이 작품은 JM, RO1-AR063084to NLW 및 JZ에 RO1-AR057404에 RO1-AG028614에 의해 지원되었다.

1. 삼투 스트레스 관류 시스템 설정 그림 1은 칼슘의 개략적 인 프로토콜이 그대로 골격 근육 섬유에 평가를 불꽃입니다. <ol><li> 두 채널의 최소 함유 관류 시스템의 출구 끝을 위치시킬 세 축 (XYZ) 미세 조작기를 설정. 방법 루어 - -에 및 / 또는 관류 솔루션의 흐름을 끄려면 코리아 크레인이 부착 된 세 개의 일회용 주사기 루어 배럴로 만들어 질 수 있었다. 이러한 관류 채널&gt; 0.2 mm 직경 단일 팁을 통해 관류 액&gt; 1 ㎖ / 분을 전달할 수 있어야한다. </li><li> 관류 시스템, 저장성 타이로드 솔루션을 등장 성 타이로드 해결 한 다른 두 개의 채널을로드합니다. </li></ol> 2. 마우스에서 준비 본래대로 단일 굴근 심지 브레비스 (FDB) 근육 섬유 <ol><li> 마우스 유럽 연합 (EU)에서 발을 제거발목 관절 위의 다리를 절단하여 무거운 해부 가위를 사용하여 NIH와 IACUC 지침에 따라 thanized. </li><li> 발바닥면이 위를 향하고 최소한의 칼슘 2 + 타이로드 솔루션으로 가득 해부 실에 발을 핀. </li><li> 힘줄 절단 조심스럽게 주위 조직에서 근육을 분리하는 힘줄을 당겨 FDB를 해부하다. </li><li> 근육의 깊은 층에 각각의 자리에가 가지 말초 힘줄을 절단하여 절개를 마칩니다. </li><li> 근육 섬유에 추가 손상을 방지 및 콜라게나 소화 솔루션의 해동 나누어지는이있는 튜브에 배치하기 위해 힘줄을 통해 집게와 함께 선택하여 FDB 근육을 이동 37 ℃로 데워진 </li><li> 160 rpm의 속도로 60 ~ 90 분 동안 37 ° C에서 진탕에 똑바로 FDB를 포함하는 튜브를 품어. 이 근육 번들 해리 프로토콜 실험적 동물의 다른 균주에 대해 검사 될 필요특히 막 손상에 취약 그 질병 / 돌연변이 섬유. </li><li> 등장 성 타이로드 솔루션의 700 μL와 튜브에 소화 FDB를 전송하고 부드럽게 팁을 제거하기 위해 점차적으로 깨끗한 면도날로 절단을 통해 직경을 감소 200 ㎖ - 마이크로 피펫 팁의 시리즈를 통해 근육을 여러 번 그려 섬유를 해제 씹다 200 ㎖의 마이크로 피펫의. 질병에서 특히 약한 근육에 손상 섬유를 방지하기 위해 끝이 섬유 다발이 고집하지 않고 통과 할 수 있도록 충분히 그냥 큰 있는지 확인합니다. 너무 작은 구멍을 통해 번들을 강요하지 마십시오. </li><li> 부드럽게 등장 성 1 ㎖를 포함하는 35mm 델타 TPG 요리의 중심에 컷 200 ㎖의 마이크로 피펫으로 도청 및 재현 탁 FDB 섬유 튜브 후 70 ㎖ (총 섬유의 1 / 10)를 인출하여 FDB 섬유를 플레이트 타이로드 솔루션은 요리를 통해 확산을 줄일 수 있습니다. </li><li> D에 그대로 단일 섬유의 수를 결정해부 현미경을 사용하여 ISH. 접시에 3 ~ 4 그대로 섬유를 얻기 위해 FDB 섬유의 추가 분취를 추가합니다. </li><li> 4 ° C에서 추가 격리 된 근육 섬유를 저장하고 6 시간 이내에 사용한다. </li></ol> 3. FLUO - 오전 4시 염료 로딩 및 CA 2 + 영상 (스파크 측정) <ol><li> 관 10 ㎖ 플루오 (Fluo) - 오전 4 주식 (1 ㎜)과에 전송 도금 FDB 섬유와 요리에서 등장 성 타이로드 용액 500 ㎖를 혼합하고 10 mm의 최종 플루오 (Fluo) - 오전 4 농도에 요리에 다시 추가합니다. 또는, 플루로 닉 산 염료 적재 효율을 증가시키기 위해 사용될 수있다. </li><li> 어둠 속에서 실온에서 60 분 동안로드합니다. </li><li> 주의 깊게 자르지 200 ㎖의 플라스틱 마이크로 피펫 팁과 요리에서 플루오 (Fluo) - 오전 4 함유 등장 성 타이로드 용액 500 ㎖를 그려 섬유를 세척하고 신선한 등장 성 타이로드 솔루션의 동일한 볼륨으로 교체. </li><li> 이 과정을 3 번 이상 반복합니다. </li><li> 미토콘드리아의 기능을 시각화하기 위해, 동위 원소 500 ㎖를 전송관 5 ㎖ TMRE 재고 (1 ㎜)로, 혼합, 50 nm의 최종 농도에 다시 요리에 추가로 FDB 섬유와 요리에서 NIC 타이로드 솔루션. </li><li> 10 분 동안 실온에서 배양한다. </li><li> 주의 깊게 500 ㎖를 그려 섬유를 세척 TMRE 함유 포경 200 ㎖의 플라스틱 마이크로 피펫 팁과 요리에서 등장 성 타이로드 솔루션 신선한 등장 성 타이로드 솔루션의 동일한 볼륨으로 교체. </li><li> 이 과정을 3 번 이상 반복합니다. </li><li> 공 초점 현미경에 접시를 전송하고 선명한 줄무늬와 실험을위한 부드러운 sarcolemmal 막과 그대로 섬유를 선택합니다. </li><li> 미세 조작기 컨트롤을 사용하여 멀리 대상 근육 섬유에서와 중앙 오프 관류 시스템을 400 ~ 500 μm의 끝을 배치합니다. </li><li> FDB 섬유는 그 자리에 체재 확인하기 위해 등장 성 타이로드 솔루션의 흐름을 시작합니다. </li><li> 40X 기름 침지 목적으로 플루오 (Fluo) -4에서 오전 형광 신호를 기록하고와 플루오 (Fluo) -4 오전 흥분아르곤 레이저 (여기 파장 488 nm의) 기록 방출 신호 (파장 510-580 nm의). 형광 신호의 세기는 내 Ca 2 + 농도 ([칼슘 2 +] I)의 상대 레벨에 비례한다. </li><li> 섬유상의 삼투압 스트레스를 생산하기 위해 세포 외 용액의 삼투압을 변경하여 칼슘 2 + 과도 상태를 유도한다. 처음에 붓기를 유도하기 위해 100 초 저장성 타이로드 용액 (170 mOsM)와 다음 등장 성 타이로드 용액 (290 mOsM) (60 초 기준 컬렉션)와 섬유를 perfuse합니다. 등장 성 타이로드 용액으로 FDB 섬유를 확대 Perfuse. 일반적으로, 오직 하나의 삼투압 충격 한 델타 TPG 접시 단일 그대로 섬유와 스파크 이벤트 데이터 수집을위한 마지막 10 분에 적용된다. </li><li> 166 LPS (초당 라인, 그리고 EA의 스캔 속도와 XY 이차원 이미지의 시계열을 사용하여 칼슘 2 + 불꽃 (그림 2)의 기록 공간 현지화등장 (1 분 각각의 조건에 대해 3.08 초 / 프레임의 결과로 512 픽셀)로 구성 채널 라인), 저장성 스트레스 (100 초) 및 사후 저장성 스트레스 (5 분). 오프라인 분석을 위해 저장 신호는 실험 종료 후 칼슘 2 + 불꽃의 분포 및 빈도를 알아보고자 하였다. </li><li> 새 접시에 새 섬유를 찾아 칼슘 2 + 과도을 유도하기 위해 동일한 삼투압 충격 프로토콜을 따릅니다. 직접 sarcolemmal 막 아래에 배치 된 공 초점 주사 라인 일분 (즉, 30,000 라인)에 대한 칼슘 2 + 과도를 기록하는 공 초점 라인 스캔 (XT) 모드 (길이 512 픽셀, 2 밀리 초 / 라인 스캔의 샘플 속도를 사용하여 (그림 3 ). 개별 칼슘 2 + 불꽃의 크기와 반응 속도의 분석을위한 linescans의 1 분 간격으로 세 가지를 순차적으로 ()을 기록하기 위해 서로 다른 초점 비행기로 라인 스캔을 변경합니다. </li></ol> 4. 데이터 분석 <ol><li> 다수 상환, 피크 시간 (FDHM에 시간, 상승 시간, XT 라인 스캔, 개별 칼슘 2 + 불꽃 매개 변수의 형태와 반응 속도를 평가 진폭, 즉 (F 0 휴식 칼슘 2 + 형광입니다 F / F 0)에 추적 , 절반 크기의 전체 지속 시간), 기록 된 스파크의 공간 폭 (FWHM, 절반 크기의 전체 폭). 이러한 매개 변수는 칼슘 2 + 플럭스 (진폭)와 같은 RYR 칼슘 2 + 채널의 기본 게이트의 속성을 나타내고, RYRs (기간)의 게이트 속도론. </li><li> 이전에 11,16 바와 같이, 이미지 프로세싱 언어 IDL (대화 형 데이터 언어)을 사용하여 만든 사용자 정의 개발, 반자동 알고리즘으로 디지털 이미지 데이터를 분석합니다. 칼슘 2 +의 고유 반응 속도는 삼투압 스트레스에 의해 FDB 섬유에 의한 칼슘 + 스파크의 경우에 방출하기 때문에 2 + 이벤트를 촉발 CA의 수동 및 자동 기능을 결합하는 것이 좋습니다이러한 사용자 지정 빌드 이미지 분석 프로그램 11 식별 및 처리. 그것은 수동으로 일부 근육 질환 모델에서 ROI (관심 지역)를 식별하는 것이 필요 할 때이 알고리즘은 매우 유용합니다. 투자 수익 (ROI)이 정의되면,이 알고리즘은 자동으로 다음 Excel 파일로 내보낼 수 있습니다 위에서 언급 한 불꽃 매개 변수를 도출 할 수 있습니다. 대안 적으로, 공개 가능 화상 처리 소프트웨어, ImageJ에있는 예 SparkMaster는 칼슘 2 + 불꽃의 운동 특성과 골격근 (17)에서의 공간 분포를 정의하는데 사용될 수있다. </li></ol>

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	<li>Stutzmann, G. E., Mattson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum+Ca2++handling+in+excitable+cells+in+health+and+disease.">Endoplasmic reticulum Ca2+ handling in excitable cells in health and disease.</a> Pharmacol. Rev. 63 (3), 700-727 (2011).</li><li>Cheng, H., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+sparks.">Calcium sparks.</a> Physiol. Rev. 88 (4), 1491-1545 (2008).</li><li>Brochet, D. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elementary+calcium+release+events+from+the+sarcoplasmic+reticulum+in+the+heart.">Elementary calcium release events from the sarcoplasmic reticulum in the heart.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 740, 499-509 (2012).</li><li>Brochet, D. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quarky+calcium+release+in+the+heart.">Quarky calcium release in the heart.</a> Circ. Res. 108 (2), 210-218 (2011).</li><li>Guatimosim, S., Guatimosim, C., Song, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+sparks+in+cardiac+myocytes.">Imaging calcium sparks in cardiac myocytes.</a> Methods Mol. Biol. 689, 205-214 (2011).</li><li>Dulhunty, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitation-contraction+coupling+from+the+1950s+into+the+new+millennium.">Excitation-contraction coupling from the 1950s into the new millennium.</a> Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 33 (9), 763-772 (2006).</li><li>Dulhunty, A. F., Casarotto, M. G., Beard, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ryanodine+receptor:+a+pivotal+Ca2++regulatory+protein+and+potential+therapeutic+drug+target.">The ryanodine receptor: a pivotal Ca2+ regulatory protein and potential therapeutic drug target.</a> Curr. Drug Targets. 12 (5), 709-723 (2011).</li><li>Kirsch, W. G., Uttenweiler, D., Fink, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spark-+and+ember-like+elementary+Ca2++release+events+in+skinned+fibres+of+adult+mammalian+skeletal+muscle.">Spark- and ember-like elementary Ca2+ release events in skinned fibres of adult mammalian skeletal muscle.</a> J. Physiol. 537, 379-389 (2001).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+probable+role+of+dihydropyridine+receptors+in+repression+of+Ca2++sparks+demonstrated+in+cultured+mammalian+muscle.">A probable role of dihydropyridine receptors in repression of Ca2+ sparks demonstrated in cultured mammalian muscle.</a> Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 290 (2), 539-553 (2006).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++sparks+and+embers+of+mammalian+muscle.">Ca2+ sparks and embers of mammalian muscle.</a> Properties of the sources. J. Gen. Physiol. 122 (1), 95-114 (2003).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncontrolled+calcium+sparks+act+as+a+dystrophic+signal+for+mammalian+skeletal+muscle.">Uncontrolled calcium sparks act as a dystrophic signal for mammalian skeletal muscle.</a> Nat. Cell. Biol. 7 (5), 525-530 (2005).</li><li>Teichmann, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+control+over+Ca2++sparks+via+mechanosensitive+channels+is+disrupted+in+dystrophin+deficient+muscle+but+restored+by+mini-dystrophin+expression.">Inhibitory control over Ca2+ sparks via mechanosensitive channels is disrupted in dystrophin deficient muscle but restored by mini-dystrophin expression.</a> PLoS One. 3 (11), e3644 (2008).</li><li>Shkryl, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+amplification+of+ROS+and+Ca2++signals+in+stressed+mdx+dystrophic+skeletal+muscle+fibers.">Reciprocal amplification of ROS and Ca2+ signals in stressed mdx dystrophic skeletal muscle fibers.</a> Pflugers. Arch. 458 (5), 915-928 (2009).</li><li>Lovering, R. M., Michaelson, L., Ward, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malformed+mdx+myofibers+have+normal+cytoskeletal+architecture+yet+altered+EC+coupling+and+stress-induced+Ca2++signaling.">Malformed mdx myofibers have normal cytoskeletal architecture yet altered EC coupling and stress-induced Ca2+ signaling.</a> Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 297 (3), 571-580 (2009).</li><li>Weisleder, N., Ma, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++sparks+as+a+plastic+signal+for+skeletal+muscle+health,+aging,+and+dystrophy.">Ca2+ sparks as a plastic signal for skeletal muscle health, aging, and dystrophy.</a> Acta. 27 (7), 791-798 (2006).</li><li>Weisleder, N., Zhou, J., Ma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+calcium+sparks+in+intact+and+permeabilized+skeletal+muscle+fibers.">Detection of calcium sparks in intact and permeabilized skeletal muscle fibers.</a> Methods Mol. Biol. 798, 395-410 (2012).</li><li>Picht, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SparkMaster:+automated+calcium+spark+analysis+with+ImageJ.">SparkMaster: automated calcium spark analysis with ImageJ.</a> Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 293 (3), 1073-1081 (2007).</li><li>Weisleder, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+aging+is+associated+with+compromised+Ca2++spark+signaling+and+segregated+intracellular+Ca2++release.">Muscle aging is associated with compromised Ca2+ spark signaling and segregated intracellular Ca2+ release.</a> J. Cell. Biol. 174 (5), 639-645 (2006).</li><li>Weisleder, N., Ma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+Ca2++sparks+in+aging+skeletal+and+cardiac+muscle.">Altered Ca2+ sparks in aging skeletal and cardiac muscle.</a> Ageing Res. Rev. 7 (3), 177-188 (2008).</li><li>Yi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+calcium+uptake+regulates+rapid+calcium+transients+in+skeletal+muscle+during+excitation-contraction+(E-C)+coupling.">Mitochondrial calcium uptake regulates rapid calcium transients in skeletal muscle during excitation-contraction (E-C) coupling.</a> J. Biol. Chem. 286 (37), 32436-32443 (2011).</li><li>Tjondrokoesoemo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+1+inositol+(1,4,5)-trisphosphate+receptor+activates+ryanodine+receptor+1+to+mediate+calcium+spark+signaling+in+adult+Mammalian+skeletal+muscle.">Type 1 inositol (1,4,5)-trisphosphate receptor activates ryanodine receptor 1 to mediate calcium spark signaling in adult Mammalian skeletal muscle.</a> J. Biol. Chem. 288, 2103-2109 (2013).</li><li>Martins, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+contribute+to+Ca2++signals+produced+by+osmotic+stress+in+mouse+skeletal+muscle+fibres.">Reactive oxygen species contribute to Ca2+ signals produced by osmotic stress in mouse skeletal muscle fibres.</a> J. Physiol. 586 (1), 197-210 (2008).</li><li>Apostol, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+calcium+signals+induced+by+hyper-osmotic+stress+in+mammalian+skeletal+muscle+cells.">Local calcium signals induced by hyper-osmotic stress in mammalian skeletal muscle cells.</a> J. Muscle Res. Cell Motil. 30 (3-4), 97-109 (2009).</li><li>Jiang, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinic+acid+adenine+dinucleotide+phosphate+(NAADP)+Activates+Global+and+Heterogeneous+Local+Ca2++Signals+from+NAADP-+and+Ryanodine+Receptor-gated+Ca2++Stores+in+Pulmonary+Arterial+myocytes.">Nicotinic acid adenine dinucleotide phosphate (NAADP) Activates Global and Heterogeneous Local Ca2+ Signals from NAADP- and Ryanodine Receptor-gated Ca2+ Stores in Pulmonary Arterial myocytes.</a> J. Biol. Chem. 288 (15), 10381-10394 (2013).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

그대로 골격 근육에 칼슘 2 + 불꽃을 평가하는이 방법은 근육의 생리 및 질병 연구를위한 유용한 도구입니다. 우리는 칼슘 2 + 스파크 응답 (18, 19)뿐만 아니라, 근 위축성 측삭 경화증 (20)을 에이징, 근이영양증 (11) 등, 다른 조건으로 변경 한 것으로 나타났다. 우리의 최근의 연구는 또한 캘리포니아에 골격 근육 섬유 (21) 2 + 불꽃 활성화를 ?...

세포 내 무료 칼슘 2 + ([칼슘 2 +] I) (검토를 위해 Stutzmann과 맛 토손 1 참조)와 같은 신경, 심장, 골격 및 평활근과 같은 흥분 세포에서 여러 세포 기능을 조절하는 다양하고 중요한 보조 메신저입니다. 근질 세망 (SR) 및 T-세관 사이에 칼슘 2 + 동원 및 크로스 토크 (cross-talk)를 규제 (TT) 멤브레인은 근육 생리학의 기본 레귤레이터이다. 또한, 칼슘 2 + 신호의 변화는 다양한 근육 질환의 수축 기능 장애의 기본 메커니즘으로 표시했다. 칼슘 2 + 불꽃이 근질 세망 (SR) 막에 대한 ryanodine 수용체 (RYR) 채널의 오프닝에서 발생하는 초등학교 칼슘 2 + 출시 이벤트를 지역화됩니다. 심장 근육에, 불꽃은 칼슘 2 +에 의한 칼슘 + RELE으로 RyR2 채널의 개방을 통해 자발적으로 발생ASE (CICR) 메커니즘 3-5. 골격근에서 RyR1 엄격히 TT 멤브레인 6,7에서, 전압 센서에 의해 제어된다. 그대로 골격 근육 섬유의 휴식 조건에 따라서 칼슘 2 + 불꽃이 억제되어 거의 검출되지. + 골격 근육 8,9 검출 할 이벤트를 촉발를 최근까지, 필요한 sarcolemmal 막은 RyR1의 전압 센서의 억제를 풀다하기 위해 다양한 화학 물질 또는 기계 &quot;스키닝&quot;방법에 의해 중단 될 수 및 칼슘 허용. 하나의 방법은 이전에 사포닌 세제 (10)에 의해 근육 섬유의 멤브레인의 필수 permeabilization을 설명했다. 2003 년, 우리는 과도 hypoosmotic 스트레스 또는 고 삼투압 스트레스 중 하나는 2 +은 그대로 근육 섬유 (11)의 sarcolemmal 막에 인접한 불꽃 주변 칼슘을 유도 할 수 있다는 것을 발견했다. 이 방법은 이후 칼슘 2 +의 분자 메커니즘 및 변조를 연구하도록 수정되었습니다 </suP&gt; 출시 및 역학 12-16. 여기에서 우리는 그대로 골격 근육에있는 칼슘 2 + 불꽃의 유도, 탐지 및 분석을위한 우리의 실험 방법의 세부 사항을 설명합니다. 우리는 또한 골격 근육, 예를 들어 불꽃 주파수와 진폭 RYR 채널의 개방 가능성을 반영 (Δ F/F0, 개별 칼슘 2 + 불꽃의 원소 속성을 정량화하는 데 사용할 수있는 우리의 맞춤형 스파크 분석 프로그램을 제시하고 SR 내부의 칼슘 2 +로드), 피크 시간 (상승 시간) 및 기간 (FDHM, 스파크의 절반 최대 진폭의 전 기간)뿐만 아니라, 칼슘 2 + 불꽃의 공간적 분포. 또한, 우리는 근육 퇴행 위축과 근 위축성 측삭 경화증과 같은 골격 근육의 다양한 병태 생리 학적 상태에 칼슘 2 + 불꽃을 변경 링크 증거를 제시한다. 이 기술의 장점은 상대적 undam에서 칼슘 2 +를 측정하는 능력을 포함대신, 근육 섬유가 벗겨진 생리적으로 조건에서 기록의 Ca 2 + 불꽃 가까이 허용의 세 세포. 또한, 우리의 맞춤 설계 프로그램은 근육 섬유 관련하여 불꽃의 특성을보다 정확하게 계산을 제공합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="790">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Dissecting microscope</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:367px;">Dissect out fibers and check muscle integrity</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Dissection tools -scissors, and fine tip forceps</td>
			<td style="width:111px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:195px;">Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>DOW CORNING</td>
			<td style="width:119px;">184 SIL ELAST KIT</td>
			<td style="width:367px;">&#160;Make ahead of time for fiber dissection. Mix 5 ml liquid Sylgard components and pour into a 60-mm glass Petri dish and waiting 48 hr to let the Sylgard compound become clear, colorless solid substrate.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60-mm glass petri dish&#160;</td>
			<td style="width:111px;">Pyrex</td>
			<td style="width:119px;">3160</td>
			<td>Fiber dissection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isotonic Tyrode Solution&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Minimal Ca2+ Tyrode Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hypotonic Tyrode Solution&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">collagenase type I&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C-5138</td>
			<td>Fiber digestion&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Fluo-4 AM&#160;</td>
			<td style="width:111px;">Invitrogen</td>
			<td>F14201</td>
			<td>Fluorescent Ca2+ imaging dyes&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TMRE</td>
			<td style="width:111px;">Invitrogen</td>
			<td>T669</td>
			<td>mitochondrial membrane potential fluorescent dyes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Delta TPG dishes&#160;</td>
			<td>Bioptechs</td>
			<td style="width:119px;">0420041500C</td>
			<td>35 mm glass bottom dish for imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Spark Fit software</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>data analysis software</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:195px;">Radiance 2100 laser scanning confocal microscope or equivalent microscope</td>
			<td style="width:111px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">3 axis micromanipulator</td>
			<td style="width:111px;">Narishige International</td>
			<td style="width:119px;">MHW-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">temperature controllable orbital shaker</td>
			<td style="width:111px;">New Brunswick scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Fiber dissociation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of calcium sparks in intact skeletal muscle fibers

항상성 칼슘 2 + 신호를 유지하는 것은 살아있는 세포의 기본적인 생리적 과정이다. 칼슘 2 + 불꽃은 매우 근질 세망 (SR) 막에 채널을 해제 + (RYR) CA ryanodine 수용체에 의해 매개되는 칼슘 2 + 출시 이벤트 2를 지역화 나타나는 가로 무늬 근육 섬유에 신호 + 칼슘의 기본 단위입니다. 적절한 평가 근육의 칼슘 2 + 불꽃 건강하고 병에 걸린 줄이있는 근육의 세포 내 칼슘 2 + 처리 특성에 대한 정보를 제공 할 수 있습니다. 칼슘 2 + 이벤트는 일반적으로 휴면 심근 볼 수있는 불꽃 있지만, 그들은 거의 골격근 섬유 휴식에서 관찰되며, 따라서 골격근 섬유에서 스파크를 생성하고 분석하는 방법에 대한 필요성이있다. 여기에 상세한 F를 사용하여 격리 된 굴근 digitorm 브레비스 (FDB) 근육 섬유에 칼슘 2 + 불꽃을 측정하기위한 실험 프로토콜입니다luorescent 칼슘 2 + 인 지표 및 레이저 스캐닝 공 초점 현미경. 이 방법에서는, 고립 된 FDB 섬유는 등장 성 생리 솔루션에 반환 한 다음 과도 hypoosmotic 스트레스에 노출되어 있습니다. 이러한 조건에서, 강력한 칼슘 2 +는 응답이 젊은 건강한 FDB 근육 섬유 소재 sarcolemmal 막에 인접한 감지 불꽃. 변경된 칼슘 2 +는 응답이 이영 또는 세 골격 근육 섬유에서 검출 불꽃. 이 방법은 최근에 막 분리 된 신호 이노시톨 사이의 크로스 토크 (cross-talk) (1,4,5)-삼인산 수용체 (IP 3 R)와 관련된 것을 증명하고 RYR 캘리포니아 골격근 2 + 불꽃의 활성화에 기여한다. 요약하면, 삼투압 스트레스를 사용하여 우리의 연구는 칼슘을 유도 2 + 불꽃이 세포 내 반응은 근육 생리학 메커니즘을 신호와 마우스 근육 영양 장애의 모델 (MDX 마우스) 또는 근 위축성 측삭 경화증 (ALS 모델 포함 / 질병 상태, 노화를 반영하는 것으로 나타났다).

이전 연구는 과도 hypoosmotic 스트레스 + 주변 칼슘 11. 그림 1은 부드러운 sarcolemmal 막과 특성 분명 줄무늬와 그대로 하나의 근육 섬유의 이미지를 보여줍니다 그대로 근육 섬유의 sarcolemmal 막에 인접한 2 불꽃에 의한 것으로 나타났다. 그림 2는 전형적인 칼슘 2 + 표시 (XY 이미지) 불꽃은 젊고 건강한 쥐에서 FDB 근육 섬유를 팽윤 hypoosmoti...

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Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

직접 칼슘 불꽃을 측정하는 방법이 여기에 설명, 칼슘 2 +의 기본 단위는 그대로 골격 근육 섬유의 근질 세망에서 놓습니다. 이 방법은 고립 된 근육 섬유의 ryanodine 수용체에서 칼슘 2 + 릴리스의 삼투 스트레스 매개 트리거를 사용합니다. 역학과 내 Ca 2 + 신호 전달의 항상성 용량은 건강과 질환에서 근육 기능을 평가하기 위해 사용될 수있다.

칼슘의 평가는 그대로 골격 근육 섬유에서 불꽃

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

assessment-of-calcium-sparks-in-intact-skeletal-muscle-fibers

Research

JoVE Journal

Biology

15.0K 조회수.  The Ohio State University Wexner Medical Center.  직접 칼슘 불꽃을 측정하는 방법이 여기에 설명, 칼슘 2 +의 기본 단위는 그대로 골격 근육 섬유의 근질 세망에서 놓습니다. 이 방법은 고립 된 근육 섬유의 ryanodine 수용체에서 칼슘 2 + 릴리스의 삼투 스트레스 매개 트리거를 사용합니다. 역학과 내 Ca 2 + 신호 전달의 항상성 용량은 건강과 질환에서 근육 기능을 평가하기 위해 사용될 ?...

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Respirometric Oxidative Phosphorylation Assessment in Saponin-permeabilized Cardiac Fibers

Investigation of mitochondrial function represents an important parameter of cardiac physiology as mitochondria are involved in energy metabolism, oxidative stress, apoptosis, aging, mitochondrial encephalomyopathies and drug toxicity. Given this, technologies to measure cardiac mitochondrial function are in demand. One technique that employs an integrative approach to measure mitochondrial function is respirometric oxidative phosphorylation (OXPHOS) analysis.
The principle of respirometric OXPHOS assessment is centered around measuring oxygen concentration utilizing a Clark electrode. As the permeabilized fiber bundle consumes oxygen, oxygen concentration in the closed chamber declines. Using selected substrate-inhibitor-uncoupler titration protocols, electrons are provided to specific sites of the electron transport chain, allowing evaluation of mitochondrial function. Prior to respirometric analysis of mitochondrial function, mechanical and chemical preparatory techniques are utilized to permeabilize the sarcolemma of muscle fibers. Chemical permeabilization employs saponin to selectively perforate the cell membrane while maintaining cellular architecture.
This paper thoroughly describes the steps involved in preparing saponin-skinned cardiac fibers for oxygen consumption measurements to evaluate mitochondrial OXPHOS. Additionally, troubleshooting advice as well as specific substrates, inhibitors and uncouplers that may be used to determine mitochondria function at specific sites of the electron transport chain are provided. Importantly, the described protocol may be easily applied to cardiac and skeletal tissue of various animal models and human samples.

Saponin-permeabilized fiber preparation in conjunction with respirometric oxidative phosphorylation analysis provides integrative assessment of mitochondrial function. Mitochondrial respiration in physiological and pathological states can reflect various regulatory influences including mitochondrial interactions, morphology and biochemistry.

사포닌 - permeabilized 심장 섬유에 Respirometric 산화 인산화 평가

Investigation of mitochondrial function represents an important parameter of cardiac physiology as mitochondria are involved in energy metabolism, ...

연구

생물학

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

라이브 세포의 저장소로 작동하는 칼슘 항목의 형광 기반의 측정 : 교양 암 세포에서 골격근 섬유에

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, fatigability, and recovery after fatigue can be obtained to assess specific aspects of the excitation-contraction coupling (ECC) process such as excitability, contractile machinery and Ca2+ handling ability. This method removes the nerve and blood supply and focuses on the isolated skeletal muscle itself. We routinely use this method to identify genetic components that alter the contractile property of skeletal muscle though modulating Ca2+ signaling pathways. Here, we describe a newly identified skeletal muscle phenotype, i.e., mechanic alternans, as an example of the various and rich information that can be obtained using the in vitro muscle contractility assay. Combination of this assay with single cell assays, genetic approaches and biochemistry assays can provide important insights into the mechanisms of ECC in skeletal muscle.

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

We describe a method to directly measure muscle force, muscle power, contractile kinetics and fatigability of isolated skeletal muscles in an in vitro system using field stimulation. Valuable information on Ca2+ handling properties and contractile machinery of the muscle can be obtained using different stimulating protocols.

절연 골격근의 수축성, Fatigability 및 Alternans의 예 VIVO 평가

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential centrifugation at low- and high-speed is commonly used to isolate mitochondria from tissues and cultured cells. Crude mitochondrial fractions obtained by differential centrifugation are used for respirometry measurements. The differential centrifugation technique is based on the separation of organelles according to their size and sedimentation velocity. The isolation of mitochondria is performed immediately after tissue harvesting. The tissue is immersed in an ice-cold homogenization medium, minced using scissors and homogenized in a glass homogenizer with a loose-fitting pestle. The differential centrifugation technique is efficient, fast and inexpensive and the mitochondria obtained by differential centrifugation are pure enough for respirometry assays. Some of the limitations and disadvantages of isolated mitochondria, based on differential centrifugation, are that the mitochondria can be damaged during the homogenization and isolation procedure and that large amounts of the tissue biopsy or cultured cells are required for the mitochondrial isolation.

Here, a quadriceps muscle specimen is taken from an anaesthetized pig and mitochondria are isolated by differential centrifugation. Then, the respiratory rates of mitochondrial respiratory chain complexes I, II and IV are determined using high-resolution respirometry.

고해상도 호흡율 측정을위한 차동 원심 분리에 의한 골격근에서 본래 미토콘드리아의 분리

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

High-Throughput Contractile Measurements of Hydrogel-Embedded Intact Mouse Muscle Fibers Using an Optics-Based System

In vitro cell culture is a powerful tool to assess cellular processes and test therapeutic strategies. For skeletal muscle, the most common approaches involve either differentiating myogenic progenitor cells into immature myotubes or the short-term ex vivo culture of isolated individual muscle fibers. A key benefit of ex vivo culture over in vitro is the retention of the complex cellular architecture and contractile characteristics. Here, we detail an experimental protocol for the isolation of intact flexor digitorum brevis muscle fibers from mice and their subsequent ex vivo culture. In this protocol, muscle fibers are embedded in a fibrin-based and basement membrane matrix hydrogel to immobilize the fibers and maintain their contractile function. We then describe methods to assess the muscle fiber contractile function using an optics-based, high-throughput contractility system. The embedded muscle fibers are electrically stimulated to induce contractions, after which their functional properties, such as sarcomere shortening and contractile velocity, are assessed using optics-based quantification. Coupling muscle fiber culture with this&#160;system allows for high-throughput testing of the effects of pharmacological agents on contractile function and ex vivo studies of genetic muscle disorders. Finally, this protocol can also be adapted to study dynamic cellular processes in muscle fibers using live-cell microscopy.

Skeletal muscle function can be assessed by quantifying the contractility of isolated muscle fibers, traditionally using laborious, low-throughput approaches. Here, we describe an optics-based, high-throughput method to quantify the contractility of hydrogel-embedded muscle fibers. This approach has applications for drug screening and therapeutic development.

광학 기반 시스템을 사용한 하이드로겔 내장 온전한 마우스 근육 섬유의 고처리량 수축 측정

In vitro cell culture is a powerful tool to assess cellular processes and test therapeutic strategies. For skeletal muscle, the most common approaches ...

Native Skeletal Muscle Cells의 기능적 부위 지정 형광 측정법(Functional Site-Directed Fluorometry in native Skeletal Muscle Cells)

Functional Site-Directed Fluorometry in Native Cells to Study Skeletal Muscle Excitability

Functional site-directed fluorometry has been the technique of choice to investigate the structure-function relationship of numerous membrane proteins, including voltage-gated ion channels. This approach has been used primarily in heterologous expression systems to simultaneously measure membrane currents, the electrical manifestation of the channels&#39; activity, and fluorescence measurements, reporting local domain rearrangements. Functional site-directed fluorometry combines electrophysiology, molecular biology, chemistry, and fluorescence into a single wide-ranging technique that permits the study of real-time structural rearrangements and function through fluorescence and electrophysiology, respectively. Typically, this approach requires an engineered voltage-gated membrane channel that contains a cysteine that can be tested by a thiol-reactive fluorescent dye. Until recently, the thiol-reactive chemistry used for the site-directed fluorescent labeling of proteins was carried out exclusively in Xenopus oocytes and cell lines, restricting the scope of the approach to primary non-excitable cells. This report describes the applicability of functional site-directed fluorometry in adult skeletal muscle cells to study the early steps of excitation-contraction coupling, the process by which muscle fiber electrical depolarization is linked to the activation of muscle contraction. The present protocol describes the methodologies to design and transfect cysteine-engineered voltage-gated Ca2+ channels (CaV1.1) into muscle fibers of the flexor digitorum brevis of adult mice using in vivo electroporation and the subsequent steps required for functional site-directed fluorometry measurements. This approach can be adapted to study other ion channels and proteins. The use of functional site-directed fluorometry of mammalian muscle is particularly relevant to studying basic mechanisms of excitability.

저자 스포트라이트: 골격근 흥분성을 연구하기 위한 Native Cells의 기능적 부위 지정 형광 측정법  

Functional site-directed fluorometry is a method to study protein domain motions in real time. Modification of this technique for its application in native cells now allows the detection and tracking of single voltage-sensor motions from voltage-gated Ca2+ channels in murine isolated skeletal muscle fibers.

골격근 흥분성을 연구하기 위한 천연 세포의 기능적 부위 지정 형광 측정

Functional site-directed fluorometry has been the technique of choice to investigate the structure-function relationship of numerous membrane proteins, ...

탈세포화(decellularization)를 통한 골격근 지방 침투의 정량화

Decellularization-Based Quantification of Skeletal Muscle Fatty Infiltration

Fatty infiltration is the accumulation of adipocytes between myofibers in skeletal muscle and is a prominent feature of many myopathies, metabolic disorders, and dystrophies. Clinically in human populations, fatty infiltration is assessed using noninvasive methods, including computed tomography (CT), magnetic resonance imaging (MRI), and ultrasound (US). Although some studies have used CT or MRI to quantify fatty infiltration in mouse muscle, costs and insufficient spatial resolution remain challenging. Other small animal methods utilize histology to visualize individual adipocytes; however, this methodology suffers from sampling bias in heterogeneous pathology. This protocol describes the methodology to qualitatively view and quantitatively measure fatty infiltration comprehensively throughout intact mouse muscle and at the level of individual adipocytes using decellularization. The protocol is not limited to specific muscles or specific species and can be extended to human biopsy. Additionally, gross qualitative and quantitative assessments can be made with standard laboratory equipment for little cost, making this procedure more accessible across research laboratories.

저자 스포트라이트: 골격근 지방 침투의 탈세포화 기반 정량화  

The present study describes decellularization-based methodologies for visualizing and quantifying intramuscular adipose tissue (IMAT) deposition through intact muscle volume, as well as quantifying metrics of individual adipocytes that comprise IMAT.