도미닉 밀스는 블룸 즈 버리 대학 박사 과정 재학 (2,007에서 2,010 사이)에 의해 지원되었다. 저자는 VDC​​ 모델을 개발하고 그들의 도움을 Ozan Gundogdu 및 아브디 엘미 모두에게 감사의 말씀을 전합니다.

1. 특수 0.4 μm의 필터에 IEC 단층의 성장 <ol><li> Dulbecco의 수정 된 필수 미디어 문화 Caco-2 세포 (DMEM)의 10 % (v / v)의 송아지 태아 혈청, 100 U / ML 페니실린, 100 ㎍ / ㎖ 스트렙토 마이신, 1 % (v / v)의에 불필요한 아미노산 보충 37 표준 조직 문화 인큐베이터 ° 5 % CO 2, 95 %의 공기 C. 씨앗 4 × 10 5 Caco-2 0.4 μm의 당 IECS 필터링 21 일 동안 양극화로 성장 매체에게 2-3 일마다 변경. </li><li> 볼트 옴 저항 측정기를 사용하여 단층의 편광 상태를 확인하는 봉사자를 측정한다. 우리의 연구에서 21 일의 봉사자는 Caco-2이 0.4 μm의 필터에서 자란 세포는 700 ~ 800 Ωcm 2입니다. </li></ol> 2. C.의 준비 속 jejuni와 Coculturing 분석 실험에 대한 세균의 중간 <ol><li> VDC의 coculturing 분석의 원하는 시작 지점 이전에 24 시간은, C의 신선한 혈액 한천 플레이트를 준비. 37 속 jejuni와 부화 ° C 변수의 분위기 배양기에서 호기성 (microaerobic) 조건 (85 % N 2, 5 % O 2, 10 % CO 2)에 따라. </li><li> 동시에, 변수의 분위기 배양기에서 호기성 (microaerobic) 조건 하에서 37 ° C에서 브루셀라 국물의 30 ML을 preinc​​ubate. </li></ol> 3. 준비 및 분석에 앞서 VDC 하프 챔버의 살균 <ol><li> 완전히 담그지 VDC 반 챔버뿐만 아니라 O-링과 살균 용액에 플러그. </li><li> 멸균 20 ML의 주사기를 사용, 반 챔버 모두에서 가스 입구를 통해 살균 용액을 세척하십시오. 그렇게하지 ​​않으면 coculturing 동안 시료의 오염을 초래할 수 있습니다. </li><li> &gt; 1 시간 동안 살균 용액에 모든 구성 요소를 둡니다. </li><li> 가스 주입구를 세척하기 위해 다른 멸균 20 ML의 주사기를 사용하여, 신선한 멸균 물을 모든 구성 요소를 씻어. </li></ol> 4. 준비하기세균 접종의 <ol><li> C. 반 접시를 수확 혈액 한천 배지에서 속 jejuni의 성장은 전 배양 브루셀라 국물 1 ㎖로 전날 준비. 이 ~ 10 10 CFU / ㎖를 산출해야한다. </li><li> 세균 콜로니 형성 단위 (CFUs)를 semiquantify 600 nm에서 세균 현탁액의 광학 밀도를 측정한다. </li><li> 전 배양 브루셀라 국물 4 ML에서 원하는 접종 수준으로 세균 현탁액을 조정합니다. </li><li> 다음 접종에 존재하는 세균 CFUs의 수를 정량화하기 위해 48 시간 동안 변수 분위기 인큐베이터에서 37 ° C에서 알을 품다 세중의에서 혈액 한천 플레이트에 적절한 희석의 도금 다음이 마지막 세균 현탁액에서 시리얼 희석을 수행합니다. </li></ol> 5. VDC 설정 <ol><li> 벤치 위에 VDC 평면의 아래쪽 챔버를 놓습니다. 아래쪽 챔버에 O-링을 맞 춥니 다. </li><li> t에서 IECS을 들고 하나의 필터를 분리그는 캐리어 및 멸균 PBS 400 μL로 3 회 세척한다. O-링이 제자리에 남아 확인하고, 아래쪽 챔버에 필터를 놓습니다. </li><li> 조심스럽게 상반신 챔버 제자리에 내려 놓습니다. 두 반 챔버가 조립되면, 링 클램프를 함께 사용하여 클램프. 위쪽을 향하도록 두 개의 구멍과 더불어, 벤치 위에 수평으로 VDC를 놓습니다. </li><li> 혀끝의 절반 실에 세균 접종의 4 ML을 추가합니다. </li><li> 기저 반 챔버에 세포 배양 배지 4 ML을 추가합니다. </li><li> 반 챔버 양쪽 구멍에 끝 조각을 놓습니다. </li></ol> 6. 변수 분위기 인큐베이터 내에서 가스 매니 폴드에 VDC 부착 <ol><li> 가스 매니 폴드에 근접 변수 분위기 인큐베이터에 VDC를 놓습니다. </li><li> 가스 매니 폴드에 연결된 가스 공급 레귤레이터를 엽니 다. VDC의 기저 반 챔버의 가스 입구에 매니 폴드 튜브를 연결합니다. 조지아 연결의 출구 파이프 기저 반 챔버의 끝 부분에있는 콘센트 하나에 변수 분위기 인큐베이터에서 선도. </li><li> 기저 반 챔버의 끝 부분에있는 다른 출구를 닫습니다. 이 기저 매체의 추방으로 이어질 수 있으므로, 과도한 가스 압력을 피하기 위해 매우 천천히 열을 돌보는, 가스 매니 폴드 가스 흐름을 엽니 다. </li><li> 목표는 1 거품마다 2-5 초 가스 흐름입니다. 주기적으로 실험의 과정에서 가스의 흐름을 확인하고 필요한 경우 조정합니다. </li></ol> 7. 배양 후 VDC 분해 <ol><li> 적절한 배양 기간 후에, 가스 매니 폴드에 연결된 가스 공급 레귤레이터를 닫습니다. 매니 폴드에서 VDC에 가스 흐름을 닫습니다. 가스 입구, 가스 출구 및 VDC에서 마개를 분리합니다. </li><li> 변수의 분위기 인큐베이터에서 VDC를 제거합니다. subsequen -80에서 정점과 기저 상층 액 및 저장 ° C를 제거T 분석. </li><li> 링 클램프를 제거하고 부드럽게 VDC를 분해. 반 챔버와 멸균 6 자 세포 배양 접시로 전송에서 필터를 제거합니다. 멸균 PBS 400 μL와 IECS 세 번 씻으십시오. </li><li> 상호 작용하는 세균의 총 수의 열거를 들어, 트리톤 X-100 IECS 0.1 %를 포함하는 멸균 PBS 400 μL (V / V)를 추가하고 IEC를 용해 실온에서 20 분 동안 품어. 다음 세균 CFUs 상호 작용의 수를 정량화하기 위해 48 시간 동안 변수 분위기 인큐베이터에서 37 ° C에서 알을 품다 세중의에서 혈액 한천 플레이트에 적절한 희석의 도금 이어이 세포 파쇄물에서 시리얼 희석을 수행합니다. </li><li> 침입 세균의 총 수의 열거를 들어, 5 % CO 2 95 %에서 37 표준 조직 문화 인큐베이터에서 2 시간 동안 IECS과 부화에 150 ㎍ / ㎖의 겐타 마이신을 포함하는 DMEM 세포 배양액 ° C의 400 μl를 추가 세포 박테리아를 죽일 공기,그런 다음 위의 단계 7.4 등 따릅니다. </li></ol> 8. 배양 후 VDC 청소 실험의 다음 라운드를 위해 멸균 물 저장소와 VDC를 씻으십시오.

<ol>
	<li>Mills, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increase+in+Campylobacter+jejuni+invasion+of+intestinal+epithelial+cells+under+low-oxygen+coculture+conditions+that+reflect+the+in+vivo+environment.">Increase in Campylobacter jejuni invasion of intestinal epithelial cells under low-oxygen coculture conditions that reflect the in vivo environment.</a> Infect. Immun. 80, 1690-1698 (2012).</li><li>Marteyn, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+Shigella+virulence+in+response+to+available+oxygen+in+vivo.">Modulation of Shigella virulence in response to available oxygen in vivo.</a> Nature. 465, 355-358 (2010).</li><li>Dorrell, N., Wren, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+second+century+of+Campylobacter+research:+recent+advances,+new+opportunities+and+old+problems.">The second century of Campylobacter research: recent advances, new opportunities and old problems.</a> Curr. Opin. Infect. Dis. 20, 514-518 (2007).</li><li>Young, K. T., Davis, L. M., Dirita, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Campylobacter+jejuni:+molecular+biology+and+pathogenesis.">Campylobacter jejuni: molecular biology and pathogenesis.</a> Nat. Rev. Microbiol. 5, 665-679 (2007).</li><li>Hu, L., Kopecko, D. J., Nachamkin, I., Szymanski, C. M., Blaser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+17.">Chapter 17.</a> Campylobacter. , 297-313 (2008).</li><li>Everest, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiated+Caco-2+cells+as+a+model+for+enteric+invasion+by+Campylobacter+jejuni+and+C.+coli.">Differentiated Caco-2 cells as a model for enteric invasion by Campylobacter jejuni and C. coli.</a> J. Med. Microbiol. 37, 319-325 (1992).</li><li>Konkel, M. E., Hayes, S. F., Joens, L. A., Cieplak, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+the+internalization+and+intracellular+survival+of+Campylobacter+jejuni+in+human+epithelial+cell+cultures.">Characteristics of the internalization and intracellular survival of Campylobacter jejuni in human epithelial cell cultures.</a> Microb. Pathog. 13, 357-370 (1992).</li><li>Monteville, M. R., Konkel, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin-facilitated+invasion+of+T84+eukaryotic+cells+by+Campylobacter+jejuni+occurs+preferentially+at+the+basolateral+cell+surface.">Fibronectin-facilitated invasion of T84 eukaryotic cells by Campylobacter jejuni occurs preferentially at the basolateral cell surface.</a> Infect. Immun. 70, 6665-6671 (2002).</li><li>Friis, L. M., Pin, C., Pearson, B. M., Wells, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+cell+culture+methods+for+investigating+Campylobacter+invasion+mechanisms.">In vitro cell culture methods for investigating Campylobacter invasion mechanisms.</a> J. Microbiol. Methods. 61, 145-160 (2005).</li><li>Schuller, S., Phillips, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microaerobic+conditions+enhance+type+III+secretion+and+adherence+of+enterohaemorrhagic+Escherichia+coli+to+polarized+human+intestinal+epithelial+cells.">Microaerobic conditions enhance type III secretion and adherence of enterohaemorrhagic Escherichia coli to polarized human intestinal epithelial cells.</a> Environ. Microbiol. 12, 2426-2435 (2010).</li><li>Cottet, S., Corthesy-Theulaz, I., Spertini, F., Corthesy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microaerophilic+conditions+permit+to+mimic+in+vitro+events+occurring+during+in+vivo+Helicobacter+pylori+infection+and+to+identify+Rho/Ras-associated+proteins+in+cellular+signaling.">Microaerophilic conditions permit to mimic in vitro events occurring during in vivo Helicobacter pylori infection and to identify Rho/Ras-associated proteins in cellular signaling.</a> J. Biol. Chem. 277, 33978-33986 (2002).</li></ol>

우리는 공개 아무것도 없어.

숙주 세포와 세균 병원균의 상호 작용을 연구하는 체외 세포 배양 방법에서의 사용은 널리 많은 연구 실험실에서 근무하는 기술입니다. 이러한 세포 배양 분석은 호기성 조건에서 수행됩니다 그러나, 이러한 체외 모델에서 정확하게 호스트 병원체 상호 작용이 일어날 수있는 생체 환경을 대표하지 않을 수 있습니다. 널리 생체 감염 모델에서 사용이 호기성 C....

숙주 세포와 세균 병원균의 상호 작용은 체외 세포 배양 방법에 사용 광범위하게 연구되고있다. 이러한 세포 배양 분석, 숙주 세포에 세균 부착, 숙주 세포 수용체 경로와 숙주 세포의 세균 침입 신호 숙주 세포의 식별을 사용하면 모든 많은 중요한 관찰의 결과로, 세부에서 공부하고 있습니다. 그러나 이러한 세포 배양 분석은 생체 환경에서 대표되지 않을 수 있습니다 호기성 조건에서 수행됩니다. 위장 감염을 연구하는 데 체외 모델에서의 주요 제한은 높은 산소 수준을 포함 배양 조건은 일반적으로 진핵 세포의 생존을 선호한다는 것입니다. 그러나 창자 루멘의 조건이 거의 혐기성 될 것입니다. 매우 낮은 산소 환경에서의 장내 병원체는 그의 표정 변화 호기성 조건 하에서 2 독성 유전자를 표현한다. 같은 데이터는 표준 셀 문화 모델 M을 사용하여 얻은바깥 호스트 세포와 세균 상호 작용의 부정확 한 표시를 제공합니다. 캄 필로 박터 속 jejuni는 가벼운 설사에서 심한 염증성 장염에 이르기까지 다양하는 증상, 세계적으로 세균성 급성 위장염의 주요 원인이되는 에이전트입니다. C. 대부분의 단순한 위장염에 속 jejuni 감염 결과, 그러나 C. 속 jejuni는 길랑 - 바레 증후군 (GBS) 등의 말초 신경 병증에서 가장 일반적으로 발견 전염성 에이전트입니다. 영국에서는, 그것은 C.에 의한 장염의 500,000 경우가있는 것으로 추정된다 5억8천만파운드의 영국 경제에 예상 비용으로 속 jejuni 감염 매년. 개발 도상국에서, C. 속 jejuni는 어린이들에게 사망의 주요 원인이다. 의심 할 여지 캄 필로 박터 감염의 중요성과 철저한 유전체학 기반의 분석, C. 등의 연구 수십 년,에도 불구하고 속 jejuni의 병인은 아직 저조한 underst입니다OOD, 살모넬라, 대장균, 이질균, 그리고 비브리오 콜레라 등의 장내 병원체에 대비합니다. 편리한 작은 동물 모델의 부족이 3 하나의 주요 이유입니다. 또한 널리 생체 감염 모델에서 사용이 호기성 C. 공부에 더 부적절 통성 혐기성있는 다른 장내 병원균에 비해 속 jejuni. 반면 C. 속 jejuni는 침입 병원체, C.의 메커니즘으로 인식되고 장 상피 세포의 속 jejuni의 침략 (IECS)는 여전히 4,5 불분명합니다. C. 속 jejuni의 침략은 어느 미사, 미세 소관,이 둘의 조합 또는 5도에 의존 것으로 표시되었습니다. 이 지역의 혼란은 아마 대부분 체외 분석 조건 부적절한 사용으로 인한 것입니다. 다른 세포 배양 분석의 수는 C의 상호 작용을 조사하는 데 사용되었습니다 속 jejuni숙주 세포와 함께. Caco-2 6, INT 407 7 및 T84 8 셀 라인은 모든 다른 C의 접착력과 침략 기능을 연구하는 데 사용되었습니다 속 jejuni 균주. 그러나 C.에 대한 세균의 부착과 침략의 수준 IECS에 속 jejuni 다른 장내 병원균 9보다 크게 낮다. C.의 coculturing IECS에 속 jejuni는 일반적으로 IECS의 생존에 필요한 공기 중의 산소 농도에 가까운 조건에서 CO 2 배양기에서 수행됩니다. C.는 속 jejuni 유전자 발현은 대기 중 산소 조건에 비해 창자 루멘의 낮은 산소 환경에서 매우 다른 것입니다. 수직 확산 회의소 (VDC) 시스템의 사용은 다른 매체와 가스 상태 1,10,11에서 세균과 숙주 세포의 배양을 허용하는 개발되었습니다. 이 시스템은 박테리아가 취소 될 사람의 대장의 조건을 모방매우 낮은 산소 반면 조직의 데르 조건은 혈류에서 산소 공급 될 것이다. 특수 0.4 μm의 필터에서 재배 편광 IEC 단층은 개별적으로 세균 배양액은 각각 세포 배양 배지 (그림 1) 가득 차 있었다 정점과 기저 외측 구획을 만드는 VDC에 배치되었다. VDC는 변수 분위기 인큐베이터가 37 ~ 85 % N 2, 5 % O 2, 10 % CO 2를 포함 ° C, C. 최적의 조건을 나타내는에 배치되었다 속 jejuni. 정점 함을 열어 왼쪽 변수 분위기 인큐베이터 내에서 호기성 (microaerobic) 대기에 노출되고, 밀봉 기저 함을 동안은 5 % CO 2 / 압력 축적을 방지 콘센트 튜브 95 % O 2 혼합 가스의 지속적인 관리에 의해 산소와 함께 제공된 . 이러한 조건에서 Caco-2 세포의 생존 및 단층 무결성 transepithelial ELE를 모니터링하여 확인 하였다24 시간 동안 단층에 걸쳐 ctrical 저항 (티이)는 정점 구획의 낮은 산소 조건에서 정점과 기저 외측 구획의 Caco-2 세포 단층 및 물리적 분리의 생존을 증명한다. 변수 분위기 인큐베이터 (호기성 (microaerobic) 조건)과 표준 셀 문화 CO 2 배양기 (호기성 조건)에서 유지 VDC에있는 단층의 봉사자는 다른 대기 조건 1에서 세포 단층의 무결성을 나타내는 유의 한 차이를 보이지 않았다. 호기성 (microaerobic) 조건에서, 꽉 분기점이 존재하고 균등 호기성 조건 1에서 유지 세포와 유사한 occludin 염색 패턴 셀 테두리 사이에 분포 남아 있었다. C.의 상호 작용 VDC의 Caco-2와 T84 세포 속 jejuni는 세균의 상호 작용 (접착력과 침략)와 침략을 평가하여 조사 하였다. 두 개의 서로 다른 C. jejuni와 야생형 straiNS는 1 사용 하였다. C.는 jejuni와 11168H는 원래 시퀀스 변형 NCTC11168의 hypermotile 파생됩니다. 11168H 변형 병아리 식민지 모델에서 더 높은 식민지 수준을 보여 주며, 따라서 호스트 병원체 상호 작용 연구에 사용하기 적합한 균주로 간주됩니다. 81-176은 인간을 분리하고 대부분의 침략 널리 연구 실험실의 변종 중 하나입니다. C.는 속 jejuni 균주는 호기성 (microaerobic) 또는 호기성 조건 중 하나에 따라 VDC의 정점 구획에 추가되었습니다. 우리는 상호 작용과 침략을 모두 더 높은 금리 C.에 대하여 관찰 호기성 (microaerobic) 조건 1 아래 속 jejuni. 증가 C. 속 jejuni의 상호 작용은 호기성 (microaerobic) 조건 1에 따라 세균 수의 증가로 인해 아니 었습니다. 이 데이터는 VDC의 정점 구획의 낮은 산소 환경은 박테리아 호스트 상호 작용을 강화하고 나타냅니다 우리의 가설을 지원하는 C의 침략 등록 속 jejuni는 매입 채무 및 기타 채무의 증가입니다이러한 조건 완화. 이 침입 세균 병원체를 공부하는 VDC 모델의 사용의 첫 번째 보고서이었고, 더 밀접하게 생체 내 상황을 모방하는 조건 하에서 생체 감염 분석의 수행의 중요성을 강조한다. VDC 모델은 여러 세균 종에 대한 호스트 병원체 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speciality vertical diffusion system for use with Snapwell inserts</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>66-0001</td>
			<td>Manifold &#38; six Snapwell chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caps</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>66-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-rings</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>66-0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clamps</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>66-0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snapwell filters (pore size 0.4 &#956;m)</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>3407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell ERS-2 Volt-Ohm resistance meter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MERS00002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WPA Lightwave II spectrophotometer</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>80-3003-72</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enteric bacterial invasion of intestinal epithelial cells in vitro is dramatically enhanced using a vertical diffusion chamber model

숙주 세포와 세균 병원균의 상호 작용은 체외 세포 배양 방법에 사용 광범위하게 연구되고있다. 이러한 세포 배양 분석은 호기성 조건에서 수행됩니다 그러나, 이러한 체외 모델에서 정확하게 호스트 병원체 상호 작용이 일어날 수있는 생체 환경을 대표하지 않을 수 있습니다. 우리는 다른 매체와 가스 조건에서 세균과 숙주 세포의 배양을 허용 감염의 체외 모델을 개발했습니다. 수직 확산 회의소 (VDC)의 모델은 박테리아가 매우 낮은 산소 반면 조직의 조건이 될 사람의 대장의 조건 혈류의 산소 공급됩니다를 모방. VDC에 Snapwell 삽입에서 재배 편광 장 상피 세포 (IEC) 단일 층을 배치하면 별도의 정점과 기저 외측 구획을 만듭니다. 기저 외측 구획, 세포 배양 배지로 채워 밀봉 산소 w로 관류됩니다혀끝 함을 hilst는 국물로 가득 차 있습니다, 계속 열려있는 호기성 (microaerobic) 조건에서 배양 하였다. Caco-2와 T84 두 IECS는 세포의 생존이나 단층 무결성에 대한 명백한 해로운 영향없이 이러한 조건에서 VDC 유지 될 수 있습니다. Coculturing 실험은 서로 다른 C.으로 수행 혀끝의 구획 호기성 (microaerobic) 조건 속 jejuni 야생형 균주와 VDC 모델의 다른 IEC 라인 재현성 호기성 배양 조건에 비해 상호 작용의 수 (약 10 배) 증가와 세포 내 (약 100 배) 박테리아의 원인 1. VDC 모델에서 만든 환경이 더 가깝게 C.에 의해 발생하는 환경을 모방 그리고 인간의 창자에 속 jejuni는 더 밀접하게 생체 내 현실 모방하는 조건 하에서 생체 감염 분석의 수행의 중요성을 강조한다. 우리는 VDC​​ 모델의 사용은 상호 작용의 새로운 해석 내기 있도록 제안세균성 병원체와 숙주 세포를 싸우는.

Coculturing 실험 C.으로 수행 jejuni와 야생형 균주 및 치근단 구획 호기성 (microaerobic) 조건 VDC 모델 IECS는 시간에 호기성 배양 조건에 비해 상호 작용의 수 증가 (약 10 배)과 세포 내 (약 100 배) 박테리아를 증명하고있다 의존적으로 1. 이 관찰은 두 개의 서로 다른 C를 사용하여 재현했다 속 jejuni는 야생형 균주 (11168H 및 81-176)와 두 개의 서로 다른 IEC 라인 (Caco-2 및 T84),...

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Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

호기성 조건에서 박테리아의 부착 및 침입 조사를위한 세포 배양 분석을 수행하면의 일반적으로 대표성이다<em&gt; 생체 내</em&gt; 환경을 제공합니다. 수직 확산 챔버 모델은 인간의 병원체의 상호 작용을 연구 할 수 있습니다<em&gt; 캄 필로 박터 속 jejuni</em&gt; 더 아래에 장 상피 세포와<em&gt; 생체 내</em조건&gt;과 같은 향상된 세균 침입의 결과로.

장 상피 세포의 장내 세균의 침입<em&gt; 체외</em&gt; 크게 수직 확산 챔버 모델을 사용하여 향상

The interactions of bacterial pathogens with host cells have been investigated extensively using in vitro cell culture methods. However as such cell ...

enteric-bacterial-invasion-intestinal-epithelial-cells-vitro-is

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

13.7K 조회수.  London School of Hygiene & Tropical Medicine. 호기성 조건에서 박테리아의 부착 및 침입 조사를위한 세포 배양 분석을 수행하면의 일반적으로 대표성이다 생체 내 환경을 제공합니다. 수직 확산 챔버 모델은 인간의 병원체의 상호 작용을 연구 할 수 있습니다 캄 필로 박터 속 jejuni 더 아래에 장 상피 세포와 생체 내과 같은 향상된 세균 침입의 결과로.

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In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. Biofilms are community-associated bacteria attached to a surface and encased in a matrix. The role of the extracellular matrix is multifaceted, including facilitating nutrient acquisition, and offers significant protection against environmental stresses (e.g. host immune responses). In an effort to acquire a better understanding as to how the bacteria within a biofilm respond to environmental stresses we have used a protocol wherein we visualize bacterial biofilms which have formed in an 8-well chamber slide. The biofilms were stained with the BacLight Live/Dead stain and examined using a confocal microscope to characterize the relative biofilm size, and structure under varying incubation conditions. Z-stack images were collected via confocal microscopy and analyzed by COMSTAT. This protocol can be used to help elucidate the mechanism and kinetics by which biofilms form, as well as identify components that are important to biofilm structure and stability.

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

This article describes the procedure for the formation and visualization of a bacterial biofilm grown within an 8-well chamber slide

8 잘 회의소 슬라이드에서 체외의 Biofilm 형성에

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

연구

면역학 및 감염병학

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes. In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific immune cell types, viral pathogens, parasites and bacteria can be followed in real-time within living animals 1-2. Application of bioluminescence imaging to the study of pathogens has advantages as compared to conventional strategies for analysis of infections in animal models3-4. Infections can be visualized within individual animals over time, without requiring euthanasia to determine the location and quantity of the pathogen. Optical imaging allows comprehensive examination of all tissues and organs, rather than sampling of sites previously known to be infected. In addition, the accuracy of inoculation into specific tissues can be directly determined prior to carrying forward animals that were unsuccessfully inoculated throughout the entire experiment. Variability between animals can be controlled for, since imaging allows each animal to be followed individually. Imaging has the potential to greatly reduce animal numbers needed because of the ability to obtain data from numerous time points without having to sample tissues to determine pathogen load3-4.
This protocol describes methods to visualize infections in live animals using bioluminescence imaging for recombinant strains of bacteria expressing luciferase. The click beetle (CBRLuc) and firefly luciferases (FFluc) utilize luciferin as a substrate5-6. The light produced by both CBRluc and FFluc has a broad wavelength from 500 nm to 700 nm, making these luciferases excellent reporters for the optical imaging in living animal models7-9. This is primarily because wavelengths of light greater than 600 nm are required to avoid absorption by hemoglobin and, thus, travel through mammalian tissue efficiently. Luciferase is genetically introduced into the bacteria to produce light signal10. Mice are pulmonary inoculated with bioluminescent bacteria intratracheally to allow monitoring of infections in real time. After luciferin injection, images are acquired using the IVIS Imaging System. During imaging, mice are anesthetized with isoflurane using an XGI-8 Gas Anethesia System. Images can be analyzed to localize and quantify the signal source, which represents the bacterial infection site(s) and number, respectively. After imaging, CFU determination is carried out on homogenized tissue to confirm the presence of bacteria. Several doses of bacteria are used to correlate bacterial numbers with luminescence. Imaging can be applied to study of pathogenesis and evaluation of the efficacy of antibacterial compounds and vaccines.

Methods for bioluminescence imaging of bacterial infections in living animals are decribed. Pathogens are modified to express luciferase allowing optical whole body imaging of infections in live animals. Animal models can be infected with luciferase expressing pathogens and the resulting course of disease visualized in real-time by bioluminescence imaging.

마우스의 이미지 세균 감염에 루시페라제를 사용하여

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be applied to the study of cell invasion by virtually any culturable bacterium. The stages at which specific aspects of invasion can be studied, such as the role of actin rearrangement or caveolae, will be highlighted. Host cells are grown in flasks and when ready for use are seeded into 24-well plates containing Thermanox coverslips. Using coverslips allows subsequent removal of the cells from the wells to reduce interference from serum proteins deposited onto the sides of the wells (to which S. aureus would attach). Bacteria are grown to the required density and washed to remove any secreted proteins (e.g. toxins). Coverslips with confluent layers of endothelial cells are transferred to new 24-well plates containing fresh culture medium before the addition of bacteria. Bacteria and cells are then incubated together for the required amount of time in 5% CO2 at 37&deg;C. For S. aureus this is typically between 15-90 minutes. Thermanox coverslips are removed from each well and dip-washed in PBS to remove unattached bacteria. If total associated bacteria (adherent and internalised) are to be quantified, coverslips are then placed in a fresh well containing 0.5% Triton X-100 in PBS. Gentle pipetting leads to complete cell lysis and bacteria are enumerated by serial dilution and plating onto agar. If the number of bacteria that have invaded the cells is needed, coverslips are added to wells containing 500 &mu;l tissue culture medium supplemented with gentamicin and incubation continued for 1 h, which will kill all external bacteria. Coverslips can then be washed, cells lysed and bacteria enumerated by plating onto agar as described above. If the experiment requires direct visualisation, coverslips can be fixed and stained for light, fluorescence or confocal microscopy or prepared for electron microscopy.

A general protocol for the study of invasion of host cells by a bacterial pathogen, focusing on Staphylococcus aureus and human endothelial cells.

세균성 병원체에 의해 인간의 세포의 침략

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be ...

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host cells1. These adhesins rely on interactions with host cell surface receptors or soluble proteins acting as a bridge between bacteria and host. Adhesion is a critical first step prior to invasion and/or secretion of toxins, thus it is a key event to be studied in bacterial pathogenesis. Furthermore, adhered bacteria often induce exquisitely fine-tuned cellular responses, the studies of which have given birth to the field of 'cellular microbiology'2. Robust assays for bacterial adhesion on host cells and their invasion therefore play key roles in bacterial pathogenesis studies and have long been used in many pioneer laboratories3,4. These assays are now practiced by most laboratories working on bacterial pathogenesis.
Here, we describe a standard adherence assay illustrating the contribution of a specific adhesin. We use the Escherichia coli strain 27875, a human pathogenic strain expressing the autotransporter Adhesin Involved in Diffuse Adherence (AIDA). As a control, we use a mutant strain lacking the aidA gene, 2787&Delta;aidA (F. Berthiaume and M. Mourez, unpublished), and a commercial laboratory strain of E. coli, C600 (New England Biolabs). The bacteria are left to adhere to the cells from the commonly used HEp-2 human epithelial cell line. This assay has been less extensively described before6.

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

This protocol is a simple bacterial adhesion assay consisting in counting the numbers of bacterial colony forming units that are adhered onto cultured cells. The assay is robust, independent of the adhesin studied, and numerous variations are used in most laboratories working on bacterial pathogenesis.

포유류의 상피 세포에 박테리아의 접착 시험 관내 분석

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed to them and occasionally to pathogens. The gut-associated lymphoid tissue (GALT) play a key role for induction of the mucosal immune response to these microbes1, 2. To initiate the mucosal immune response, the mucosal antigens must be transported from the gut lumen across the epithelial barrier into organized lymphoid follicles such as Peyer's patches. This antigen transcytosis is mediated by specialized epithelial M cells3, 4. M cells are atypical epithelial cells that actively phagocytose macromolecules and microbes. Unlike dendritic cells (DCs) and macrophages, which target antigens to lysosomes for degradation, M cells mainly transcytose the internalized antigens. This vigorous macromolecular transcytosis through M cells delivers antigen to the underlying organized lymphoid follicles and is believed to be essential for initiating antigen-specific mucosal immune responses. However, the molecular mechanisms promoting this antigen uptake by M cells are largely unknown. We have previously reported that glycoprotein 2 (Gp2), specifically expressed on the apical plasma membrane of M cells among enterocytes, serves as a transcytotic receptor for a subset of commensal and pathogenic enterobacteria, including Escherichia coli and Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), by recognizing FimH, a component of type I pili on the bacterial outer membrane 5. Here, we present a method for the application of a mouse Peyer's patch intestinal loop assay to evaluate bacterial uptake by M cells. This method is an improved version of the mouse intestinal loop assay previously described 6, 7. The improved points are as follows: 1. Isoflurane was used as an anesthetic agent. 2. Approximately 1 cm ligated intestinal loop including Peyer's patch was set up. 3. Bacteria taken up by M cells were fluorescently labeled by fluorescence labeling reagent or by overexpressing fluorescent protein such as green fluorescent protein (GFP). 4. M cells in the follicle-associated epithelium covering Peyer's patch were detected by whole-mount immunostainig with anti Gp2 antibody. 5. Fluorescent bacterial transcytosis by M cells were observed by confocal microscopic analysis. The mouse Peyer's patch intestinal loop assay could supply the answer what kind of commensal or pathogenic bacteria transcytosed by M cells, and may lead us to understand the molecular mechanism of how to stimulate mucosal immune system through M cells.

Application of a Mouse Ligated Peyer&amp;#8217;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

M cells in a specialized follicle-associated epithelium covering Peyer&#x2019;s patches play an important role for the mucosal immunosurveillance in gut-associated lymphoid tissue. Here we described the evaluation method for bacterial transcytosis by M cells in vivo. This method provides a method to understand M-cell function in the immune system.

마우스의 응용은 M 세포에 의해 박테리아 이해를 평가하는 Peyer의 패치 장 루프 분석 출혈도 잡았

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Determination of Tolerable Fatty Acids and Cholera Toxin Concentrations Using Human Intestinal Epithelial Cells and BALB/c Mouse Macrophages

The positive role of fatty acids in the prevention and alleviation of non-human and human diseases have been and continue to be extensively documented. These roles include influences on infectious and non-infectious diseases including prevention of inflammation as well as mucosal immunity to infectious diseases. Cholera is an acute intestinal illness caused by the bacterium Vibrio cholerae. It occurs in developing nations and if left untreated, can result in death. While vaccines for cholera exist, they are not always effective and other preventative methods are needed. We set out to determine tolerable concentrations of three fatty acids (oleic, linoleic and linolenic acids) and cholera toxin using mouse BALB/C macrophages and human intestinal epithelial cells, respectively. We solubilized the above fatty acids and used cell proliferation assays to determine the concentration ranges and specific concentrations of the fatty acids that are not detrimental to human intestinal epithelial cell viability. We solubilized cholera toxin and used it in an assay to determine the concentration ranges and specific concentrations of cholera toxin that do not statistically decrease cell viability in BALB/C macrophages. 
We found the optimum fatty acid concentrations to be between 1-5 ng/&mu;l, and that for cholera toxin to be &lt; 30 ng per treatment. This data may aid future studies that aim to find a protective mucosal role for fatty acids in prevention or alleviation of cholera infections.

We set out to determine tolerable concentrations of three fatty acids (oleic, linoleic and linolenic acids) and cholera toxin that did not significantly and adversely affect cell survival by solubilizing the fatty acids and the toxin and using them in cell survival assays.

인간의 장내 상피 세포와 BALB / C 마우스 대 식세포를 사용하여 웬만한 지방산과 콜레라 독소 농도의 결정

The positive role of fatty acids in the prevention and alleviation of non-human and  human diseases have been and continue to be extensively documented. ...

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to the infiltration of tissues with migrating inflammatory cells, primarily neutrophils.&#160;This process has the potential to be destructive to tissues if excessive or held in an unresolved state.&#160; Cocultured in vitro models can be utilized to study the unique molecular mechanisms involved in pathogen induced neutrophil trans-epithelial migration.&#160;This type of model provides versatility in experimental design with opportunity for controlled manipulation of the pathogen, epithelial barrier, or neutrophil.&#160;Pathogenic infection of the apical surface of polarized epithelial monolayers grown on permeable transwell filters instigates physiologically relevant basolateral to apical trans-epithelial migration of neutrophils applied to the basolateral surface.&#160;The in vitro model described herein demonstrates the multiple steps necessary for demonstrating neutrophil migration across a polarized lung epithelial monolayer that has been infected with pathogenic P. aeruginosa (PAO1).&#160;Seeding and culturing of permeable transwells with human derived lung epithelial cells is described, along with isolation of neutrophils from whole human blood and culturing of PAO1 and nonpathogenic K12 E. coli (MC1000).&#160; The emigrational process and quantitative analysis of successfully migrated neutrophils that have been mobilized in response to pathogenic infection is shown with representative data, including positive and negative controls.&#160;This in vitro model system can be manipulated and applied to other mucosal surfaces.&#160;Inflammatory responses that involve excessive neutrophil infiltration can be destructive to host tissues and can occur in the absence of pathogenic infections.&#160;A better understanding of the molecular mechanisms that promote neutrophil trans-epithelial migration through experimental manipulation of the in vitro coculture assay system described herein has significant potential to identify novel therapeutic targets for a range of mucosal infectious as well as inflammatory diseases.

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Neutrophil trans-epithelial migration in response to mucosal bacterial infection contributes to epithelial injury and clinical disease.&#160;An in vitro model has been developed that combines pathogen, human neutrophils, and polarized human epithelial cell layers grown on transwell filters to facilitate investigations towards unraveling the molecular mechanisms orchestrating this phenomenon.

시험관 내 병원균 유도 호중구 트랜스 상피 이동을 평가하는 공동 문화 분석

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised patients, the elderly, and pregnant women. The most common manifestations of listeriosis in humans include meningitis, encephalitis, and fetal abortion. A significant but much less documented sequelae of invasive L. monocytogenes infection involves the heart. The death rate from cardiac illness can be up to 35% despite treatment, however very little is known regarding L. monocytogenes colonization of cardiac tissue and its resultant pathologies. In addition, it has recently become apparent that subpopulations of L. monocytogenes have an enhanced capacity to invade and grow within cardiac tissue. This protocol describes in detail in vitro and in vivo methods that can be used for assessing cardiotropism of L. monocytogenes isolates. Methods are presented for the infection of H9c2 rat cardiac myoblasts in tissue culture as well as for the determination of bacterial colonization of the hearts of infected mice. These methods are useful not only for identifying strains with the potential to colonize cardiac tissue in infected animals, but may also facilitate the identification of bacterial gene products that serve to enhance cardiac cell invasion and/or drive changes in heart pathology. These methods also provide for the direct comparison of cardiotropism between multiple L. monocytogenes strains.

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes causes fetal infections in pregnant women and meningitis in susceptible populations. Subpopulations of bacteria can colonize cardiac tissue, causing myocarditis in patients and laboratory animals. Here we present a protocol that describes how to assess L. monocytogenes cardiac cell invasion in vitro and cardiac colonization in infected animals.

리스테리아 단세포 유전자를 사용하여 감염된 마우스에 있는 문화와 심혼 식민지에 있는 심장 세포의 세균성 침략 평가

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

Immunofluorescence Analysis of Stress Granule Formation After Bacterial Challenge of Mammalian Cells

Fluorescent imaging of cellular components is an effective tool to investigate host-pathogen interactions. Pathogens can affect many different features of infected cells, including organelle ultrastructure, cytoskeletal network organization, as well as cellular processes such as Stress Granule (SG) formation. The characterization of how pathogens subvert host processes is an important and integral part of the field of pathogenesis. While variable phenotypes may be readily visible, the precise analysis of the qualitative and quantitative differences in the cellular structures induced by pathogen challenge is essential for defining statistically significant differences between experimental and control samples. SG formation is an evolutionarily conserved stress response that leads to antiviral responses and has long been investigated using viral infections1. SG formation also affects signaling cascades and may have other still unknown consequences2. The characterization of this stress response to pathogens other than viruses, such as bacterial pathogens, is currently an emerging area of research3. For now, quantitative and qualitative analysis of SG formation is not yet routinely used, even in the viral systems. Here we describe a simple method for inducing and characterizing SG formation in uninfected cells and in cells infected with a cytosolic bacterial pathogen, which affects the formation of SGs in response to various exogenous stresses. Analysis of SG formation and composition is achieved by using a number of different SG markers and the spot detector plug-in of ICY, an open source image analysis tool.

We describe a method for the qualitative and quantitative analysis of stress granule formation in mammalian cells after the cells are challenged with bacteria and a number of different stresses. This protocol can be applied to investigate the cellular stress granule response in a wide range of host-bacterial interactions.

포유류 세포의 박테리아 감염 후 스트레스 과립 형성의 면역 형광 분석

Fluorescent imaging of cellular components is an effective tool to investigate host-pathogen interactions. Pathogens can affect many different features of ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing activity by assessing the ability of antibodies in serum to bind to bacteria and activate complement. This complement activation results in the lysis and killing of the target bacteria. These assays are valuable because they go beyond quantifying antibody production to elucidate the biological functions that these antibodies have, allowing researchers to study the role that antibodies may play in preventing infection. SBAs have been used to study immune responses for many human pathogens, but there is no widely accepted methodology for Shigella at present. Historically, SBAs have been very labor-intensive, requiring many time-consuming steps to accurately quantify surviving bacteria. This protocol describes a simple, robust, and high-throughput assay that measures functional antibodies specific for Shigella in serum in vitro. The method described here offers many advantages over traditional SBAs, including the use of frozen bacterial stocks, 96 well assay plates, a micro-culture system, and automated colony-counting. All of these modifications make this assay less labor-intensive and more high-throughput. This protocol is simpler and faster to perform than traditional SBAs while still using simple technologies and readily available reagents. The protocol has been successfully applied in multiple independent laboratories and the assay is robust and reproducible. The assay can be used to assess immune responses in pre-clinical as well as clinical studies. Quantifying shigellacidal antibody titers both before and after antigen exposure (either by immunization or infection) allows for a broader understanding of how functional antibody responses are generated and their contribution to protective immunity. The development of this standardized, well-characterized assay may greatly facilitate Shigella vaccine design.

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Here we present a protocol to measure Shigellacidal activity of antibodies in serum. Serum is mixed with bacteria and exogenous complement, incubated, and the reaction mixture is plated on agar plates. Viable bacteria form colonies which are counted, using an automated colony enumerator, and used to determine the bactericidal titer.

높은 처리량 Shigella-특정 살 균 시험

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...