NSF (0,854,551)에 의해 기금을 마련했습니다.

1. 사전 실험 준비 <ol><li> 여섯 솔루션을 (작품에 대한 표 1 참조) 준비 : () 100 ML NZR (정상 zebrafish 벨소리의), (B) 50 ML NZR + Tricaine (MS222), (C) 10 ML NZR + BSA, (D) 100 ML의 LoCaS (저 칼슘 2 + 솔루션), (E) 10 ML LoCaS + papain, (F) 100 ML K + - 내부 솔루션입니다. 솔루션 (가), (B), (D)와 (F) 4 ° C.에서 최대 1 개월에 저장할 수 있습니다 솔루션 (C)하며 (e)에서 실험의 날을 준비해야합니다. 모든 솔루션은 실험을 시작하기 전에 실온에서해야합니다. </li><li> 라벨 약 중간 솔루션 (A), (C), (D)로하고 (E) 4 35mm 페트리 요리를 채 웁니다. </li><li> Sylgard (다우 코닝, 미들랜드, MI)와 60mm 페트리 접시를 입력 한 다음 생선이 끝난 팁 않고 똑바로 앉을 수 그것을에 구멍을 절단하여 해부 접시를합니다. </li><li> 유리의 끝 부분에 개 머리 접착 고치 끝에서 두 개 이상의 셀 절연 도구를 준비superglue과 파스퇴르 피펫은 머리가 약 0.5 cm하여 피펫의 끝을 지났 확장 할 수 있도록합니다. 래브라도 리트리버의와 Weimaraners 같은 부드러운 부드러운 털로 덮인 개에서 머리카락이 잘 작동합니다. </li></ol> 2. 청각 및 Vestibular 미궁의 절연 <ol><li> NZR + Tricaine를 포함하는 비커에 빠져​​있는 성인 zebrafish를 희생. 모든 opercular 움직임​​이 정지 할 때까지 시각적으로 아가미를 모니터링 할 수 있습니다. 물고기를 제거하고 신선한 NZR와 린스하기 전에 추가로 10 분 동안 기다리십시오. 이러한 절차는 기관 동물 케어의 승인을 페퍼 다인 대학위원회 (IACUC)를 사용하지만, 승인을 자신의 기관에서 취득해야했습니다. </li><li> 에 물고기를 핀 머리에서 거리의 절반에 하나의 3 분 등쪽 - 복부 축으로 각 눈 소켓 세 번째 핀을 통해 하나의 표준 재봉 스트레이트 핀 (약 2.5 cm 길이)를 삽입하여 요리 등의 측면을 해부 에 도시 된 바와 같이 꼬리에그림 1A. </li><li> 줌 (0.62-5 배) 10 배 접안 렌즈가 장착 스테레오 해부 현미경에서 약 점에서 두개골 지붕을 제거하여 뇌와 척수의 짧은 세그먼트를 노출 봄 가위 (정밀 과학 도구 카탈로그 번호 15000-02)를 사용 앞으로 생선의 코에 아가미의 수준에 꼬리 0.5 cm. 척수를 잘라 척수 신경 및 기타 첨부 파일을 절단하면서 고급 집게 (고급 과학 도구 카탈로그 번호 11251-30)으로 뇌를 들어, 뇌를 제거하고 (그림 1B) 폐기합니다. </li><li> 남아있는 두개골 캡슐의 복부 반은 내이 (内耳) 기​​관을 포함하는 &quot;그릇&quot;을 형성한다. 각 내이 (内耳) 등 rostrally 측면 위치 utricle의 otoliths (그림 1C 및 4A)의 꼬리 끝 부분에 대칭있는 lagenas과 sacculi의 눈에 잘 띄는, 흰색, 불투명 otoliths을 관찰합니다. </li><li> 모든 복부와 측면 부착을 절단하여 뼈의 그릇을 제거TS 부드럽게 고급 집게로 머리에서 그 생각을 지울 리프팅 동안. LoCaS을 (인물 1D 및 4B)가 포함 된 페트리 접시에 놓으십시오. </li><li> 고급 집게 두 쌍을 사용하여 두 뼈의 측면 가장자리를 잡고 있으며 중앙에 포셉의 포인트를 삽입하고 반쪽를 떼어 내려고하면 왼쪽과 오른쪽 절반을 분리, 분해 또는 대안을 당겨 그 중간 선에서 그릇을 분리 균열 분리. 고급 포셉 (그림 2)를 사용하여 뼈에서 두 labyrinths를 제거합니다. </li><li> 반원의 운하, utricles, sacculi 및 lagenas (그림 4C) : 청각 및 vestibular 최종 기관을 식별 할 수 labyrinths을 검사합니다. 각 otolith 아래의 분홍빛이 도는 지역은 세포를 포함하는 maculae 있습니다. 마찬가지로, 반원의 운하의 ampullae 내부 분홍색의 띠는 세포이있는 cupula를 식별합니다. </li><li> 조심스럽게 고급 집게를 사용하여 lagena과 utricle에서 otoliths를 제거 ( <strong&gt;도 2 및도 4C). 그것은 이렇게하면 saccular 세포에 손상을 줄 수 있으므로 saccule에서 otolith을 제거 할 필요가 없습니다. </li></ol> 3. 헤어 셀 절연 <ol><li> 플라스틱 전송 피펫을 (피셔 과학 카탈로그 번호 13-711 - 오전 9시)를 사용하여, 포함 된 음식에 최종 장기를 이동 LoCaS + papain는 유체 이송의 볼륨을 최소화. </li><li> 상온에서 삼십분이 솔루션에서 이러한 구조를 품다. </li><li> 잠복기의 끝 부분에 NZR + BSA를 포함하는 요리로 구조를 이동하고 적어도 30 분 동안이 솔루션에 품다. 세포는 최대 4 시간이 솔루션에 건강 유지되지만 (다음 단계 참조) 분리 후 1 ~ 2 시간 후에 저하됩니다. </li><li> 세포 분리를위한 준비에 NZR를 포함하는 요리로 최종 장기 중 하나를 이동합니다. </li><li> lagenas 및 utricles를 들어, 부드럽게 분홍빛이 도는 상피 TI의 maculae - 시트를 발사하는 강아지 털을 사용하여세포를 (그림 3A)를 포함 ssue. maculae는 건져 할 수있는 sacculi의 otoliths 아래에서 (개 머리를 사용하여), 그리고 반원의 운하의 ampullae 내부의 위치에서 cupulae. </li><li> 단계 1.4에서 조리 두 셀 절연 도구 사용하여 세포를 (그림 3B)를 포함 파편 필드를 생성 할 수있는 망막 황반 또는 cupula을 씹다. 세포에게 그것을 이동하기 전에 접시의 바닥에 정착 할 최소한의 시간이 소요됩니다. </li><li> 위상 대비 광학 장착 역 현미경의 무대에 요리를 변경합니다. 40X 배율에서 세포를 관찰하고 형태의 다양성을 확인합니다. 다른 사람들이 길고 얇은 반면 대부분의 세포는 아보카도 모양입니다. 혀끝의 머리 번들의 존재는 세포로를 식별 및 위상 - 밝기는 자신의 건강을 실현할 수 있습니다. 절연 세포의 Photomicrographs는 그림 5에 표시됩니다. </li></ol> 4. Zebrafish 헤어 셀을 클램핑 패치 <ol><li> perfo를위한 준비장소 5 MG amphotericin B (시그마 A4888) 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 100 μl DMSO를 입력 : 정격 패치 녹음 5,6는 다음과 같이 amphotericin 함유 내부 솔루션을 준비합니다. amphotericin의 모든 해산 될 때까지 10~20초에 대한 즉시 와동이 솔루션입니다. 두 번째 microcentrifuge 튜브에 다음 피펫 625 μl K는 + - 내부 솔루션입니다. 위와 같이 + - 내부 솔루션 K와 소용돌이에 amphotericin 솔루션 10 μl를 추가합니다. 재고 amphotericin 솔루션은 몇 시간 지속 하나 시간 후 최종 솔루션이 삭제됩니다. </li><li> 다단 풀러 (셔터 P-1000)를 사용하여 BF 150-86-10 붕규산 유리 (셔터 계측기)에서 패치 피펫을 제조. 피펫은 약 2 μm의 직경 팁이 있어야하며 표 1에서 솔루션 MΩ 1-3의 저항을 갖게됩니다. 다음과 같이 작업이 잘되어 있다는 풀러의 설정 : 열 = 램프 minus10는 = 0, 속도를 당겨 = 18, 지연 = 1, 압력 = 600. 의 모양좋은 피펫의 끝은 그림 5의 삽입 C의 사진에서 분명하다. 그들은 electrophysiological 레코딩을하는 동안 최소 액세스 저항을 제공하기 때문에 갑작스런 &quot;총알 모양의 &#39;피펫이 선호됩니다. </li><li> amphotericin 함유 K + - 내부 솔루션으로 반 녹화 전극을 채우기 위해, 28 게이지 Microfil의 주사기 바늘 (세계 정밀 계측기 MF28G-5)를 사용합니다. </li><li> 패치 클램프 증폭기의 headstage에 부착 전극합니다. -10 뮤직 비디오, 10 Hz에서 10 밀리 전압 단계를 적용하고이 셀 근처의 녹음 요리의 맨 아래로 공기 / 솔루션 인터페이스를 통해 maneuvered되고 같이 전극에 긍정적 인 압력을 유지하고 있습니다. </li><li> 건강한 찾고 셀에 직교 전극을 배치합니다. 그것이 밖으로 흐르는 솔루션에서 벗어나되도록 전극이 충분히 셀 근처에있는 경우, 신속하게 전극에 약간의 진공을 적용, 압력을 반대로 그 위에 셀 &quot;점프&quot;까지. 즉시 일에 흡입을 중단전자 전극과 전극의 내부에 -70 mV의 개최 가능성을 적용 할 수 있습니다. 몇 초 내에 gigaohm 씰이 형성됩니다. </li><li> 곧 인감 형성 한 후 표시되는 전압 단계의 시작 및 종료의 용량 현재의 과도을 관찰합니다. 과도가 (약 10 분) 최대 크기에 크기에 성장 보면서 amphotericin에 의해 전극 아래에 멤브레인의 천공을 감시하고 있습니다. </li><li> , 건강한 셀에 전체 셀 (구멍) 구성의 설립을 확인 전압의 단계를 hyperpolarizing하고 depolarizing을 적용하여 외부 K + 전류를 유도합니다. 대부분의 세포는 눈에 잘 띄는 외부 전류를 (그림 6 참조)가 있습니다. </li></ol> 5. 대표 결과 그림 4는 세포 분리의 단계에서 찍힌 사진을 보여줍니다. 패널에서이 lagenas, saccluli 및 utricles와 관련된 otoliths은 throu 볼 수 있습니다GH는 뼈의 얇은 층을 overlies 것을. 이러한 불투명 한 구조 해부의 후속 단계 동안 동물에서 최종 장기의 안전한 제거에 도움 편리한 랜드 마크를 제공합니다. 패널 B는 그대로 labyrinths과 utricles, lagenas 및 sacculi의 눈에 잘 띄는 otoliths를 포함 뼈의 &quot;그릇&quot;을 보여줍니다. 패널 C는 뼈에서 제거되었습니다 미로를 보여줍니다. lagena에서 부채꼴 가장자리와 큰 otolith, utricle의 saccule과 콩 모양 otolith의 고드름 모양의 otolith을 확인합니다. 크기와 lagena으로부터 격리 세포에서 볼 형태의 다양성의 일부는 그림 5에 도시된다. 건강한 세포는 쉽게 날카로운 경계가있는 밝은 상으로 확인된다. 세포 모양은 약 2 클래스로 나눌 수 있습니다 : 아보카도 모양 (아보)과 긴 얇은 (thn) 각 그룹 내에서 세포의 크기가 현저하게 달라질 수 있지만 (예를 들어 아보 1 아보 3 비교). 삽입이의 클러스터를 보여줍니다에 세 세포가 완전히 서로 분리되지 않았습니다. 삽입 B에있는 세포의 블랙 색상과 세부적인 외관은 쉽게 죽은로 셀을 식별합니다. 삽입 C는 이러한 세포에서 녹화에 적절한 형태와 크기를 도시 한 패치 피펫의 끝을 보여줍니다. 그림 6에 표시된 현재의 흔적은 그림 5와 같이 아보 2와 비슷한 lagena 셀에 부과 잠재력 단계를 hyperpolarizing하고 depolarizing에 대한 응답으로 얻었다. 다양한 크기와 모양의 세포의 현재 반응은 널리 전압 개폐 채널의 보완에 다양성을 제안 다를 수 있습니다. 1-3 그림 : 세포의 분리의 단계를 설명하는 만화. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4281/4281fig1.jpg" /> 그림 1. 두개골 capsu의 제거zebrafish에서 귀에 labyrinths을 포함하는 르.. 요리를 해부에 zebrafish 등쪽면을 희생 핀. B는. 오픈 두개골은 제거하고 뇌를 폐기하십시오. C. utricles, lagenas 및 sacculi. D의 otoliths을 관찰합니다. labyrinths를 포함하는 두개골 캡슐의 복부 부분을 제거합니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4281/4281fig2.jpg" /> 그림 2. 두개골 캡슐에서 labyrinths의 제거.. 그 중간 선에서 두개골 캡슐을 분리 균열. B. 뼈에서 labyrinths를 제거합니다. C는. 집게를 사용하여 lagenas과 utricles에서 otoliths를 제거합니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/4281/4281fig3.jpg" /> 그림 3. labyrinths에서 세포의 분리.. 부드럽게 교장 발사개 머리 culae. B. 두 개 머리카락과 maculae을 씹다. C.이 패치 클램프에 대한 격리 된 세포를 사용합니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/4281/4281fig4.jpg" /> 그림 4. 이미지는 개별 셀의 고립의 단계 중에 찍은. 뇌의 제거 후 A.이 두 lagenas 및 sacculi (화살표)와 utricles (화살촉)과 관련된 otoliths를 시각적으로 할 수 있습니다. B.은 복부의 제거 후 동물의 내이 (内耳) 기​​관을 포함하는 두개골 캡슐의 일부. B의 오른쪽 반으로 만화는 왼쪽 utricle, lagena과 saccule의 위치를 식별합니다. 점선은 왼쪽 미로의 대략적인 위치를 나타냅니다. C. 오른쪽 미로 (중간보기) D : C에서 미로의 주요 부분을 보여주는 만화 그리기. : 앞 반원형 운하, B : 수평 운하, C : 뒤 운하, D : utricular otolith, E : saccular otolith, F : lagenal otolith. D의 스케일 바는 A와 B에 대한 1mm, C 및 D. 0.5 mm를 나타냅니다 <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/4281/4281fig5.jpg" /> 그림 5 형태의 다양성을 보여주는 lagena에서 절연, 건강한 세포, 아보 :. 아보카도 모양의 세포, thn : 긴 얇은 세포. 삽입 세 불완전하게 격리 세포의 클러스터, 삽입 B : 죽은 세포, 삽입 C : zebrafish 세포에서 electrophysiological 레코딩에 사용되는 패치 전극의 끝. 스케일 바 = 20 μm의 주요 그림 및 모든 insets에 적용됩니다. <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/4281/4281fig6.jpg" /> 패치에 기록 그림 6. 요즘에는 헤어 셀을 고정. 셀에 평균 응답 (유사 t-70 mV의 개최 가능성에서 70 뮤직 비디오까지 -140 뮤직 비디오에서 10 MV 단위로인가 전압 단계의 세 프레젠테이션에 그림 5에서 O 아보 2). 더 depolarized 가능성에 나타나는 운영을 중지시키지 전류를합니다. 전압 단계 magnitudes는 흔적의 일부 옆에 표시됩니다.

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관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

최종 기관과 세포의 부드러운 치료에주의 해부 건강, 손상 및 생리 학적 활성 세포의 성공적인 고립 중요합니다. 다음 사항을 준수하는 것은 성공을 보장합니다 <ol><li> 이 작은 물고기 (길이 2-2.5 cm)에서 건강한 세포를 얻을 쉽습니다. 큰 물고기 해부 과정이 불분명 시각화 많은 지방 방울을 갖추고 있습니다. </li><li> 세포를 ... 위에 가로 눕다 otoliths를 제거 할 때주의가 필요합니다. 집게로 otoliths를 잡을 때 셀을 터치하지 마십시오. </li><li> 최고의 결과는 maculae와 cupulae가 상피에서 triturated 시트 및 셀로 떠낸 때 얻을 수 있습니다. </li><li> 우리는 인간의 속눈썹에게로 테이퍼 덜 유연하지 않은 7을 사용 등의 다른 방법에 우수 할 셀을 씹다 할 수있는 개 머리의 사용을 찾으십시오. </li><li> 패치 고정, t에 긍정적 인 압력의 응용시공기 / 솔루션 인터페이스가 끝이 깨끗하게 유지하는 것이 중요하다 통해 통과로 그는 전극. 전극에 &quot;점프&quot;할 셀을 활성화 할 수있는 긍정적 인 압력의 출시도 중요합니다. 이 방법은 따라서 셀 gigaohm 밀봉을 형성 가능성을 증가 멀리 끝에서 amphotericin 함유 솔루션의 작은 볼륨을 삭제합니다. 우리 실험에서는 대신보다 전통적인 전체 셀 구성으로 인해 세포의 취약성의 구멍 패치 녹화 기술을 사용합니다. gigaohm 씰의 손실에 자주 결과 &quot;전체 셀을 이동 &#39;하려고했습니다. </li></ol> 여기에 설명 된 방법은 동물 당 건강한 세포 수백 얻을 수 있습니다. 기술은 실온에서 수행하고 해부 현미경 이외의 특별한 장비가 필요하지 않습니다. 할 수 있습니다 목성의 이전 보고서는 복부 접근 방법 8을 사용 zebrafish의 내이 (内耳)의 절개를 설명합니다. 이 작성자는 아까 그 바 말인데을 보여줍니다전체, paraformaldehyde - 고정 귀에 장기 ction. 우리는 독자가 우리의 방법과 비교를 위해이 동영상을 감상하는 것이 좋습니다. 여기에 제시된 방법 중 하나 장점은 생리적 조사에 유용 라이브 세포의 획득입니다. 이러한 세포의 사용은 정전 용량 측정 할 11,12을 만들어 세포 공명 9,10, 모니터 신경 전달 물질 자료를 공부하도록 확장 할 수 있습니다 (여기를 참조) 전압 개폐 채널을 공부하는 패치 클램프 실험에서의 사용 외에,에 의해 유도 neuromodulation 조사 리간드 게이트 채널 13 활성화뿐만 아니라 청각과 균형 14 모두에 영향을 미칠 돌연변이를 사용 수집 할 수있는 정보의 풍부한를 활용할 수 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 솔루션 이름 </td><td> 조리법 </td></tr><tr><td> (A) NZR (일반 Zebrafish 벨소리의) (MM)을 </td><td> 116 NaCl, 2 KCl, 2 CaCl 2, 3 포도당, 5 오세영 + - HEPES, pH를 7.35. </td></tr><tr><td> (B) NZR + Tricaine </td><td> NZR + 0.02 % 3-아미노 산 에틸 에스테르 메탄 술폰산 (시그마 A5040). </td></tr><tr><td> (C) NZR + BSA </td><td> NZR + 0.4 % 소 혈청 알부민 (시그마 A2153). </td></tr><tr><td> (D) LoCaS (저 칼슘 2 + 솔루션) (MM)을 </td><td> 100 NaCl, 2 KCl, 0.05 CaCl 2, 0.05 MgCl 2, 3 포도당, 30 그렇단 +-HEPES, pH를 7.35. </td></tr><tr><td> (E) LoCaS + papain </td><td> LoCaS + 0.05 % L-시스테인 (시그마 C1276) + 0.2 % papain (시그마 P3375). </td></tr><tr><td> (F) K +-내부 솔루션 (MM)을 </td><td> 52 K 2 SO 4,38 KCl, 1 K +-EGTA, 5 K +-HEPES, pH를 7.3. </td></tr></tbody></table> 표 1. 솔루션.

patch clamp recordings in inner ear hair cells isolated from zebrafish

종의 다양한 절연 감각 세포의 전압 개폐 채널 패치 클램프 분석은 이전에 1-4 설명이 동영상은 zebrafish의 세포에 그러한 기술의 첫 번째 응용 프로그램을 나타냅니다되었습니다. saccule, lagena, utricle과 반원의 운하 : 여기 우리는 귀에 최종 기관에서 모두 건강하고, 손상 세포를 분리하는 방법을 보여줍니다. 또한, 우리는 헤어 셀 크기와 형태의 다양성을 보여하고 얻을 수 패치 클램프 녹음의 종류의 예를 제공합니다. 다른 이상이 zebrafish 모델 시스템의 사용의 장점은 청력과 균형 모두에 영향을 미칠 zebrafish 돌연변이의 가용성 때문이다. 유전자 변형 라인과 유전자 분석 및 조작, 세포 절연 및 electrophysiological 방법을 사용 다른 기술의 사용과 함께 역할 세포 P에 큰 통찰력을 촉진한다 여기에서 소개이러한 감각 modalities을 중재에 놓여 있었다.

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Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

이 동영상의 목적은 성인 zebrafish의 내부 귀 기관에서 건강 손상 세포를 획득하고 자신의 전압 개폐 채널의 biophysical 속성을 특성화하기위한 패치 클램프 연구를 위해 사용에 대한 절차를 설명하는 것입니다.

귀에 세포의 패치 클램프 녹음 절연 Zebrafish에서

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

patch-clamp-recordings-in-inner-ear-hair-cells-isolated-from-zebrafish

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.6K 조회수.  Pepperdine University. 이 동영상의 목적은 성인 zebrafish의 내부 귀 기관에서 건강 손상 세포를 획득하고 자신의 전압 개폐 채널의 biophysical 속성을 특성화하기위한 패치 클램프 연구를 위해 사용에 대한 절차를 설명하는 것입니다.

비디오: Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

어두운 적응 슬라이스 준비에 마우스 망막 뉴런에서 패치 클램프 레코딩

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

연구

신경과학

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle. This is a direct consequence of the accessibility to both cell types and ability to visually distinguish the single segmental CaP motor-neuron on the basis of morphology and location. This video demonstrates the microscopic methods used to identify a CaP motor-neuron and target muscle cells as well as the methodologies for recording from each cell type. Identification of the CaP motor-neuron type is confirmed by either dye filling or by the biophysical features such as action potential waveform and cell input resistance. Motor-neuron recordings routinely last for one hour permitting long-term recordings from multiple different target muscle cells. Control over the motor-neuron firing pattern enables measurements of the frequency-dependence of synaptic transmission at the neuromuscular junction. Owing to a large quantal size and the low noise provided by whole cell voltage clamp, all of the unitary events can be resolved in muscle. This feature permits study of basic synaptic properties such as release properties, vesicle recycling, as well as synaptic depression and facilitation. The advantages offered by this in vivo preparation eclipse previous neuromuscular model systems studied wherein the motor-neurons are usually stimulated by extracellular electrodes and the muscles are too large for whole cell patch clamp. The zebrafish preparation is amenable to combining electrophysiological analysis with a wide range of approaches including transgenic lines, morpholino knockdown, pharmacological intervention and in vivo imaging. These approaches, coupled with the growing number of neuromuscular disease models provided by mutant lines of zebrafish, open the door for new understanding of human neuromuscular disorders.

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target skeletal muscle. This video demonstrates the microscopic methods used to identify a segmental CaP motor-neuron and target muscle cells as well as the methodologies for recording from each cell type.

모터 신경 세포의 이점 패치 클램프 레코딩과 Zebrafish의 대상 골격근

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle.  ...

Postsynaptic Recordings at Afferent Dendrites Contacting Cochlear Inner Hair Cells: Monitoring Multivesicular Release at a Ribbon Synapse

The afferent synapse between the inner hair cell (IHC) and the auditory nerve fiber provides an electrophysiologically accessible site for recording the postsynaptic activity of a single ribbon synapse 1-4. Ribbon synapses of sensory cells release neurotransmitter continuously, the rate of which is modulated in response to graded changes in IHC membrane potential 5. Ribbon synapses have been shown to operate by multivesicular release, where multiple vesicles can be released simultaneously to evoke excitatory postsynaptic currents (EPSCs) of varying amplitudes 1, 4, 6-11. Neither the role of the presynaptic ribbon, nor the mechanism underlying multivesicular release is currently well understood.
The IHC is innervated by 10-20 auditory nerve fibers, and every fiber contacts the IHC with a unmyelinated single ending to form a single ribbon synapse. The small size of the afferent boutons contacting IHCs (approximately 1 &mu;m in diameter) enables recordings with exceptional temporal resolution to be made. Furthermore, the technique can be adapted to record from both pre- and postsynaptic cells simultaneously, allowing the transfer function at the synapse to be studied directly 2. This method therefore provides a means by which fundamental aspects of neurotransmission can be studied, from multivesicular release to the elusive function of the ribbon in sensory cells.

Whole-cell patch-clamp recordings from auditory nerve fiber dendrites at the inner hair cell ribbon synapse in the mammalian cochlea.

달팽이 내부 세포에 문의 수입 성의 Dendrites에서 Postsynaptic 레코딩 : 리본 시냅스에서 모니터링 Multivesicular 릴리스

The afferent synapse between the inner hair cell (IHC) and the auditory nerve fiber provides an electrophysiologically accessible site for recording the ...

Isolating LacZ-expressing Cells from Mouse Inner Ear Tissues using Flow Cytometry

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues presents a unique challenge because of the paucity of cells of interest and few transgenic reporter mouse models. Here, we describe a protocol using fluorescence-conjugated probes to selectively label LacZ-positive cells from the neonatal cochleae.
The most common underlying pathology of sensorineural hearing loss is the irreversible damage and loss of cochlear sensory hair cells, which are required to transduce sound waves to neural impulses. Recent evidence suggests that the murine auditory and vestibular organs harbor stem/progenitor cells that may have regenerative potential1,2. These findings warrant further investigation, including identifying specific cell types with stem/progenitor cell characteristics. The Wnt signaling pathway has been demonstrated to play a critical role in maintaining stem/progenitor cell populations in several organ systems3-7. We have recently identified Wnt-responsive Axin2-expressing cells in the neonatal cochlea, but their function is largely unknown8.
To better understand the behavior of these Wnt-responsive cells in vitro, we have developed a method of isolating Axin2-expressing cells from cochleae of Axin2-LacZ reporter mice9. Using flow cytometry to isolate Axin2-LacZ positive cells from the neonatal cochleae, we could in turn execute a variety of experiments on live cells to interrogate their behavior as stem/progenitor cells. Here, we describe in detail the steps for the microdissection of neonatal cochlea, dissociation of these tissues, labeling of the LacZ-positive cells using a fluorogenic substrate, and cell sorting. Techniques for dissociating cochleae into single cells and isolating cochlear cells via flow cytometry have been described2,10-12. We have made modifications to these techniques to establish a novel protocol to isolate LacZ-expressing cells from the neonatal cochlea.

Flow cytometry is a powerful tool allowing for the isolation and study of specific cell populations. This protocol describes steps for isolating LacZ-expressing cells from cochlear tissues from neonatal transgenic mice. Dissociated cochlear cells were labeled using fluorescent-conjugated substrates of &#946;-galactosidase prior to separation via flow cytometry.

분리 LacZ를 표현 유동세포계측법를 사용하여 마우스 내이 (内耳) 조직의 세포를

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues ...

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and the organ of Corti in the coiled cochlea. The cristae and maculae contain vestibular hair cells that transduce mechanical stimuli to subserve the special sense of balance, while auditory hair cells in the organ of Corti are the primary transducers for hearing 1. Cell fate specification in these sensory epithelia and morphogenesis of the semicircular canals and cochlea take place during the second week of gestation in the mouse and are largely completed before birth 2,3. Developmental studies of the mouse inner ear are routinely conducted by harvesting transgenic embryos at different embryonic or postnatal stages to gain insight into the molecular basis of cellular and/or morphological phenotypes 4,5. We hypothesize that gene transfer to the developing mouse inner ear in utero in the context of gain- and loss-of-function studies represents a complimentary approach to traditional mouse transgenesis for the interrogation of the genetic mechanisms underlying mammalian inner ear development6.
The experimental paradigm to conduct gene misexpression studies in the developing mouse inner ear demonstrated here resolves into three general steps: 1) ventral laparotomy; 2) transuterine microinjection; and 3) in vivo electroporation. Ventral laparotomy is a mouse survival surgical technique that permits externalization of the uterus to gain experimental access to the implanted embryos7. Transuterine microinjection is the use of beveled, glass capillary micropipettes to introduce expression plasmid into the lumen of the otic vesicle or otocyst. In vivo electroporation is the application of square wave, direct current pulses to drive expression plasmid into progenitor cells8-10. 
We previously described this electroporation-based gene transfer technique and included detailed notes on each step of the protocol11. Mouse experimental embryological techniques can be difficult to learn from prose and still images alone. In the present work, we demonstrate the 3 steps in the gene transfer procedure. Most critically, we deploy digital video microscopy to show precisely how to: 1) identify embryo orientation in utero; 2) reorient embryos for targeting injections to the otocyst; 3) microinject DNA mixed with tracer dye solution into the otocyst at embryonic days 11.5 and 12.5; 4) electroporate the injected otocyst; and 5) label electroporated embryos for postnatal selection at birth. We provide representative examples of successfully transfected inner ears; a pictorial guide to the most common causes of otocyst mistargeting; discuss how to avoid common methodological errors; and present guidelines for writing an in utero gene transfer animal care protocol.

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mouse inner ear is a placode-derived sensory organ whose developmental program is elaborated during gestation. We define an in utero gene transfer technique consisting of three steps: mouse ventral laparotomy, transuterine microinjection, and in vivo electroporation. We use digital video microscopy to demonstrate the critical experimental embryological techniques.

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The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and ...

Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

Mauthner cells (M-cells) are large reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key neurons involved in a characteristic behavior known as the C-start or escape response that occurs when the organism perceives a threat. The M-cell has been extensively studied in adult goldfish where it has been shown to receive a wide range of excitatory, inhibitory and neuromodulatory signals1. We have been examining M-cell activity in embryonic zebrafish in order to study aspects of synaptic development in a vertebrate preparation. In the late 1990s Ali and colleagues developed a preparation for patch clamp recording from M-cells in zebrafish embryos, in which the CNS was largely intact2,3,4. The objective at that time was to record synaptic activity from hindbrain neurons, spinal cord neurons and trunk skeletal muscle while maintaining functional synaptic connections within an intact brain-spinal cord preparation. This preparation is still used in our laboratory today. To examine the mechanisms underlying developmental synaptic plasticity, we record excitatory (AMPA and NMDA-mediated)5,6 and inhibitory (GABA and glycine) synaptic currents from developing M-cells. Importantly, this unique preparation allows us to return to the same cell (M-cell) from preparation to preparation to carefully examine synaptic plasticity and neuro-development in an embryonic organism. The benefits provided by this preparation include 1) intact, functional synaptic connections onto the M-cell, 2) relatively inexpensive preparations, 3) a large supply of readily available embryos 4) the ability to return to the same cell type (i.e. M-cell) in every preparation, so that synaptic development at the level of an individual cell can be examined from fish to fish, and 5) imaging of whole preparations due to the transparent nature of the embryos.

We have developed an intact brain-spinal cord preparation to record and monitor electrical activity via patch clamp recording from the Mauthner neurons and other reticulospinal cells in zebrafish embryos. Thus, we are able to record excitatory and inhibitory synaptic currents, voltage-gated channel activity and action potentials from key neurons in a developing embryo.

배아 Zebrafish의 MAUTHNER 세포에서 패치 클램프 녹음

Mauthner cells (M-cells) are large  reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key  neurons involved in a characteristic ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal population (10-20%), but show a high level of physiological, morphological, and neurochemical heterogeneity, reflecting their diverse functions. Therefore, investigation of interneurons provides important insights into the organization principles and function of neuronal circuits. This, however, requires an integrated physiological and neuroanatomical approach for the selection and identification of individual interneuron types. Whole-cell patch-clamp recording from acute brain slices of transgenic animals, expressing fluorescent proteins under the promoters of interneuron-specific markers, provides an efficient method to target and electrophysiologically characterize intrinsic and synaptic properties of specific interneuron types. Combined with intracellular dye labeling, this approach can be extended with post-hoc morphological and immunocytochemical analysis, enabling systematic identification of recorded neurons. These methods can be tailored to suit a broad range of scientific questions regarding functional properties of diverse types of cortical neurons.

Cortical networks are controlled by a small, but diverse set of inhibitory interneurons. Functional investigation of interneurons therefore requires targeted recording and rigorous identification. Described here is a combined approach involving whole-cell recordings from single or synaptically-coupled pairs of neurons with intracellular labeling, post-hoc morphological and immunocytochemical analysis.

Morphologically- 및 Neurochemically 확인 된 해마의 interneurons에서 전체 세포 패치 클램프 녹음

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with simultaneous intracellular biocytin filling allows a correlated analysis of their structural and functional properties. With this method it is possible to identify and characterize both pre- and postsynaptic neurons by their morphology and electrophysiological response pattern. Paired recordings allow studying the connectivity patterns between these neurons as well as the properties of both chemical and electrical synaptic transmission. Here, we give a step-by-step description of the procedures required to obtain reliable paired recordings together with an optimal recovery of the neuron morphology. We will describe how pairs of neurons connected via chemical synapses or gap junctions are identified in brain slice preparations. We will outline how neurons are reconstructed to obtain their 3D morphology of the dendritic and axonal domain and how synaptic contacts are identified and localized. We will also discuss the caveats and limitations of the paired recording technique, in particular those associated with dendritic and axonal truncations during the preparation of brain slices because these strongly affect connectivity estimates. However, because of the versatility of the paired recording approach it will remain a valuable tool in characterizing different aspects of synaptic transmission at identified neuronal microcircuits in the brain.

Patch-clamp recordings and simultaneous intracellular biocytin filling of synaptically coupled neurons in acute brain slices allow a correlated analysis of their structural and functional properties. The aim of this protocol is to describe the essential technical steps of electrophysiological recording from neuronal microcircuits and their subsequent morphological analysis.

급성 뇌 조각에서 신경 세포의 미세 회로의 전기 생리 및 형태 학적 특성은 페어 패치 클램프 녹음을 사용하여

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

뇌 조각에서 전체 셀 패치 클램프 녹음

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding these fundamental functions will shed light on the information transfer in these neurons. Dendritic patch-clamp recordings provide the possibility to directly examine the electrical properties of dendrites and underlying voltage-gated ion channels. However, these fine structures are not easily accessible to patch pipettes because of their small diameter. This report describes a step-by-step procedure to collect stable and reliable recordings from the dendrites of dopaminergic neurons in acute slices. Electrophysiological measurements are combined with post hoc recovery of cell morphology. Successful experiments rely on improved preparation of slices, solutions and pipettes, adequate adjustment of the optics and stability of the pipette in contact with the recorded structure. Standard principles of somatic patch-clamp recording are applied to dendrites but with a gentler approach of the pipette. These versatile techniques can be implemented to address various questions concerning the excitable properties of dendrites.

Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.

흑색질 도파민 뉴런의 Somatodendritic 도메인에서 세포 내 패치 클램프 녹음

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...