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다음 프로토콜은 S.에 의해 내피 세포의 침략의 연구를 설명합니다 구균하지만은 이론적으로 모든 culturable 세균에 의해 세포 침략을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. S. 특정 단계 구균과 내피 세포가 표시됩니다. 1. 박테리아의 준비 <ol><li> 문화 S. 37 10 ML 뇌 - 심장 주입 (BHI) 국물에 4-16 H (필수 성장 단계에 따라 다름) ° C 200 rpm으로 잡고 공중에 대한 구균의 변종. 이러한 성장 조건 S.에 대한 구체적인 구균 및 기타 세균에 맞게해야 할 수 있습니다. </li><li> 실온 (5,000 X g, 10 분), DMEM의 상응하는 볼륨에있는 세균성 펠렛의 문화 뜨는 및 resuspension 제거에서 원심 분리의 다른 라운드로, 박테리아에게 Dulbecco의 수정된 이글의 중간에 세 번 (Invitrogen DMEM)을 씻으십시오. 필요에 따라 다음 조정할 수 있습니다 박테리아의 발생 정지의 광학 밀도를 측정합니다. S. 들어 구균, 우리는 ~ 10 9 cfu ML -1에 해당하는 OD 600 = 1에서 중지를 준비합니다. </li></ol> 2. 내피 세포 배양 <ol><li> 37과 L - 글루타민 (2 ㎜) ° C 5 % CO 2를, 문화 DMEM에있는 내피 세포 라인 EA.hy926 1 태아 소 혈청 (10 % FBS)과 보완. 또는 풀링 기본 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVECs) Lonza (스위스 바젤)에서 구입하여 37 2% FBS, 소 뇌 추출물 (헤파린 포함), 인간 내피 성장 인자와 하이드로코티손와 보충 내피 기초 매체 교양 수 있습니다 ° C 5 % CO 2 제조 업체의 지침 (Lonza)에 따라. 이러한 성장 조건이 세포에 대한 구체적인되며 다른 숙주 세포 유형에 대한 적응해야 할 수 있습니다. </li><li> 눈으로 확인, confluency 완료 T75 flasks의 내피 세포를 성장. </li><li> coverslips의 삽입을위한 24 잘 접시를 준비합니다. 좋은 포셉는 (화염 소독) 1 불투명 하나 반짝 이는 표면을 가지고 coverslips를 이동 필요합니다. 셀 첨부 파일을 허용하는 이상 직면하고있는 불투명 표면 24 잘 접시의 우물에서 플레이스 coverslips. </li><li> 3 ML 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (0.25 %)와 T75 플라스크에서 세포를 해방 및 관련 문화 매체의 10 ML에 추가할 수 있습니다. </li><li> Thermanox 유리 coverslips를 포함하는 24 잘 접시에 resuspended 셀 500 μl를 추가합니다. 세포 중 하나 T75 합류 플라스크는 약 5 × 잘 발생 당 10 5 세포를 (500 μl 매체) 두 24 잘 접시에 충분한 세포를 제공했습니다. </li><li> 위에서 설명한대로 48 H에 대한 번호판을 품어하고, 거꾸로 가벼운 현미경에 의해 confluency 100 % 세포를 확인하십시오. </li><li> 딥 - 세척 PBS에서 coverslips을 각 잘에서 10 % FBS를 포함한 DMEM 490 μl를 포함하는 새로운 24 잘 접시에 추가할 수 있습니다. </li><li> 셀 침공에서 특정 대사 과정의 역할을 확인하려면, 저해제는 H 전 분석 기간 동안 유지 박테리아와 농도의뿐만 아니라 교양 세포 하나에 추가할 수 있습니다. 예를 들어, 미국에서 굴지의 다시 정리하기의 역할을 결정하기 위해 내피 세포의 구균의 침공, 50 μm의 cytochalasin D가 추가될 수 있습니다, 또는 caveolae 5의 역할에 대한 MM은 메틸 - β - 사이클로 덱스트린 추가할 수 있습니다. </li></ol> 3. 상륙 작전 분석 <ol><li> 잘 10% FBS를 포함한 DMEM 490 μl의 내피 세포의 합류 레이어로 씻은 coverslip을 포함하는 각 씻어 세균 10 μl를 (약 2 × 10 7 cfu ML -1 S. 구균의 결과)을 추가합니다. </li><li> 37 15-90분에 대한 품어 ° C를 5% CO 2인치 </li><li> 세포 (자기편과 internalized)과 관련된 세균의 총 수를 측정하려면 coverslips에게 PBS로 세 번 찍어 - 씻어과 PBS 500 μl 0.5 % 트리톤 X - 100을 포함하는 새 우물을 추가할 수 있습니다. 세포가 완전히 모든 internalized 박테리아를 lyse하고 릴리스하기 위해, 직접 coverslip의 표면에있는 피펫의 팁을 지적, 여러 번 피펫. </li><li> TSA 플레이트의 표면에 액체 현탁액 (또는 필요의 dilutions)을 도금하여 박테리아를 열거합니다. TX - 100는 많은 그람 음성 박테리아를 lyse 때문에, 사포닌 대신이 사용할 수 있습니다. </li><li> internalized 박테리아의 수를 측정하려면 각 물론 포함 언바운드 박테리아의 문화 뜨는을 제거하고 200 μg ML -1 gentamicin과 보충 500 μl DMEM/10 % FBS로 바꿉니다. 우리는 일상적으로 그것이 저렴 여기에 오히려 lysostaphin보다 gentamicin을 사용하여 우리가 실험 프로토콜을 변경하지 않고 세균의 종류 (예 : Staphylococci 및 Lactococci)를 사용하여 실험을 전환할 수 있습니다. </li><li> 37 접시를 품어 ° C 모든 세포 박테리아를 죽이는 60 분 5 % CO 2인치 </li><li> , coverslips에게 PBS로 3 회 씻어TSA에 도금하여 lyse 및 열거는 위의 부착 분석에 대해 설명했다. </li><li> 어떤 경우에는 그것은 시각적으로 빛을 현미경을 사용하여 박테리아의 수를 계산하는 것이 바람직있을 수 있습니다. 이 경우, 그리고 특정 S.하기 구균 세포 침공은 물리적 세포외 박테리아를 파괴하는 대신 gentamicin의 lysostaphin (10 μg ML -1)을 사용합니다. </li><li> 37 20 분 대한 coverslips을 품어 ° CO 2 C는 lysostaphin 솔루션에서 다음 씻어 Cytopath (Cellpath)로 수정. </li><li> 5 분을위한 크리스탈 바이올렛 (0.5 %, W / V)와 coverslips을 홍수. </li><li> 물, 공기 건조에 수영 - 씻어 유리 슬라이드에 탑재합니다. 합류 내피 세포의 mm 2 당 박테리아의 수는 빛을 현미경을 사용하여 계량하실 수 있습니다. </li></ol> 4. 대표 결과 : S. 표면에 fibronectin 단백질 바인딩 표현 (FnBPA 및 FnBPB) 구균은 내피 세포를 침공하는 능력을 수여. 최근 작업은 FnBPA 3 fibronectin 바인딩 도메인을 재정의했다. 야생 유형 (WT) S. 구균 8325.4 높은 효율과 내피 세포를 침공, FnBPA 및 B (Δ fnb)를 모두 부족 부담이 크게 감소 internalisation의 수준 (그림 1A)을 보여주었다 반면. 플라스미드 인코딩 fnb과 돌연변이의 Complementation 마이너스 fibronectin 결합 도메인 (pFnR0)는 (그림 1A) 침략을 추진하지 않았다. 반대로, 플라스미드 인코딩 전체 fnb WT 수준 (그림 1A)에 침략을 회복 유전자 (pFnBA4)와 돌연변이의 complementation. 내피 세포의 침공에 FnBPA의 역할도 heterologous 표현 호스트 Lactococcus lactis를 사용하여 제품 시연 수 있습니다. L.의 플라스미드 인코딩 FnBPA 표현 lactis (pRM9 9) 크게도 FnBPA (CTL)을 (오픈 바, 그림 1B) 표현하지 박테리아에 비해 내피 세포 접착력을 강화하지 않았다. 반대로, 난 FnBPA - 표현 lactis가 아닌 표현을 변형 (폐쇄 바, 그림 1B)보다 상당히 높은 수준에서 내피 세포를 침공. 실험은 네 중복의 시간과 평균 ± 표준 편차가 제시을 수행했다. *이 WT 또는 CTL 값에서 (P는 = &lt;0.05) 통계적으로 크게 다른 데이터를 나타냅니다. <img src="/files/ftp_upload/2693/2693fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. EA의 침략. S.에 의해 내피 세포 Hy926 구균 (A) 또는 L. lactis (B).

<ol>
	<li>Edgell, C. J., McDonald, C. C., Graham, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permanent+cell+line+expressing+human+factor+VIII-related+antigen+established+by+hybridization.">Permanent cell line expressing human factor VIII-related antigen established by hybridization.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 80, 3734-3737 (1983).</li><li>Makino, S., van Putten, J. P., Meyer, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+variation+of+the+opacity+outer+membrane+protein+controls+invasion+by+Neisseria+gonorrhoeae+into+human+epithelial+cells.">Phase variation of the opacity outer membrane protein controls invasion by Neisseria gonorrhoeae into human epithelial cells.</a> EMBO J. 10, 1307-1315 (1991).</li><li>Schwarz-Linek, U., Werner, J. M., Pickford, A. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusobacterium+nucleatum+transports+noninvasive+Streptococcus+cristatus+into+human+epithelial+cells.">Fusobacterium nucleatum transports noninvasive Streptococcus cristatus into human epithelial cells.</a> Infect. Immun. 74, 654-662 (2006).</li><li>Menzies, B. E., Kourteva, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internalization+of+Staphylococcus+aureus+by+Endothelial+Cells+Induces+Apoptosis.">Internalization of Staphylococcus aureus by Endothelial Cells Induces Apoptosis.</a> Infect. Immun.. 66, 5994-5998 (1998).</li><li>Schr&#246;der, A., Schröder, B., Roppenser, B., Linder, S., Sinha, B., Fässler, R., Aepfelbacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+fibronectin+binding+protein-A+induces+motile+attachment+sites+and+complex+actin+remodeling+in+living+endothelial+cells.">Staphylococcus aureus fibronectin binding protein-A induces motile attachment sites and complex actin remodeling in living endothelial cells.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 5198-5210 (2006).</li><li>Molinari, G., Rohde, M., Talay, S. R., Chhatwal, G. S., Beckert, S., Podbielski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+played+by+the+group+A+streptococcal+negative+regulator+Nra+on+bacterial+interactions+with+epithelial+cells.">The role played by the group A streptococcal negative regulator Nra on bacterial interactions with epithelial cells.</a> Mol. Microbiol. 40, 99-114 (2001).</li><li>Cue, D., Dombek, P. E., Lam, H., Cleary, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+pyogenes+serotype+M1+encodes+multiple+pathways+for+entry+into+human+epithelial+cells.">Streptococcus pyogenes serotype M1 encodes multiple pathways for entry into human epithelial cells.</a> Infect. Immun. 66, 4593-4601 (1998).</li><li>Eiff, C. v. o. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+small+colony+variants:+a+challenge+to+microbiologists+and+clinicians.">Staphylococcus aureus small colony variants: a challenge to microbiologists and clinicians.</a> Int J. Antimicrob. Agents. 31, 507-510 (2008).</li><li>Oliver, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+findings+on+the+viable+but+nonculturable+state+in+pathogenic+bacteria.">Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria.</a> FEMS Microbiol. Rev. 34, 415-425 (2010).</li><li>Wang, B., Yurecko, R. S., Dedhar, S., Cleary, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-linked+kinase+is+an+essential+link+between+integrins+and+uptake+of+bacterial+pathogens+by+epithelial+cells.">Integrin-linked kinase is an essential link between integrins and uptake of bacterial pathogens by epithelial cells.</a> Cell. Microbiol. 8, 257-266 (2006).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

<html> 우리가 설명하는 분석은 세균에 의해 호스트 세포의 침략을 연구하기 위해 널리 사용되었습니다 gentamicin 보호 분석에 따라 달라집니다. 세포내 박테리아를 죽이는 gentamicin과 다른 항생제의 무능력의 관찰은 세균 4-8으로 호스트 세포의 침공에 대한 초기 연구에 이용 하였다. 24, 48 또는 96 - 웰 플레이트의 사용 시간이 짧은 기간에 상대적으로 저렴한 비용 정량, 재현성 대용량 데이터의 생성하실 수 있습니다. 그것도 전문 장비를 필요로하지 않습니다, 그것은 다양한 박테리아와 세포와 함께 작동하도록 맞춤 수 있으며, 침공 9 박테리아와 호스트 둘 다 셀 프로세스의 역할을 연구하는 데 사용될 수 있기 때문에 분석도 매력적입니다. 사실, 최초의 실험 이후, gentamicin 보호 분석 널리 다른 세균이나 세균이 10,11의 조합도의 범위에 의해 숙주 세포의 침공을 측정하는 고용되었습니다. 핵심 원칙은 그 방법에서 같은 많은 미묘한 변화 아르 반면 것은보고되었습니다. 이 문서에서 우리는 우리의 버전을 설명하고 수정이 다른 세균이나 호스트 세포에 필요한 수 있습니다 어디에 표시합니다. 고려하는 것이 중요 포인트의 숫자가이 접근법을 이용하여 숙주 세포의 공격을 측정하는 실험을 디자인할 때 : gentamicin에 박테리아 감도. 이것은 당연한 보일지도 모르지만,이 방법은 연구되고있는 박테리아는 농도, 온도 및 사용하는 시간이 기간 동안 gentamicin 쉽습 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 무감각의 경우, 다른 항생제에게 5 사용할 수 있습니다. 대체 접근법은 lytic 효소 (lysostaphin, mutanolysin, 라이 소 자임) 12를 사용하실 수 있습니다. 부화 및 inoculum가. 처음이 분석을 수행하면 그것은 사용할 최적의 배양 시간 및 박테리아 inoculum를 확립하는 것이 중요합니다. 따라서, 초기 실험은 시간이 지남에 따라 접착력과 침략 (최대 6 H 5 분)를 모두 검사해야합니다. 그것은 침략이 감염의 다중성에 의해 영향을 얼마나 평가하는 것도 중요하다 (뫄, 셀 당 박테리아의 숫자). 일반적으로 이것은 교양 세포에 손상을 줄일 수 가능한 박테리아의 가장 적은 번호를 사용하는 것이 최선입니다. 확장 부화 기간이나 대형 inocula는 9,13를 사용하는 경우 변종 사이의 중요한 차이점은 놓칠 수 있습니다. 세포 손상. 사용하기 전에 박테리아를 씻어하는 것이 중요합니다. 그러나, 세포 손상이 독소 생산에 국한되지 않습니다. 세균성 침략, apoptosis와 정상 세포 기능 장애의 유도는 세포 손상을 일으킬 수 있습니다. 이것은 internalized 박테리아를 죽이고 침략은 14 발생하지 않은 것으로 간주하고있다는 인상을주는, 셀에 gentamicin의 침투 될 수 있습니다. 배양 조건. 온도와 배지의 구성은 침략에 큰 영향을 줄 수 있습니다. 예를 들어, 연쇄상 구균의 pyogenes의 헬라 세포의 침공은 일반적으로 혈청 15 존재 용해 fibronectin의 존재에 의존적일 수 밖에 없습니다. 또 다른 고려 사항은 실험 과정 동안 배지에 박테리아 성장이다. 문화 세포내 박테리아의 부량. TX - 100 세포내 박테리아를 죽일 수 있지만, 그건 자신의 성장을 억제 수 있습니다. 따라서 세제의 면전에서 고체 미디어에 박테리아 복제를 확인하는 것이 중요합니다. 영향을 어디에, 그것은 세제의 낮은 농도를 사용하거나 같은 사포닌과 같은 대안을 사용할 수 있습니다. 크리스탈 보라색 얼룩 및 현미경 분석을 통해 gentamicin 보호 분석의 장점은 적은 노동 집약되어​​ 있으며, 그것은 감​​지 및 internalized 박테리아의 하위 인구의 차별을 허용합니다. 예를 들어, S. 구균도 정상적인 식민지 유형 (NCT) 또는 개별 세균 세포의 현미경으로 구별할 수 없을 것입니다 작은 콜로니 변종 (SCV) 16, 생성할 수 있습니다. gentamicin 보호 분석을 통해 크리스탈 보라색 얼룩 및 현미경 분석의 장점은 셀 clumping이 17 &#39;가능한하지만 비 culturable&#39;상태가 감지됩니다를 입력 세포내 세균 및 그 집결 수 있습니다. 박테리아 침공의 숙주 세포 프로세스의 역할을 검토. 많은 연구와 같은 굴지의 다시 정리하기 방해 cytochalasin D, 같은 숙주 세포 기능의 억제제를 고용했습니다. 이러한 연구는 항체를 포함 수있는 대상 셀 표면의 수용체와 특정 유전자 18 siRNA의 최저. 그것은 이러한 치료는 교양 세포의 생존이나 첨부 파일을 영향을 미치거나 세균에 대한 독성 영향을 미칠하지 않도록 극히 중요합니다. 미래 방향 : 이 분석은 일반적으로 멀티 웰 세포 배양 접시에서 수행됩니다 ontent &quot;&gt; 때문에, 그것은 잠재적인 세포 기능 억제제의 라이브러리 심사, 안티 - infectives 또는 포함 수도 높은 처리량 심사 작업에 그것을 적응 이론적으로 가능합니다 세포내 박테리아를 대상으로 설계 항생제. 또는, 그러한 접근은 접착, 침공이나 세포 생존에 관련된 유전자를 확인하기 위해 돌연변이 라이브러리를 화면으로 사용할 수 있습니다. 어떤 경우에는 그것이 모델 시스템의 전단 세력 (흐름을) 포함하는 것이 바람직하다 수 있습니다 예를 들어 내피를 모델링 할 때, 좀 더 자세히 생체내 환경에서을 모방합니다. 플로우 셀 및 microfluidic 세포 배양 시스템의 설계 및 제조의 현재 발전 전단 세력을 통합 호스트 병원체 모델에서 gentamicin 보호 분석을 고용 가능성을 제공합니다. 요약 여기에서 설명하는 프로토콜은 몇 년 동안 사용하는 유사한 접근 방식을 기반으로합니다. 그것은 널리 교양 세포와 세균 종의 다양한 종류에 적용됩니다 신속하고 비교적 적은 비용으로 대용량의 데이터를 생성할 수 있습니다.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>31885-023</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Brain heart infusion</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BioChemika</td>
<td>53286</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Foetal bovine serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>10091-148</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HUVECs</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>CC-2519</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Endothelial basal medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>CC-3121</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bovine brain extract (including heparin)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>CC-4092</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Human endothelial growth factor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>CC-4017C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hydrocortisone</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>CC-4035C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GA-1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>CC-4092C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gentamicin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15710</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lysostaphin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>AMBI</td>
<td>LSPN-50</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Thermanox coverslips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Fisher</td>
<td>TKT-210-330P</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T8787</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cytopath</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>TCS Biosciences</td>
<td>HC8595</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Crystal violet</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C3886</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin-EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T4049</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T75 flasks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Fisher</td>
<td>430641</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cytochalasin D</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C2618</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Methyl-B-cyclodextrin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>332615</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

invasion of human cells by a bacterial pathogen

여기서 우리는 세균 병원체 포도상 구균에 의해 인간 내피 세포의 침공을 연구하는 방법을 설명합니다. 일반적인 프로토콜은 거의 모든 culturable 세균에 의해 세포 침략의 연구에 적용할 수 있습니다. 같은 굴지의 다시 정리하기 또는 caveolae의 역할과 같은 침략의 특정 측면을 연구 할 수있는에있는 단계는, 강조 표시됩니다. 호스트 세포 flasks 재배하고 때 사용할 준비가 Thermanox의 coverslips를 포함 24 자 접시에 씨앗을 품고 있습니다. coverslips을 사용하면 우물에서 세포의 후속 제거 우물 (S. 구균은 첨부하는 것입니다)의 측면에 예금 혈청 단백질로부터 간섭을 줄일 수 있습니다. 박테리아가 필요한 밀도로 성장하고 분비 단백질 (예 : 독소) 제거 씻어 수 있습니다. 내피 세포의 합류 레이어 Coverslips은 세균의 추가되기 전에 새로운 문화 매체를 포함하는 새로운 24 잘 접시로 전송됩니다. 박테리아와 세포가 다음 37 5% CO 2 시간의 필요한 양을 함께 incubated 아르 ° C. S. 들어 구균이 일반적으로 15-90분 사이입니다. Thermanox의 coverslips는 각 우물에서 제거하고 무소속의 박테리아를 제거하는 PBS에서 수영 - 세탁 있습니다. 총 관련된 박테리아 (자기편과 internalized)을 계량하는 경우, coverslips 그 다음 PBS에서 X - 100 0.5 % 튼이 포함된 새로운 우물에 배치됩니다. 젠틀 pipetting는 세포 용해를 완료하고 세균을 한천 배지에 희석 직렬 및 도금에 의해 열거됩니다 리드. 세포를 침공이 박테리아의 수가이 필요한 경우, coverslips는 모든 외부 박테리아를 죽일거야 gentamicin과 부화로 보충 500 μl 조직 문화 매체를 포함하는 우물 1 H 지속에 추가됩니다. Coverslips가 다음 씻어 수 세포가 lysed하고 위에 설명된대로 박테리아 한천에 도금하여 열거. 실험 직접 시각화를 필요로 할 경우, coverslips은 고정과 스테인드, 빛 형광 또는 공촛점 현미경 또는 전자 현미경에 대비하실 수 있습니다.

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Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

에 초점을 세균성 병원체에 의해 호스트 세포의 침략의 연구를위한 일반적인 프로토콜<em&gt; 포도상 구균</em&gt; 인간 내피 세포.

세균성 병원체에 의해 인간의 세포의 침략

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

34.5K 조회수.  University of Bath. 에 초점을 세균성 병원체에 의해 호스트 세포의 침략의 연구를위한 일반적인 프로토콜 포도상 구균 인간 내피 세포.

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Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed to them and occasionally to pathogens. The gut-associated lymphoid tissue (GALT) play a key role for induction of the mucosal immune response to these microbes1, 2. To initiate the mucosal immune response, the mucosal antigens must be transported from the gut lumen across the epithelial barrier into organized lymphoid follicles such as Peyer's patches. This antigen transcytosis is mediated by specialized epithelial M cells3, 4. M cells are atypical epithelial cells that actively phagocytose macromolecules and microbes. Unlike dendritic cells (DCs) and macrophages, which target antigens to lysosomes for degradation, M cells mainly transcytose the internalized antigens. This vigorous macromolecular transcytosis through M cells delivers antigen to the underlying organized lymphoid follicles and is believed to be essential for initiating antigen-specific mucosal immune responses. However, the molecular mechanisms promoting this antigen uptake by M cells are largely unknown. We have previously reported that glycoprotein 2 (Gp2), specifically expressed on the apical plasma membrane of M cells among enterocytes, serves as a transcytotic receptor for a subset of commensal and pathogenic enterobacteria, including Escherichia coli and Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), by recognizing FimH, a component of type I pili on the bacterial outer membrane 5. Here, we present a method for the application of a mouse Peyer's patch intestinal loop assay to evaluate bacterial uptake by M cells. This method is an improved version of the mouse intestinal loop assay previously described 6, 7. The improved points are as follows: 1. Isoflurane was used as an anesthetic agent. 2. Approximately 1 cm ligated intestinal loop including Peyer's patch was set up. 3. Bacteria taken up by M cells were fluorescently labeled by fluorescence labeling reagent or by overexpressing fluorescent protein such as green fluorescent protein (GFP). 4. M cells in the follicle-associated epithelium covering Peyer's patch were detected by whole-mount immunostainig with anti Gp2 antibody. 5. Fluorescent bacterial transcytosis by M cells were observed by confocal microscopic analysis. The mouse Peyer's patch intestinal loop assay could supply the answer what kind of commensal or pathogenic bacteria transcytosed by M cells, and may lead us to understand the molecular mechanism of how to stimulate mucosal immune system through M cells.

Application of a Mouse Ligated Peyer&amp;#8217;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

M cells in a specialized follicle-associated epithelium covering Peyer&#x2019;s patches play an important role for the mucosal immunosurveillance in gut-associated lymphoid tissue. Here we described the evaluation method for bacterial transcytosis by M cells in vivo. This method provides a method to understand M-cell function in the immune system.

마우스의 응용은 M 세포에 의해 박테리아 이해를 평가하는 Peyer의 패치 장 루프 분석 출혈도 잡았

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

연구

면역학 및 감염병학

One-day Workflow Scheme for Bacterial Pathogen Detection and Antimicrobial Resistance Testing from Blood Cultures

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. Therefore, rapid administration of adequate antibiotic therapy is of foremost importance in the treatment of bloodstream infections. The critical element in this process is timing, heavily dependent on the results of bacterial identification and antibiotic susceptibility testing. Both of these parameters are routinely obtained by culture-based testing, which is time-consuming and takes on average 24-48 hours2, 4. The aim of the study was to develop DNA-based assays for rapid identification of bloodstream infections, as well as rapid antimicrobial susceptibility testing. The first assay is a eubacterial 16S rDNA-based real-time PCR assay complemented with species- or genus-specific probes5. Using these probes, Gram-negative bacteria including Pseudomonas spp., Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli as well as Gram-positive bacteria including Staphylococcus spp., Staphylococcus aureus, Enterococcus spp., Streptococcus spp., and Streptococcus pneumoniae could be distinguished. Using this multiprobe assay, a first identification of the causative micro-organism was given after 2 h.
Secondly, we developed a semi-molecular assay for antibiotic susceptibility testing of S. aureus, Enterococcus spp. and (facultative) aerobe Gram-negative rods6. This assay was based on a study in which PCR was used to measure the growth of bacteria7. Bacteria harvested directly from blood cultures are incubated for 6 h with a selection of antibiotics, and following a Sybr Green-based real-time PCR assay determines inhibition of growth. The combination of these two methods could direct the choice of a suitable antibiotic therapy on the same day (Figure 1). In conclusion, molecular analysis of both identification and antibiotic susceptibility offers a faster alternative for pathogen detection and could improve the diagnosis of bloodstream infections.

The design of a straightforward one-day workflow scheme for bacterial pathogen diagnostics enables the rapid recognition of bloodstream infections. The inclusion of eight clinically relevant bacterial targets and their antibiotic resistance profiles offers the clinician an initial insight on the same day, which can lead to more adequate therapy.

혈액 배양에서 세균 병원체 탐지 및 항균 저항 테스트를위한 하루 워크플로 계획

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. ...

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

The interactions of bacterial pathogens with host cells have been investigated extensively using in vitro cell culture methods. However as such cell culture assays are performed under aerobic conditions, these in vitro models may not accurately represent the in vivo environment in which the host-pathogen interactions take place. We have developed an in vitro model of infection that permits the coculture of bacteria and host cells under different medium and gas conditions. The Vertical Diffusion Chamber (VDC) model mimics the conditions in the human intestine where bacteria will be under conditions of very low oxygen whilst tissue will be supplied with oxygen from the blood stream. Placing polarized intestinal epithelial cell (IEC) monolayers grown in Snapwell inserts into a VDC creates separate apical and basolateral compartments. The basolateral compartment is filled with cell culture medium, sealed and perfused with oxygen whilst the apical compartment is filled with broth, kept open and incubated under microaerobic conditions. Both Caco-2 and T84 IECs can be maintained in the VDC under these conditions without any apparent detrimental effects on cell survival or monolayer integrity. Coculturing experiments performed with different C. jejuni wild-type strains and different IEC lines in the VDC model with microaerobic conditions in the apical compartment reproducibly result in an increase in the number of interacting (almost 10-fold) and intracellular (almost 100-fold) bacteria compared to aerobic culture conditions1. The environment created in the VDC model more closely mimics the environment encountered by C. jejuni in the human intestine and highlights the importance of performing in vitro infection assays under conditions that more closely mimic the in vivo reality. We propose that use of the VDC model will allow new interpretations of the interactions between bacterial pathogens and host cells.

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

Performing cell culture assays for investigating bacterial adhesion and invasion under aerobic conditions is usually unrepresentative of the in vivo environment. A Vertical Diffusion Chamber model allows study of interactions of the human pathogen Campylobacter jejuni with intestinal epithelial cells under more in vivo-like conditions, resulting in enhanced bacterial invasion.

장 상피 세포의 장내 세균의 침입<em&gt; 체외</em&gt; 크게 수직 확산 챔버 모델을 사용하여 향상

The interactions of bacterial pathogens with host cells have been investigated extensively using in vitro cell culture methods. However as such cell ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Bacterial intracellular pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling cascades due to their capacity to exquisitely manipulate and subvert cell functions which are required for the infection of host target tissues. Among these bacterial pathogens, Listeria monocytogenes is a Gram positive microorganism that has been used as a paradigm for intracellular parasitism in the characterization of cellular immune responses, and which has played instrumental roles in the discovery of molecular pathways controlling cytoskeletal and membrane trafficking dynamics. In this article, we describe a robust microscopical assay for the detection of late cellular infection stages of L. monocytogenes based on the fluorescent labeling of InlC, a secreted bacterial protein which accumulates in the cytoplasm of infected cells; this assay can be coupled to automated high-throughput small interfering RNA screens in order to characterize cellular signaling pathways involved in the up- or down-regulation of infection.

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram positive bacterial pathogen frequently used as a major model for the study of intracellular parasitism. Imaging late L. monocytogenes infection stages within the context of small-interfering RNA screens allows for the global study of cellular pathways required for bacterial infection of target host cells.

세균성 병원체에 의해 세포 감염을 조사하기 위해 InlC 분비 이미징<em&gt; 리스테리아</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression of a fluorescent reporter. Here, we highlight an alternative usage of this instrument, for sorting worms according to their degree of colonization by a GFP-expressing pathogen. This new usage allowed us to address the relationship between colonization of the worm intestine and induction of immune responses. While C. elegans immune responses to different pathogens have been documented, it is still unknown what initiates them. The two main possibilities (which are not mutually exclusive) are recognition of pathogen-associated molecular patterns, and detection of damage caused by infection. To differentiate between the two possibilities, exposure to the pathogen must be dissociated from the damage it causes. The wormsorter enabled separation of worms that were extensively-colonized by the Gram-negative pathogen Pseudomonas aeruginosa, with the damage likely caused by pathogen load, from worms that were similarly exposed, but not, or marginally, colonized. These distinct populations were used to assess the relationship between pathogen load and the induction of transcriptional immune responses. The results suggest that the two are dissociated, supporting the possibility of pathogen recognition.

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

The wormsorter facilitates genetic screens in Caenorhabditis elegans by sorting worms according to expression of fluorescent reporters. Here, we describe a new usage:&#160;sorting according to colonization by a GFP-expressing pathogen, and we employ it to examine the poorly understood role of pathogen recognition in initiating immune responses.

의 자동 분리<em&gt; C. 엘레</em&gt; 가변 세균성 병원체에 의해 식민지

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the protocols described here use freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or plasmacytoid dendritic cells (pDCs) to sense infections in either T cell line (MT4) or heterologous primary CD4+ T cells. In order to ensure proper sensing, it is essential that PBMC are isolated immediately after blood collection and that optimal percentage of infected T cells are used. Furthermore, multi-parametric flow cytometric staining can be used to confirm that PBMC samples contain the different cell lineages at physiological ratios. A number of controls can also be included to evaluate viability and functionality of pDCs. These include, the presence of specific surface markers, assessing cellular responses to known agonist of Toll-Like Receptors (TLR) pathways, and confirming a lack of spontaneous type-I interferon (IFN) production. In this system, freshly isolated PBMCs or pDCs are co-cultured with HIV-1 infected cells in 96 well plates for 18-22 hr. Supernatants from these co-cultures are then used to determine the levels of bioactive type-I IFNs by monitoring the activation of the ISGF3 pathway in HEK-Blue IFN-&#945;/&#946; cells. Prior and during co-culture conditions, target cells can be subjected to flow cytometric analysis to determine a number of parameters, including the percentage of infected cells, levels of specific surface markers, and differential killing of infected cells. Although, these protocols were initially developed to follow type-I IFN production, they could potentially be used to study other imuno-modulatory molecules released from pDCs and to gain further insight into the molecular mechanisms governing HIV-1 innate sensing.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Unlike cell-free HIV-1 particles, infected CD4+ T cells are effectively sensed by plasmacytoid dendritic cells (pDCs). This manuscript describes a method where peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or isolated pDCs are co-cultured with HIV-1 infected T cells to evaluate innate sensing by pDCs as assessed by release of type-I IFN.

HIV-1 감염 CD4의 타고난 감지 평가<sup&gt; +</sup&gt;를 사용하여 형질 수지상 세포에 의한 T 세포<em&gt; 예 생체 내</em&gt; 공동 문화 시스템.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised patients, the elderly, and pregnant women. The most common manifestations of listeriosis in humans include meningitis, encephalitis, and fetal abortion. A significant but much less documented sequelae of invasive L. monocytogenes infection involves the heart. The death rate from cardiac illness can be up to 35% despite treatment, however very little is known regarding L. monocytogenes colonization of cardiac tissue and its resultant pathologies. In addition, it has recently become apparent that subpopulations of L. monocytogenes have an enhanced capacity to invade and grow within cardiac tissue. This protocol describes in detail in vitro and in vivo methods that can be used for assessing cardiotropism of L. monocytogenes isolates. Methods are presented for the infection of H9c2 rat cardiac myoblasts in tissue culture as well as for the determination of bacterial colonization of the hearts of infected mice. These methods are useful not only for identifying strains with the potential to colonize cardiac tissue in infected animals, but may also facilitate the identification of bacterial gene products that serve to enhance cardiac cell invasion and/or drive changes in heart pathology. These methods also provide for the direct comparison of cardiotropism between multiple L. monocytogenes strains.

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes causes fetal infections in pregnant women and meningitis in susceptible populations. Subpopulations of bacteria can colonize cardiac tissue, causing myocarditis in patients and laboratory animals. Here we present a protocol that describes how to assess L. monocytogenes cardiac cell invasion in vitro and cardiac colonization in infected animals.

리스테리아 단세포 유전자를 사용하여 감염된 마우스에 있는 문화와 심혼 식민지에 있는 심장 세포의 세균성 침략 평가

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

세대와의 멀티 표현형 높은 콘텐츠 상영<em&gt; Coxiella burnetii의</em&gt; 트랜스포존 돌연변이

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria have evolved different strategies to manipulate their host metabolism for their own benefit. This bacterial manipulation is often coupled with severe symptom development or the death of the affected plants. Determining the specific bacterial molecules responsible for the host manipulation has become an important field in microbiological research. After the identification of these bacterial molecules, called &#34;effectors,&#34; it is important to elucidate their function. A straightforward approach to determine the function of an effector is to identify its proteinaceous binding partner in its natural host via a yeast two-hybrid (Y2H) screen. Normally the host harbors numerous potential binding partners that cannot be predicted sufficiently by any in silico algorithm. It is thus the best choice to perform a screen with the hypothetical effector against a whole library of expressed host proteins. It is especially challenging if the causative agent is uncultivable like phytoplasma. This protocol provides step-by-step instructions for DNA purification from a phytoplasma-infected woody host plant, the amplification of the potential effector, and the subsequent identification of the plant&#39;s molecular interaction partner with a Y2H screen. Even though Y2H screens are commonly used, there is a trend to outsource this technique to biotech companies that offer the Y2H service at a cost. This protocol provides instructions on how to perform a Y2H in any decently equipped molecular biology laboratory using standard lab techniques.

Bacterial effector proteins are important for establishing successful infections. This protocol describes the experimental identification of proteinaceous binding partners of a bacterial effector protein in its natural plant host. Identifying these effector interactions via yeast two-hybrid screens has become an important tool in unravelling molecular pathogenicity strategies.

효모 두 하이브리드 화면을 사용하여 비 경작 식물 병원체로부터 세균 이펙터의 기능을 해결했습니다

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' pathogens (Listeria monocytogenes, Shigella flexneri, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensis, and Rickettsia spp.) gain access to the infected cell cytosol by physically and enzymatically degrading the primary vacuolar membrane. Once in the cytosol, these pathogens both proliferate as well as generate sufficient mechanical forces to penetrate the plasma membrane of the host cell in order to infect new cells. Here, we show how this terminal step of the cellular infection cycle of L. monocytogenes (Lm) can be quantified by both colony-forming unit assays and flow cytometry and give examples of how both pathogen- and host-encoded factors impact this process. We also show a close correspondence of Lm infection dynamics of cultured cells infected in vitro and those of hepatic cells derived from mice infected in vivo. These function-based assays are relatively simple and can be readily scaled up for discovery-based high-throughput screens for modulators of eukaryotic cell function.

We describe both in vitro and in vivo infection assays that can be used to analyze the activities of host-encoding factors.