are often associated with premature aging and tumorigenesis, hence it is important to have a quantitative way of measuring each DSB repair pathway. Our laboratory has developed fluorescent reporter constructs that allow sensitive and quantitative measurement of NHEJ and HR. The constructs are based on an engineered GFP gene containing recognition sites for a rare-cutting I-SceI endonuclease for induction of DSBs. The starting constructs are GFP negative as the GFP gene is inactivated by an additional exon, or by mutations. Successful repair of the I-SceI-induced breaks by NHEJ or HR restores the functional GFP gene. The number of GFP positive cells counted by flow cytometry provides quantitative measure of NHEJ or HR efficiency.

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

This article describes GFP-based fluorescence in vivo assays that separately quantify homologous recombination and nonhomologous end joining in mammalian cells.

포유 동물 세포의 DNA 이중 가닥 브레이크 (DSB) 수리 분석

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

Morpholinos의 생체내의 Electroporation에서 성인 Zebrafish의 망막에

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, fatigability, and recovery after fatigue can be obtained to assess specific aspects of the excitation-contraction coupling (ECC) process such as excitability, contractile machinery and Ca2+ handling ability. This method removes the nerve and blood supply and focuses on the isolated skeletal muscle itself. We routinely use this method to identify genetic components that alter the contractile property of skeletal muscle though modulating Ca2+ signaling pathways. Here, we describe a newly identified skeletal muscle phenotype, i.e., mechanic alternans, as an example of the various and rich information that can be obtained using the in vitro muscle contractility assay. Combination of this assay with single cell assays, genetic approaches and biochemistry assays can provide important insights into the mechanisms of ECC in skeletal muscle.

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

We describe a method to directly measure muscle force, muscle power, contractile kinetics and fatigability of isolated skeletal muscles in an in vitro system using field stimulation. Valuable information on Ca2+ handling properties and contractile machinery of the muscle can be obtained using different stimulating protocols.

절연 골격근의 수축성, Fatigability 및 Alternans의 예 VIVO 평가

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

비례 생체 분자 비콘을 사용하여 살아있는 세포의 단일 엔지니어링 RNA 성적 증명서의 실시간 영상

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular transfection technique for testicular mouse cells allows the study of unique processes in spermatogenesis.
The following protocol focuses on transfection of testicular mouse cells with plasmid constructs. Specifically, we used the reporter vector pEGFP-C1, which expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) and also the pDsRed2-N1 vector expressing red fluorescent protein (DsRed2). Both encoded reporter genes were under the control of the human cytomegalovirus immediate-early promoter (CMV).
For performing gene transfer into mouse testes, the reporter plasmid constructs are injected into testes of living mice. To that end, the testis of an anaesthetized animal is exposed and the site of microinjection is prepared. Our preferred place of injection is the efferent duct, with the ultimately connected rete testis as the anatomical transport route of the spermatozoa between the testis and the epididymis. In this way, the filling of the seminiferous tubules after microinjection is excellently managed and controlled due to the use of stained DNA solutions. After observing a sufficient filling of the testis by its colored tubule structure, the organ is electroporated. This enables the transfer of the DNA solution into the testicular&#160;cells. Following 3 days of incubation, the testis is removed and investigated under the microscope for green or red&#160;fluorescence, illustrating transfection success.
Generally, this protocol can be employed for delivering DNA- or RNA- constructs into living mouse testis in order to (over)express or knock down genes, facilitating in vivo gene function analysis. Furthermore, it is suitable for studying reporter constructs or putative gene regulatory elements. Thus, the main advantages of the electroporation technique are fast performance in combination with low effort as well as the moderate technical equipment and skills required compared to alternative techniques.

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This article describes microinjection and electroporation of mouse testis in&#160;vivo as a&#160;transfection technique for testicular mouse cells to study unique processes of spermatogenesis. The presented protocol involves steps of glass capillary preparation, microinjection via the efferent duct, and transfection by electroporation.

마우스 고환의 생체 내 미세 주입 및 Electroporation에에서

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3&#8217; ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

마우스 골격근에있는 검색, 탐지 DNA 손상 분석<em&gt; 현장에서</em&gt; TUNEL 방법을 사용하여

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently labeled proteins in the flexor digitorum brevis (FDB) muscle. Conditions have been optimized to provide a large number of high quality myofibers expressing the electroporated plasmid while minimizing muscle damage. The method employs fluorescent tags on various proteins. Combining this expression method with high resolution confocal microscopy permits live cell imaging, including imaging after laser-induced damage. Fluorescent dyes combined with imaging of fluorescently-tagged proteins provides information regarding the basic structure of muscle and its response to stimuli.

This protocol utilizes electroporation to introduce and express fluorescently labeled proteins in mouse muscle fibers. Following recovery after electroporation, fibers are isolated. Individual fibers are then imaged using high resolution confocal microscopy to visualize muscle structure.

DNA 일렉트로, 근섬유의 분리 및 이미징

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

Examination of Proteins Bound to Nascent DNA in Mammalian Cells Using  BrdU-ChIP-Slot-Western Technique

Histone deacetylases 1 and 2 (HDAC1,2) localize to the sites of DNA replication. In the previous study, using a selective inhibitor and a genetic knockdown system, we showed novel functions for HDAC1,2 in replication fork progression and nascent chromatin maintenance in mammalian cells. Additionally, we used a BrdU-ChIP-Slot-Western technique that combines chromatin immunoprecipitation (ChIP) of bromo-deoxyuridine (BrdU)-labeled DNA with slot blot and Western analyses to quantitatively measure proteins or histone modification associated with nascent DNA.
Actively dividing cells were treated with HDAC1,2 selective inhibitor or transfected with siRNAs against Hdac1 and Hdac2 and then newly synthesized DNA was labeled with the thymidine analog bromodeoxyuridine (BrdU). The BrdU labeling was done at a time point when there was no significant cell cycle arrest or apoptosis due to the loss of HDAC1,2 functions. Following labeling of cells with BrdU, chromatin immunoprecipitation (ChIP) of histone acetylation marks or the chromatin-remodeler was performed with specific antibodies. BrdU-labeled input DNA and the immunoprecipitated (or ChIPed) DNA was then spotted onto a membrane using the slot blot technique and immobilized using UV. The amount of nascent DNA in each slot was then quantitatively assessed using Western analysis with an anti-BrdU antibody. The effect of loss of HDAC1,2 functions on the levels of newly synthesized DNA-associated histone acetylation marks and chromatin remodeler was then determined by normalizing the BrdU-ChIP signal obtained from the treated samples to the control samples.

In this protocol, we describe a novel BrdU-ChIP-Slot-Western technique to examine proteins and histone modifications associated with newly synthesized or nascent DNA.