NIH P40 OD010952, Korein 재단, SLC 마이애미 원정대의 대학과 공격력 MAYTAG 휄로우 십. 저자는 기꺼이 군소뿐만 아니라, 로렌 Simonitis과 그림에 대한 현미경을 제공 한나 펙을위한 국가 자원의 직원을 인정합니다.

1. 세포의 준비 <ol><li> 1 일에, 무게와 동물을 마취. <ol><li> 30 G-1kg 동물의 무게. 등장 MgCl : 1시 1분 해수의 5-10 동물의 볼륨을 마취. 이러한 연결 airstone와 전기 수족관 공기 펌프로 통기와 함께 1 시간 동안 6H 2 0. </li></ol></li><li> 해부 용품을 준비합니다. <ol><li> 같은 패브릭 핀으로 스테인레스 스틸 직선 핀, 깨끗 해부 트레이를 조립합니다. + 페니실린 / 스트렙토 마이신 (P / S). 여러 배양 인공 해수를 포함하는 요리 (표 1 및 3 참조 ASW)을 조립 </li><li> 준비 저전력 현미경이있다. 깨끗한 절개 악기와 같은 늑골이있는 코와 미세 수술 집게로 준비하고, 정밀하고 큰 수술 가위있다. 사용하기 전에 70 % isopropol 알코올과 악기를 스프레이하고 건조 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 절개 트레이에 위치 동물입니다. <ol><li> 절개 트레이에 위치 동물의 복부 측면 아래로. 핀 동물신체 벽 parapodial 테두리 만 등의 표면을 노출, 꼬리와 머리를 방지하고 성기 홈의 가장자리를 통해 </li><li> 실행 속도가 느린 차가운 수돗물 등의 표면을 씻어. 성기 홈을 따라 스퀴즈 병 및 머리의 정상에 70 % isopropol 알코올의 빛 스트림을 적용합니다. </li></ol></li><li> 초기 절개를합니다. <ol><li> 얕은을 자르기에있는 동안 저전력 현미경을 사용하여 (표 2 참조) 성기 홈이 전방 쉘 여백에서 유래 점을 관찰 할 수 빛의 반사, tautly, 늑골 코 집게이 원점의 왼쪽에 조직의 배 홀드 잘 각도 가위로 성기 홈의 오른쪽에 몸을 벽의 부드럽고 평평한 지역을 통해 모든 방법을 구멍입니다. </li><li> 혈 림프는 때때로 그것으로 복부 신경절과 위장을 들고 구멍에서 부어 관찰해야한다. </li></ol></li><li> 절개를 확장합니다. <ol><li> 일을 확장하는 큰 가위를 사용하여전방 rhinophores 사이의 지점에 전자 절개, 낮은 블레이드 위쪽으로 당기면서하면 직감을 새김 눈 방지 할 수 있습니다. 내부 장기를 절개 밖으로 유출 관찰됩니다. </li></ol></li><li> 신경을 제거합니다. <ol><li> 트레이를 옮기고 머리 지역에 현미경을 재조명. </li><li> 깨끗한 포셉 및 미세 가위를 사용하여 한 지점에서 그룹으로 흉막 페달과 대뇌 신경을 제거하는 식도 주위에 반지에 머리 신경절을 형성하는 신경을 절단하는으로 머리 신경절을 제거합니다. </li><li> 식도의 복부 측면을 준수 구강 신경절을 제거합니다. </li><li> 이 신경절에서 4 큰 신경 접속사가 문제를 절단하여 복부 신경절을 제거합니다. </li></ol></li><li> 관심 신경절을 분리합니다. <ol><li> 신경절의 최소 직경과 동일합니다 그 각각의 신경절에 연결 접속사의 길이를 떠나, 떨어져 머리를 신경 트림,이 효소 지체 과다 소화다음 단계에 대한 관심의 세포. </li><li> ASW의 2 헹굼 + 깨끗한 포셉 린스 간 이동 P / S를 통해 각 대상 신경절을 넣어. </li><li> PVC 세포를 대상으로하는 경우, 오른쪽 페달 hemiganglion에 연결된 오른쪽 흉막 hemiganglion을두고 마찬가지로 왼쪽 페달 hemiganglion에 연결된 왼쪽 흉막 hemiganglion을 둡니다. </li><li> 불필요한 신경 및 허용 연구 방법에 따라 동물의 나머지를 버린다. </li></ol></li><li> 효소 신경을 소화. <ol><li> 각 신경절의 경우, 3.75 MG 디스 파제 (dispase), 1 밀리그램 히알루 및 ASW의 ML 당 0.3 g 콜라 유형 XI로 구성된 효소 용액 1 ㎖를 준비하고 15 ML의 폴리 프로필렌 원뿔 튜브 + P / S. </li><li> 장소는 효소 용액에 신경을 씻어서 뚜껑을 꼭 부착합니다. 약 23에서 하룻밤 13-5 시간 동안 느린 속도로 회전하는 셰이커 (표 2 참조)에 자사의 측면에 튜브를 놓습니다 ° C (실내 온도). </li></ol></li><li> 준비배양 접시. <ol><li> microdissection을하기 전에 (2 일), 폴리-D-라이신 (PDL) 코팅 조직 문화 후드에서 배양 접시를 준비합니다. ~ 25 분 35 밀리미터 접시의 중앙에 ~ 0.5 ML PDL를 (0.2 ㎎ / 멸균 ml의 물)를 추가합니다. </li><li> 멸균 물을 3 배 PDL을 씻어. 건조하도록 허용합니다. 접시를 UV-소독. </li></ol></li><li> 하루에 2 뉴런을 분리합니다. <ol><li> PDL 코팅과 달리 건조 그릇 안에 미디어의 섬을 만들 ASW + P / S의 약 0.5 ml의 살균 UV 있었다 35mm 요리의 중심을 입력합니다. 이 조직 문화 후드 외부 벤치에 수행 할 수 있습니다. 한 접시 hemiganglion에서 발생하는 각 셀의 클러스터에 대해 준비를해야합니다. </li><li> 실 가드 코팅에 의해하고 (표 3 참조) 핀 및 프로브로 사용되는 여러 가지 크기의 미세 해부 핀으로 장착 5mm 깊이 해부 표면을 경화 준비 100 mm 직경 해부 접시가있다. ASW와 + P / S, 그리고 마지막으로 인터넷 다음, 70 % isopropol의 알코올이 요리를 씻어그것은 ASW + P / S로 어떠냐 </li></ol></li><li> 소화 신경의 microdissection을 준비합니다. <ol><li> 해부 접시에 소화 흉막 페달 및 구강 신경절을 포함하는 효소 용액을 붓는다. </li><li> 반사 조명 아래 검은 색 표면에 대한 현미경의 무대에서 접시를 놓습니다. </li><li> 첨부 된 결합 조직을 사용하여 각 흉막 페달 hemiganglion의 등쪽면을 아래로 핀. 조직 부드러운 스트레칭의 관용 될 것입니다. </li></ol></li><li> PVC 신경을 Microdissect. <ol><li> 깨끗한 미세 집게 2 쌍을 사용하고 프로브 등 포셉 한 쌍의 미세 절개 핀을 들고, 흉막 hemiganglion에서 PVC 세포를 분리. 효소 분해 제거 또는 PVC 클러스터를 덮고있는 결합 조직 칼집 떨어져 깨진, 아직 세포가 서로를 준수 할 것. </li><li> 페달 흉막 결합 18에서 이러한 세포를 분리하기 위해 프로브를 사용하여, 다음 해부의 바닥에 세포 클러스터 떨어지게요리. </li></ol></li><li> 문화 요리에 신경을 전송합니다. <ol><li> 부드럽게 공기 방울을 도입하지 않도록주의하고, 그 문화 접시에 매체 섬으로 천천히 분배, 약간 불 광택 일회용 유리 파스퇴르 피펫의 끝으로 클러스터를 빨아들이 준비한 35mm 배양 접시에 세포 클러스터 전송 피펫으로. 별도의 배양 접시에 다른 hemiganglion과 장소의 PVC 클러스터의 분리를 반복합니다. </li></ol></li><li> BSC 신경을 Microdissect 및 전송할 수 있습니다. <ol><li> 관심의 세포를 절약하는주의 최대 구강 신경절 복부 측면을 핀. 구강 신경절 (10)의 2 BSC 세포 클러스터와 단계 1.12를 반복합니다. </li><li> PVC 클러스터를 포함하는 BSC 클러스터와 2 요리를 포함하는 2 요리 : PVC와 BSC 뉴런의 분리는 신경 세포의 클러스터를 포함하는 4 배양 접시를 생성합니다. 신경의 나머지를 삭제하고 100mm 해부 접시를 따로 설정할 수 있습니다. </li></ol></li><li> Dissoc세포 클러스터를 늦. <ol><li> 저전력 현미경의 무대에 세포를 포함하는 배양 접시를 놓고 덮개를 제거합니다. </li><li> 부드럽게 포셉에서 개최 미세 해부 핀 세포 클러스터에 인접한 문화 접시의 바닥을 쓸어 PVC 클러스터를 떼어 놓다. 가볍게 치기는하지만 플라스틱의 반점을 찾아 내려고 노력으로 접시의 바닥의 플라스틱으로 핀의 끝을 파고있다. 플라스틱 마찰 핀 포인트를 놓을 때, 타악기 파가 떨어져 세포의 근처의 덩어리를 나누기 매체를 통해 생산됩니다. </li><li> 5-10 제스처는 거의 완전히 세포를 떼어 놓다 필요하지만 세포가 기계적 깎아 지른듯한 의해 파괴되지 않도록 너무 가볍게하기보다는 세포의 작은 클러스터를두고하는 것이 좋습니다 수 있습니다. </li><li> 커버 및 기타 문화 요리와 함께 반복을 대체합니다. </li></ol></li><li> 세포 배양을 저장합니다. <ol><li> 해리 세포의 가운데에있는 미디어 제도를 포함하는 배양 접시에 배치같은 150 × 25 mm 둥근 플라스틱 페트리 접시로 공기 순환을 허용하고 17 ° C.에 보육 세트에이 접시를 놓고 대형 컨테이너 </li><li> 챔버 습도의 소스로 물을 오픈 접시를 설치합니다. 하룻밤 그대로 둡니다. 세포는 접시의 중앙에있는 폴리 - D - 라이신 코팅을 준수합니다. </li></ol></li><li> 홍수 문화 요리. <ol><li> 3 일에 조심스럽게 ASW의 2.5 ML를 요리 홍수 + P / S. 검사 및 역 세포 배양 현미경을 사용하여 세포를 계산합니다. 17 ° C 배양기에있는 상점. </li></ol></li></ol> 2. 전기 생리학 방법은 (예를 들어 Sakmann 및 Neher, 1995) 수많은 텍스트에 16을 설명했습니다 그 죄는 표준 패치입니다. 이 프로토콜은 세포 ≤ 100 PF 커패시턴스, 또는 셀 &lt;프로토콜의 일 3, 4시 60 μm의 직경을 작동합니다. 프로세스가없는 세포는 녹음에 최적입니다. 다음과 같은 특별한 considerat이온이 적용됩니다 : <ol><li> 큰 세포는 β = 0.1로 설정 Axopatch 200B 앰프의 구성 설정을 수용 할 수 있습니다. 매우 큰 전류의 활성화는 세포 전압 클램프를 탈출하는 원인이 될 수 있습니다. ASW 솔루션 (불 침투성 N-메틸-D-글루 카민 염화로 치환 된 염화나트륨의 예를 들어 분수) 소금 함량을 대체 전체 셀 전류 진폭을 줄일 수 있습니다. </li><li> 피펫 풀러를 뽑아 KCl을 다른 소금 450 ​​밀리미터 (표 1 참조)으로 구성된 세포 내 용액 (ICS)와 중간 채워질 섬유 채워진 붕규산 패치 피펫가 적합하며, 약 0.5 mOhms 온 저항이 있어야합니다. 특정 이온 전류의 차단이 필요한 경우, 예를 들어, 나는 + K 전류, K +이 솔루션의 부재에서 전류와 같은 고사 + 등의 이온으로 대체 될 수 있습니다. CL - 더 자연 ICS가 필요한 경우 impermeant 음이온와 ICS의 교환도 보증9. </li><li> 세포는 실온에서 가능&gt; 1 시간 - 긴 녹음과 강력한입니다. 기록 문화의 24-48 시간에 해당하는 일 3 프로토콜의 4 최적입니다. 48 시간 후 어려움 때문에 세포 표면에 glycocalyx의 정교화, 아마 기가 옴 물개를 형성하고, 공정 부산물에 의한 공간 클램프 문제가있다. 세포는 &lt;14 D에 완료 할 수 있습니다와 같은 독극물과 같은 비 패치 클램프 연구를위한 유용한, 그러나이다. </li><li> ASW와 다른 솔루션 중력 공급 솔루션 장치에서 분배 할뿐만 아니라, 세포 내 솔루션을 통해 필터링해야 기가 옴 씰 형성을 방해 미세 입자를 제거하기 위해 0.2 μm의 Acrodisk 필터 (표 3) 주사기 장착. </li><li> 같은 D-아스파 라진 산염 (D-ASP)를 같은 작용제를 사용하는 경우 탈감작이 발생하므로 작용제의 응용 프로그램 사이에 1-2 분 ~를 추천합니다. 반대로, 상승 작용은 종종 신속하게 반복 응용과 관찰이러한 L-글루타민산 (L-글루) 등의 작용제의 양이온. </li><li> 이러한 L-글루 등의 작용제 작동 전류는 picospritzer 피펫 작용제를 적용하여 공부하실 수 있습니다. 이 피펫은 패치 피펫과 동일하게 뽑아 ASW의 작용제를 포함합니다. 이 피펫 팁 중력 공급 솔루션 장치의 유출 파이프 아래에 위치하며, 유출 관 (그림 2F)에서 45 ° 각도로 작용제를 신속하게 셀에서 씻겨되며, 탈감작을 최소화 할 때. 작용제 피펫은 90 ° 또는 패치 피펫에 더 상대의 각도를 만들어야합니다. </li></ol>

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저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

분리 기술은 아교 및 기타 미확인 세포의 작은 숫자와 함께 산재 50-100 고립 된 뉴런을 포함하는 감각 신경 세포의 배양을 얻을 여기에 설명. 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 신경 효소 용액에 남아있는 시간이며, 개별 세포로 클러스터를 분열하는 소화 세포 클러스터의 분리를 가볍게 치는. 효소 소화 (단계 1.8) 사용 가능 온도에서 최적화해야합니다. 23 천천히 흔들어 ° C, 13 시간은 BSC 클러스터...

해양 opistobranch 연체 동물, 군소은 수십 년 동안 유용하게 신경 생물학 모델이다. 그것은 가장 이니와 고전적 조건 7, 8의 모델로 알려져 있습니다. 이 모델의 학습과 기억에 대한 연구는 그가 Arvid Carlsson의 폴 Greengard 10과 공유 상에 에릭 칸델 Eric R. Kandel을 위해 2000 년에 생리학 또는 의학에 노벨상을 수상했다. 감소 준비에서 전기 녹음과 관련된 연구는, 어떤이 무척추 동물의 신경계의 요소는 신경과 동물에서 해부와 근육이 부착 군소의 개별 뉴런의 역할을 명료 도움이 떠났다. 군소 학습 구성 정확한 분자 메커니즘의 식별하지만, 종종 개별 기증자 동물의 하나 하나를 얻은 또 다른 기술, 장기 감각 신경 세포의 공동 문화와 motoneuron을 고용하고 배양 접시 21 시냅스를 형성 할 수 . 우리는 다른 사람 1, 3, 6, 14, 15, 16 신경이 명목상으로 균일 한 뉴런의 클러스터 해리 단기 문화를 만들기 위해 장기 실험에서뿐만 아니라 자신의 인내로이 모델에서 타겟팅 할 수 있습니다 발견되는 용이성을 악용 한 하는 우리는 패치 클램프 구성에서 전압 클램프에서 이온 전류를 공부합니다. 많은 군소 뉴런은 오랫동안 실험 조작을위한 시간을 허용하는 클램핑 패치의 반복 라운드까지 서있다. 이 기술은 같은 복부 신경절의 neurosecretory 가방 세포와 분리 우리가 설명 흉막 및 구강 신경의 감각 신경으로 신경 유용합니다,하지만 매우 큰 뉴런&gt; 60 μm의 같은 L7으로 직경 또는 R2 복부 신경절. 우리는 다른 설명 감각 - motoneuron 공동 배양과는 달리, 우리의 문화에서 군소 혈청을 사용하지 않습니다. 이 절차를 사용하여 얻은 대부분의 뉴런은 t에 대한 프로세스없이됩니다그는 전체 셀 전압 녹화를 촉진 문화의 첫 48 시간,하지만 그 새싹과 영양분 및 / 또는 성장 인자의 부족으로 사망하기 전에 약 14 일 동안 축삭과 다른 프로세스를 자세히 설명합니다. 이 기술은 구강 및 흉막 신경의 생리적 문서화 지역의 접시 당 50-100 뉴런의 차 문화를 생산하고 있습니다. 이 프로토콜은 연구자들이 다양한 실험은 동물마다 복제 요구하는 실험에서 단일 세포 생리학의 여러 측면을 연구하는 데 유용합니다. 그것은 일치 처리 및 통제 문화에서 공부하는 혜택을 허용, 왼쪽과 오른쪽 hemiganglia에 표적 세포의 해부학 적 분리에 의한 문화의 일치하는 쌍을 생성합니다. 프로토콜은 구강 신경의 구강 S 클러스터 (BSC) 뉴런, 그리고 흉막 신경절의 흉막 ventrocaudal (PVC) 뉴런을 대상으로합니다. 이러한 세포는 전체 셀 전압 녹음 및 디스플레이 robus에 적절한 사이즈입니다T 글루타메이트 반응. 논의 방법론은 군소 신경계에있는 대부분의 신경에 적합합니다.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Artificial seawater ASW</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>assorted</td>
 <td>(mM): 417 NaCl, 10 KCl, 10 CaCl2 (2 H2O), 5MgCl2 (6H2O), 15 HEPES-NaOH, pH 7.6</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Intracellular solution</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>assorted</td>
 <td>(mM): 450 KCl, 2.9 CaCl2 (2 H2O), 2.5 MgCl2 (6 H2O), 5 Na2ATP, 10 EGTA, and 40 HEPES-KOH, pH 7.4</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Poly-D-lysine</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P6407</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>penicillin/streptomycin added to ASW at 1:100</td>
 <td>Lonzo Walkersville, Inc.</td>
 <td>17-603E</td>
 <td>5,000 Units/ml penicillin plus 5,000 mg/ml streptomycin</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Neutral dispase II</td>
 <td>Roche Diagnostics</td>
 <td>10165859001</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>hyaluronidase</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>H4272</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>collagenase type XI</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>C9407</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L-Glutamate (L-Glu)</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>49601-100G</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>D-Aspartate (D-Asp)</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>11200-10G</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>N-methyl-D-aspartate (NMDA)</td>
 <td>Biomol</td>
 <td>100002-268</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L-Asp</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A6683-25G</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>alpha-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid (AMPA)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A6816-5MG</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L-Glu R antagonists</td>
 <td>various</td>
 <td>various</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>agar</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>kynurenate</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>61250</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>APV</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A5282</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (NMDAR antagonist)</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2-propanol</td>
 <td>VWRSP</td>
 <td>BDH1133</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chloriding solution</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>assorted</td>
 <td>25 g FeCl3 + 25 ml concentrated HCl + 50 ml H2O</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sylgard silicone 2-part polymer</td>
 <td>World Precision Instruments (WPI)</td>
 <td>SYL184</td>
 <td>Provides pin-out surface for small dissection dishes</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0-40x zoom magnification microscope for dissections</td>
 <td>Wild</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Techniquip 150 Watts Fiber Optic Illuminator</td>
 <td>Microoptics of Florida</td>
 <td>TQ FOI-150</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RotoMix 50800 orbital mixer</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nikon Diaphot inverted phase-contrast microscope with 4x, 20x (optional) &amp; 40x objectives</td>
 <td>SR Research Ltd.</td>
 <td>Eyelink II</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tektronix digital oscilloscope</td>
 <td>SR Research Ltd.</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pClamp 10 data acquisition and analysis software</td>
 <td>Molecular Devices</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PC with Windows XP or higher operating system</td>
 <td>PC Solutions</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Thinkserver with solid state hard drives (80GB) and low noise monitors</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Flaming/Brown P87 micropipette puller</td>
 <td>Sutter Instruments, Novato, CA</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Axon Instruments Axopatch 200B clamp amplifier with a capacitance compensation range of 1-1000 pF; preamplifier</td>
 <td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Axon instruments electrode holder assembly for Axopatch 200B preamplifier</td>
 <td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA</td>
 <td>CV203BU</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Digidata 1200 A/D converter</td>
 <td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Picospritzer, powered by N2 adjustable for pressure and duration</td>
 <td>Parker Hannifin, Cleveland, OH</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TMC Micro-G Vibration isolation table</td>
 <td>Ametek</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Faraday cage</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>custom manufacture</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Burleigh Piezoelectric Clamshell Micromanipulators</td>
 <td>Burleigh Instruments; Thorlabs</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>presently PCS-5000; -6000 series + mounts</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Narishige M-152 manual manipulators (for perfusion system and picospritzer)</td>
 <td>Narishige USA</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Filament pipette glass,1.5 mm OD, 0.84 mm ID -</td>
 <td>WPI</td>
 <td>1B150-3</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>3 inch length</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ag/AgCl half cell</td>
 <td>WPI</td>
 <td>EP4</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon* Centrifuge Tubes</td>
 <td>VWRSP</td>
 <td>21008-918</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Angled Scissors</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>15006-09</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dumostar Fine forceps</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>11295-00</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>35 mm falcon tissue culture dishes</td>
 <td>VWRSP</td>
 <td>25382-064</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>falcon 150 x 25 mm tissue culture dishes; 1013</td>
 <td>VWRSP</td>
 <td>1013</td>
 <td>also can be made into small dissection dishes with sylgard</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>sylgard</td>
 <td>WPI</td>
 <td>SYL184</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>animal dissection tray</td>
 <td>various</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon</td>
 <td>VWRSP</td>
 <td>21008-918</td>
 <td>For 6-bore gravity-fed perfusion system</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Aluminum clips with screw hole ends</td>
 <td>hardware store</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>For perfusion system</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>23 gauge needles (manually file off points)</td>
 <td>VWRSP</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>For perfusion system</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Polyethylene tubing 0.022"ID x 0.042"OD; 427411</td>
 <td>Becton-Dickinson</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>For perfusion system</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>H-7 pipette stand/holder for microcap perfusion array</td>
 <td>Narishige USA</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>For perfusion system</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>one-way valves</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>For perfusion system</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Drummond Microcaps 1 &mu;l</td>
 <td>VWRSP</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>For perfusion system</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>18 gauge needles for suction (filed off points)</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Polyethylene tubing</td>
 <td>Cole Parmer</td>
 <td>4.27436E+11</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>fine dissection pins</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>26002-20</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>capillary tubes</td>
 <td>Kimble 71900-100</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>fire-polished and U-shaped in a Bunsen burner flame and filled with 3% agar in ECS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>modeling clay</td>
 <td>craft store</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>dish holder for microscope stage with isolated ground bath</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Custom manufacture</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pasteur pipettes</td>
 <td>VWRSP</td>
 <td>14672-412</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pipette bulbs</td>
 <td>VWRSP</td>
 <td>53283-911</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>acrodisk syringe filters</td>
 <td>VWRSP</td>
 <td>28144-040</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>thick-walled 1.5 mm diameter borosilicate filament glass</td>
 <td>WPI</td>
 <td>1B150F-3</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High purity nitrogen cylinder and bifurcating regulator</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
Tables 1-3. Lists of Reagents, Materials, and Equipment.

isolation of sensory neurons of aplysia californica for patch clamp recordings of glutamatergic currents

해양 복족류 연체 동물 군소 californica는 학습과 기억의 연구에서 특히 의미와 신경계 기능의 모델로 오래된 역사를 가지고 있습니다. 이러한 연구의 일반적인 준비는 감각과의 motoneurons은 최소한의 해부 동물에 그대로 유지 또는 개별 감각과의 motoneurons의 기술적 정교한 신경 세포 공동 배양되는 것입니다. 덜 일반적인 명목상 동종 신경의 작은 클러스터 단기 문화에 하나의 세포로 해리되는 격리 된 신경 세포의 준비입니다. 이러한 고립 된 세포 패치 클램프 기법, 이러한 컨덕턴스의 대상으로 변조를 사용하여 이온 전류의 생물 물리학 적 특성에 유용합니다. 이러한 문화를 준비하기위한 프로토콜이 설명되어 있습니다. 프로토콜은 흉막과 구강 신경절 쉽게 식별 글루타메이트 감각 뉴런을 활용하고, 그들의 분리와 최소한의 유지 보수를 설명 I혈청없이 며칠 동안 N 문화.

이 프로토콜에서 대상으로하는 신경에서 감각 신경의 위치는, BSC 및 PVC 뉴런은 그림 1에 표시됩니다. BSC의 뉴런은 구강 신경절, 그대로 신경절 (그림 1A)에서 구강 질량에서 멀리 얼굴 표면의 복부 측면에 2 대칭 타원형 클러스터에 있습니다. PVC 뉴런은 중앙 축 (그림 1B)쪽으로 흉막 신경의 등쪽 표면의 주위에 래핑하는 양측, V-모양의 클러스터를 형성합니다. ?...

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Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

우리는 해양 바다 토끼 신경계의 해부를 설명<em&gt; 군소</em&gt; 마취 후, 단기 - 조직 문화에 대한 신경과 패치 클램프 기법을 통해 단일 ​​셀 이온 전류의 녹음 격리.

의 감각 뉴런의 분리<em&gt; 군소 californica</em&gt; 글루타메이트 전류의 패치 클램프 녹음을위한

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

isolation-sensory-neurons-aplysia-californica-for-patch-clamp

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

12.2K 조회수.  University of Miami. 우리는 해양 바다 토끼 신경계의 해부를 설명 군소 마취 후, 단기 - 조직 문화에 대한 신경과 패치 클램프 기법을 통해 단일 ​​셀 이온 전류의 녹음 격리.

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Electrode Fabrication and Implantation in Aplysia californica for Multi-channel Neural and Muscular Recordings in Intact, Freely Behaving Animals

Recording from key nerves and muscles of Aplysia during feeding behavior allows us to study the patterns of neural control in an intact animal. Simultaneously recording from multiple nerves and muscles gives us precise information about the timing of neural activity. Previous recording methods have worked for two electrodes, but the study of additional nerves or muscles required combining and averaging the recordings of multiple animals, which made it difficult to determine fine details of timing and phasing, because of variability from response to response, and from animal to animal. Implanting four individual electrodes has a very low success rate due to the formation of adhesions that prevent animals from performing normal feeding movements. We developed a new method of electrode fabrication that reduces the bulk of the electrodes inside the animal allowing for normal feeding movements. Using a combination of glues to attach the electrodes results in a more reliable insulation of the electrode which lasts longer, making it possible to record for periods as long as a week. The fabrication technique that we describe could be extended to incorporate several additional electrodes, and would be applicable to vertebrate animals.

Electrode Fabrication and Implantation in Aplysia californica for Multi-channel Neural and Muscular Recordings in Intact, Freely Behaving Animals

A technique is described for implanting four in vivo electrodes to monitor the neuromuscular control of feeding behavior in Aplysia californica.

의 전극 제작 및 주입 Aplysia californica 손상, 자유롭게 행동 동물의 다중 채널 및 신경 근육질 레코딩을위한

Recording from key nerves and muscles of Aplysia during feeding behavior allows us to study the patterns of neural control in an intact animal.  ...

연구

신경과학

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

어두운 적응 슬라이스 준비에 마우스 망막 뉴런에서 패치 클램프 레코딩

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and learning and memory. There are four known families of PKC isoforms in vertebrates: classical PKCs (&alpha;, &beta;I, &beta;II and &gamma;), novel type I PKCs (&#949; and &eta;), novel type II PKCs (&delta; and &theta;), and atypical PKCs (&zeta; and &iota;). The classical PKCs are activated by Ca2+ and diacylclycerol (DAG), while the novel PKCs are activated by DAG, but are Ca2+-independent. The atypical PKCs are activated by neither Ca2+ nor DAG. In Aplysia californica, our model system to study memory formation, there are three nervous system specific PKC isoforms one from each major class, namely the conventional PKC Apl I, the novel type I PKC Apl II and the atypical PKC Apl III. PKCs are lipid-activated kinases and thus activation of classical and novel PKCs in response to extracellular signals has been frequently correlated with PKC translocation from the cytoplasm to the plasma membrane. Therefore, visualizing PKC translocation in real time in live cells has become an invaluable tool for elucidating the signal transduction pathways that lead to PKC activation. For instance, this technique has allowed for us to establish that different isoforms of PKC translocate under different conditions to mediate distinct types of synaptic plasticity and that serotonin (5HT) activation of PKC Apl II requires production of both DAG and phosphatidic acid (PA) for translocation 1-2. Importantly, the ability to visualize the same neuron repeatedly has allowed us, for example, to measure desensitization of the PKC response in exquisite detail 3. In this video, we demonstrate each step of preparing Sf9 cell cultures, cultures of Aplysia sensory neurons have been described in another video article 4, expressing fluorescently tagged PKCs in Sf9 cells and in Aplysia sensory neurons and live-imaging of PKC translocation in response to different activators using laser-scanning microscopy.

In this video, we demonstrate visualization of PKC translocation in living cells using fluorescently tagged PKCs.

Sf9 세포에서 Aplysia 감각 뉴런에서 PKC Translocation의 라이브 영상

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated from a variety of species have been described previously1-4 but this video represents the first application of those techniques to hair cells from zebrafish. Here we demonstrate a method to isolate healthy, intact hair cells from all of the inner ear end-organs: saccule, lagena, utricle and semicircular canals. Further, we demonstrate the diversity in hair cell size and morphology and give an example of the kinds of patch clamp recordings that can be obtained. The advantage of the use of this zebrafish model system over others stems from the availability of zebrafish mutants that affect both hearing and balance. In combination with the use of transgenic lines and other techniques that utilize genetic analysis and manipulation, the cell isolation and electrophysiological methods introduced here should facilitate greater insight into the roles hair cells play in mediating these sensory modalities.

The purpose of this video is to demonstrate procedures for obtaining healthy, intact hair cells from the inner ear organs of adult zebrafish and then using them for patch clamp studies aimed at characterizing the biophysical properties of their voltage-gated channels.

귀에 세포의 패치 클램프 녹음 절연 Zebrafish에서

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.
This extracellular technique has advantages. First, extracellular electrodes can stimulate and record neurons through the sheath5, so it does not need to be removed. Thus, neurons will be healthier in extracellular experiments than in intracellular ones. Second, if ganglia are rotated by appropriate pinning of the sheath, extracellular electrodes can access neurons on both sides of the ganglion, which makes it easier and more efficient to identify multiple neurons in the same preparation. Third, extracellular electrodes do not need to penetrate cells, and thus can be easily moved back and forth among neurons, causing less damage to them. This is especially useful when one tries to record multiple neurons during repeating motor patterns that may only persist for minutes. Fourth, extracellular electrodes are more flexible than intracellular ones during muscle movements. Intracellular electrodes may pull out and damage neurons during muscle contractions. In contrast, since extracellular electrodes are gently pressed onto the sheath above neurons, they usually stay above the same neuron during muscle contractions, and thus can be used in more intact preparations.
To uniquely identify motor neurons for a motor pool (in particular, the I1/I3 muscle in Aplysia) using extracellular electrodes, one can use features that do not require intracellular measurements as criteria: soma size and location, axonal projection, and muscle innervation4,6,7. For the particular motor pool used to illustrate the technique, we recorded from buccal nerves 2 and 3 to measure axonal projections, and measured the contraction forces of the I1/I3 muscle to determine the pattern of muscle innervation for the individual motor neurons.
We demonstrate the complete process of first identifying motor neurons using muscle innervation, then characterizing their timing during motor patterns, creating a simplified diagnostic method for rapid identification. The simplified and more rapid diagnostic method is superior for more intact preparations, e.g. in the suspended buccal mass preparation8 or in vivo9. This process can also be applied in other motor pools10,11,12 in Aplysia or in other animal systems2,3,13,14.

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.

Extracellularly의 근육 모터 풀에 모터 뉴런을 확인<em&gt; Aplysia californica</em

In animals with large  identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using  intracellular techniques1,2,3,4. Recently,  we developed ...

Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

Mauthner cells (M-cells) are large reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key neurons involved in a characteristic behavior known as the C-start or escape response that occurs when the organism perceives a threat. The M-cell has been extensively studied in adult goldfish where it has been shown to receive a wide range of excitatory, inhibitory and neuromodulatory signals1. We have been examining M-cell activity in embryonic zebrafish in order to study aspects of synaptic development in a vertebrate preparation. In the late 1990s Ali and colleagues developed a preparation for patch clamp recording from M-cells in zebrafish embryos, in which the CNS was largely intact2,3,4. The objective at that time was to record synaptic activity from hindbrain neurons, spinal cord neurons and trunk skeletal muscle while maintaining functional synaptic connections within an intact brain-spinal cord preparation. This preparation is still used in our laboratory today. To examine the mechanisms underlying developmental synaptic plasticity, we record excitatory (AMPA and NMDA-mediated)5,6 and inhibitory (GABA and glycine) synaptic currents from developing M-cells. Importantly, this unique preparation allows us to return to the same cell (M-cell) from preparation to preparation to carefully examine synaptic plasticity and neuro-development in an embryonic organism. The benefits provided by this preparation include 1) intact, functional synaptic connections onto the M-cell, 2) relatively inexpensive preparations, 3) a large supply of readily available embryos 4) the ability to return to the same cell type (i.e. M-cell) in every preparation, so that synaptic development at the level of an individual cell can be examined from fish to fish, and 5) imaging of whole preparations due to the transparent nature of the embryos.

We have developed an intact brain-spinal cord preparation to record and monitor electrical activity via patch clamp recording from the Mauthner neurons and other reticulospinal cells in zebrafish embryos. Thus, we are able to record excitatory and inhibitory synaptic currents, voltage-gated channel activity and action potentials from key neurons in a developing embryo.

배아 Zebrafish의 MAUTHNER 세포에서 패치 클램프 녹음

Mauthner cells (M-cells) are large  reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key  neurons involved in a characteristic ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of olfactory-driven behaviors and their modulation. These coding properties depend heavily on the initial interaction between odor molecules and the olfactory receptor (OR) expressed in the OSNs. The identity, specificity and ligand spectrum of the expressed OR are critical. The probability to find the ligand of the OR expressed in an OSN chosen randomly within the epithelium is very low. To address this challenge, this protocol uses genetically tagged mice expressing the fluorescent protein GFP under the control of the promoter of defined ORs. OSNs are located in a tight and organized epithelium lining the nasal cavity, with neighboring cells influencing their maturation and function. Here we describe a method to isolate an intact olfactory epithelium and record through patch-clamp recordings the properties of OSNs expressing defined odorant receptors. The protocol allows one to characterize OSN membrane properties while keeping the influence of the neighboring tissue. Analysis of patch-clamp results yields&#160;a precise quantification of ligand/OR interactions, transduction pathways and pharmacology, OSNs&#39; coding properties and their modulation at the membrane level.&#160;

Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

본래 Neuroepithelium에서 마우스 강한 감각 뉴런의 천공 패치 클램프 녹음 : 확인 된 부 취제 수용체를 발현 뉴런의 기능 분석

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

뇌 조각에서 전체 셀 패치 클램프 녹음

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding these fundamental functions will shed light on the information transfer in these neurons. Dendritic patch-clamp recordings provide the possibility to directly examine the electrical properties of dendrites and underlying voltage-gated ion channels. However, these fine structures are not easily accessible to patch pipettes because of their small diameter. This report describes a step-by-step procedure to collect stable and reliable recordings from the dendrites of dopaminergic neurons in acute slices. Electrophysiological measurements are combined with post hoc recovery of cell morphology. Successful experiments rely on improved preparation of slices, solutions and pipettes, adequate adjustment of the optics and stability of the pipette in contact with the recorded structure. Standard principles of somatic patch-clamp recording are applied to dendrites but with a gentler approach of the pipette. These versatile techniques can be implemented to address various questions concerning the excitable properties of dendrites.

Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.

흑색질 도파민 뉴런의 Somatodendritic 도메인에서 세포 내 패치 클램프 녹음

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate electrical processes in target cells. In this context, ion selectivity of a channelrhodopsin is of particular importance. This article describes the investigation of chloride selectivity for a recently identified anion-conducting channelrhodopsin of Proteomonas sulcata via electrophysiological patch-clamp recordings on HEK293 cells. The experimental procedure for measuring light-gated photocurrents demands a fast switchable &#8211; ideally monochromatic &#8211; light source coupled into the microscope of an otherwise conventional patch-clamp setup. Preparative procedures prior to the experiment are outlined involving preparation of buffered solutions, considerations on liquid junction potentials, seeding and transfection of cells, and pulling of patch pipettes. The actual recording of current-voltage relations to determine the reversal potentials for different chloride concentrations takes place 24 h to 48 h after transfection. Finally, electrophysiological data are analyzed with respect to theoretical considerations of chloride conduction.

This article describes how the ion selectivity of channelrhodopsin is determined with electrophysiological whole-cell patch-clamp recordings using HEK293 cells. Here, the experimental procedure for investigating chloride selectivity of an anion-selective channelrhodopsin is demonstrated. However, the procedure is transferable to other channelrhodopsins of distinct selectivity.