이 작품은 독일 연구 재단 (DFG) SCHU-2681 / 1-1 (CS) 및 KFO 146 (MF)에 의해 지원 된 국방 보조금 PC의 DOD 부서 040,972 (MO)와 국립 보건 연구소는 RO1 CA108835은 부여 , RO1 Ai44129 (JPS)

HLA-A2-IG 기반 KaAPC의 1 세대 <ol><li> 멸균 붕산 버퍼를 준비합니다. 물에 붕산의 0.1 M 솔루션을 확인하고 7.0으로 pH를 조정합니다. 무균 필터 (0.22 μm의) 버퍼와 4 ° C에서 보관. </li><li> 멸균 비드 세척 버퍼를 준비합니다. 마그네슘과 칼슘없이 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)를 사용합니다. 3 % 최종 농도에 대한 인간 AB 혈청을 추가합니다. 2 mM의 최종 농도에 대한 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)를 추가합니다. 0.01 % 최종 농도에 아 지드 화 나트륨 (NaN의 3)를 추가합니다. 무균 필터 (0.22 μm의) 버퍼와 4 ° C에서 보관. </li><li> 멸균에 재고 에폭시 구슬 (약 100 × 10 6 구슬)의 250 μl를 전송, 최고 유리 병을 조입니다. </li><li> 붕산 버퍼의 250 μl를 추가합니다. </li><li> 자석에 유리 병을 넣어 구슬이 2 분 동안 부착 할 수; 흡인은 버퍼 자석에서 유리 병을 제거합니다. </li><li> 1 ㎖의 붕산 버퍼로 한번 구슬을 씻으십시오. </li><li> 0.018 μg의 550 μL로 재현 탁 비즈/ ㎖ HLA-A2-IG 및 3.64 μg / ml의 항 - 인간 CD95 단클론 항체 (클론 CH11) 부드럽게 흔들어 섞는다. (자세한 내용은 설명 절을 참조하십시오.) </li><li> 24 시간 동안 4 ° C에서, 말을 통해 회 전자 끝에 유리 병을 품어. </li><li> 2 분 동안 300 XG에 구슬을 스핀 다운. </li><li> 2 분 동안 자석에 유리 병을 놓고 &quot;KaAPC 로딩 솔루션을&quot;대기음; 자석에서 유리 병을 제거 비드 세척 버퍼의 1 mL를 넣고 흔들어 조심스럽게 재현 탁. </li><li> 단계를 반복 1.10 배. </li><li> 1 ml의 비드 세척 버퍼에서 24 시간 동안 4 ° C에서 회 전자에 유리 병을 품어. 이 시점에서, 결합 부위의 모든 잔여 단백질 비드 세척 버퍼에 포함 인간 AB 혈청에 의해 차단 될 것이다. </li><li> 2 분 동안 300 XG에 구슬을 스핀 다운. </li><li> 장소 유리는 2 분, 흡인 비드 세척 버퍼위한 자석에 유리 병; 자석에서 유리 병을 제거하고 PBS 1 ㎖의 솔루션을 교체합니다. </li></ol> 2 품질 관리, 펩타이드로드, W애싱, 저장 및 KaAPC의 안정성 <ol><li> FACS 튜브에 1.5 × 10 5 KaAPC를 전송하고 FACS 버퍼를 씻어 1 ㎖로 씻는다. </li><li> 버퍼 및 검출 및 항 - 마우스 IgM 항체 FITC (클론 R6-60.2의 1 μL (HLA-A2-IG의 Fc 부분의 검출) 항 - 마우스의 IgG1 PE의 1 μl를 추가 워시 100 ㎕의 FACS에서 재현 탁 비즈 항 사람 CD95 단클론 항체). </li><li> 버퍼 및 유동 세포 계측법에 의해 염색을 읽을 씻어 250 ㎕의 FACS 1 FACS 버퍼를 씻어 ml의 재현 탁 씻어, 4 ° C에서 15 분 동안 품어. </li></ol><img alt="그림 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51859/51859fig1highres.jpg" width="500" /> 프로토콜 섹션에서 언급 한 바와 같이 만든 KaAPC 배치의 그림 1 QC 얼룩은. 염색은 안티 - 인간 CD95 반면, 2 HLA-A2-IG는 안티 - 마우스의 IgG1 PE 단클론 항체를 사용하여 검출 된 프로토콜 절에 설명 된대로 수행 하였다 (안티는 Fas)는 (자체 프로토콜을 참조 항 - 마우스 IgM 항체-FITC 항체로 검출되었다ction의 2.2) (파란 선). 채워진 검은 색 그래프는 각각 항 - 마우스-IgG1의 PE 단클론 항체 또는 항 - 마우스 IgM 항체 FITC 항체로 염색 빈 구슬을 나타냅니다. 오른쪽 상단 모서리에있는 숫자는 평균 형광 강도 (MFI)를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51859/51859fig1highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <ol start="4"><li> 새로운 멸균 유리 병에 펩타이드로드 전송 20 × 10 6 KaAPC를 들어, 2 분 동안 자석에 배치, 5㎍을 펩타이드와 500 ㎕의 신선한 PBS로 흡인 PBS 및 재현 탁 비즈 (명심 만 HLA-A2 제한 펩타이드는 것 이량에 바인딩!). </li><li> 스토어는 HLA-A2-IG 이량 체 상에 충분한 펩타이드 로딩을​​ 할 수 있도록 최소한 3 일 동안 사용할 때까지 4 ° C에서 KaAPC로드. </li><li> 사용하기 직전에, 1.14에 표시된대로 KaAPC로드 펩타이드를 씻어; 이 단계에서 적어도 6 배를 반복합니다. 참고 :이 무료 펩타이드 t이 있는지 확인하는 중요한 단계이다O 위양성 죽이는 결과를 피하기 위해 완전히 제거; 잔류 자유 펩티드 항원 특이적인 T 세포 배양 9에서 아폽토시스를 유도하는 것으로 나타났다. 가용성 펩타이드의 효과를 배제하기 위해,로드 펩타이드의 상층 액을 제어 샘플을 실행하고 KaAPC을 (3.8 참조) 세척 하였다. </li><li> 혈구를 사용하여 구슬을 세어 펩타이드 농도의 날짜, 이름과 레이블을 붙입니다. 참고 :로드 KaAPC 적어도 한 달 동안 4 ° C에서 작동 남아있다. 일개월 후, 동일한 펩타이드와 재로드는 KaAPC는 일년까지 활용 될 수 있습니다. </li></ol> 3 KaAPC 체외 죽이는 분석 <ol><li> 공동 문화 매체를 준비합니다. 3 % 기증자자가 플라즈마 (실험실 6 제) 3 % ​​T 세포 성장 인자 보충 완료 RPMI 매체를 준비합니다. 기증자자가 혈장을 사용할 수없는 경우, 열 불 활성화 된 인간 AB 혈청을 사용합니다. </li><li> AnnexinV 바인딩 버퍼 준비를 준비합니다. 8.12 g 염화나트륨 (NaCl) 및 0.12 g의 석회질을 녹여990 ML의 DDH 2에 윰 클로라이드 (염화칼슘) 10 ㎖의 1M HEPES 버퍼를 O.Add. </li><li> 인간 항원 특이적인 T 세포를 생성한다. (자세한 프로토콜의 인공 항원 제시 세포 (AAPC)를 이용 이전 게시 7 참조). 그 펩타이드 특이 사량 염색에 의해 결정 적어도&gt; 75 % 있는지 확인하십시오. </li><li> 가습 인큐베이터에서 48 시간 동안 KaAPC 1 비율로 37 ℃에서 각 샘플에 대해 2 × 105 항원 특이적인 T 세포 / 웰 (96 웰 둥근 바닥 플레이트의) 하나의 공동 - 배양액 200 μL의 부화 C, 5 % CO 2. </li><li> 수확 샘플 및 FACS 튜브로 전송; , 1 ㎖의 AnnexinV 결합 버퍼로 씻어 5 분 동안 300 XG에 스핀 다운, AnnexinV 결합 완충액 100 ㎕에 뜨는에 resuspend 폐기 </li><li> 1 μL AnnexinV FITC와 실온에서 10 ~ 15 분 동안 5 μL 7-AAD와 얼룩 샘플, 1 ml의 AnnexinV 결합 버퍼로 씻어; 5 분 동안 300 XG에 스핀 다운 뜨는 폐기250 ㎕의 AnnexinV 바인딩 버퍼의 개발에 resuspend </li><li> 흐름에 즉시 샘플을 사이토 읽어보십시오. </li><li> KaAPC에 의해 항원 특이적인 살해를 결정하기 위해 다음과 같은 샘플을 준비 : T 세포 만; + T 세포 용해 안티 CD95; T 세포는 KaAPC 언로드 +; + T 세포에 비 - 동족 펩티드 KaAPC로드; T 세포 + 동족 펩티드 KaAPC로드; 동족 펩티드의 T 세포 상등액 + KaAPC를 적재했다. </li></ol><img alt="그림이" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51859/51859fig2highres.jpg" width="500" /> ., CMVpp65 특정 T 세포 (~ 80 %)와 1 비율 수확 이후 AnnexinV 염색 : 그림 2 KaAPC 죽이는 분석 펩타이드는 1에서 48 시간 동안 배양 KaAPC 또는 제어 구슬 (HLA-A2-IG는 구슬) 하였다로드 및 요오드화 프로피 듐 (PI)는. 유동 세포 계측법 (참조 프로토콜 섹션 3.3-3.7)에 의해 &quot;동족&quot;세포 사멸을 결정이어야합니다 &quot;비 동족&quot;CMVpp65와 함께로드 구슬을 의미합니다마트-1 펩티드로드 광고. 숫자는 각 플롯의 왼쪽 사분면 가능한 T 세포의 비율을 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51859/51859fig2highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <ol start="9"><li> , 십자형 실험을 수행하는 두 개의 다른 특이성의 항원 특이적인 T 세포를 생성한다. </li><li> 또한 이종의 T 세포 집단에서 T 세포의 항원 특이적인 제거의 동시 분석 KaAPC의 항원 특이 플리 능력을 평가한다. (자세한 프로토콜의 쉬츠 외를 참조하십시오. 10). </li></ol>

<ol>
	<li>Bizzaro, N., Tozzoli, R., Shoenfeld, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+we+at+a+stage+to+predict+autoimmune+rheumatic+diseases.">Are we at a stage to predict autoimmune rheumatic diseases.</a> Arthritis and rheumatism. 56 (6), 1736-1744 (2007).</li><li>Sch&#252;tz, C., Oelke, M., Schneck, J. P., Mackensen, A., Killer Fleck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=artificial+antigen-presenting+cells:+the+synthetic+embodiment+of+a+&#8220;guided+missile.">artificial antigen-presenting cells: the synthetic embodiment of a &#8220;guided missile.</a> Immunotherapy. 2 (4), 539-550 (2010).</li><li>Hoves, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+but+not+immature+Fas+ligand+(CD95L)-transduced+human+monocyte-derived+dendritic+cells+are+protected+from+Fas-mediated+apoptosis+and+can+be+used+as+killer+APC.">Mature but not immature Fas ligand (CD95L)-transduced human monocyte-derived dendritic cells are protected from Fas-mediated apoptosis and can be used as killer APC.</a> Journal of immunology (Baltimore, Md.: 1950). 170 (11), 5406-5413 (2003).</li><li>Hoves, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elimination+of+activated+but+not+resting+primary+human+CD4++and+CD8++T+cells+by+Fas+ligand+(FasL/CD95L)-expressing+Killer-dendritic+cells.">Elimination of activated but not resting primary human CD4+ and CD8+ T cells by Fas ligand (FasL/CD95L)-expressing Killer-dendritic cells.</a> Immunobiology. 208 (5), 463-475 (2004).</li><li>Sch&#252;tz, C., Hoves, S., Halbritter, D., Zhang, H. -. G., Mountz, J. D., Fleck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alloantigen+specific+deletion+of+primary+human+T+cells+by+Fas+ligand+(CD95L)-transduced+monocyte-derived+killer-dendritic+cells.">Alloantigen specific deletion of primary human T cells by Fas ligand (CD95L)-transduced monocyte-derived killer-dendritic cells.</a> Immunology. 133 (1), 115-122 (2011).</li><li>Oelke, M., Maus, M. V., Didiano, D., June, C. H., Mackensen, A., Schneck, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+induction+and+expansion+of+antigen-specific+cytotoxic+T+cells+by+HLA-Ig-coated+artificial+antigen-presenting+cells.">Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells.</a> Nature. 9 (5), 619-624 (2003).</li><li>Chiu, Y. -. L., Schneck, J. P., Oelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HLA-Ig+based+artificial+antigen+presenting+cells+for+efficient+ex+vivo+expansion+of+human+CTL.">HLA-Ig based artificial antigen presenting cells for efficient ex vivo expansion of human CTL.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (50), (2011).</li><li>Sch&#252;tz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killer+artificial+antigen-presenting+cells:+a+novel+strategy+to+delete+specific+T+cells.">Killer artificial antigen-presenting cells: a novel strategy to delete specific T cells.</a> Blood. 111 (7), 3546-3552 (2008).</li><li>Snow, A. L., Pandiyan, P., Zheng, L., Krummey, S. M., Lenardo, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+power+and+the+promise+of+restimulation-induced+cell+death+in+human+immune+diseases.">The power and the promise of restimulation-induced cell death in human immune diseases.</a> Immunological reviews. 236 (1), 68-82 (2010).</li><li>Sch&#252;tz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+flow+cytometric+assay+for+the+simultaneous+analysis+of+antigen-specific+elimination+of+T+cells+in+heterogeneous+T+cell+populations.">A new flow cytometric assay for the simultaneous analysis of antigen-specific elimination of T cells in heterogeneous T cell populations.</a> Journal of immunological. 344 (2), 98-108 (2009).</li><li>Shen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=artificial+antigen-presenting+cells+deplete+alloantigen-specific+T+cells+in+a+murine+model+of+alloskin+transplantation.">artificial antigen-presenting cells deplete alloantigen-specific T cells in a murine model of alloskin transplantation.</a> Immunology letters. 138 (2), 144-155 (2011).</li><li>Perica, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+artificial+antigen+presenting+Cells+for+T+cell+immunotherapy.">Nanoscale artificial antigen presenting Cells for T cell immunotherapy.</a> Nanomedicine nanotechnology, biology, and medicine. 10 (1), 119-129 (2013).</li><li>Sunshine, J. C., Perica, K., Schneck, J. P., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+shape+dependence+of+CD8++T+cell+activation+by+artificial+antigen+presenting+cells.">Particle shape dependence of CD8+ T cell activation by artificial antigen presenting cells.</a> Biomaterials. 35 (1), 269-277 (2013).</li></ol>

CS와 MF는 공개 아무것도 없어. NexImmune와 존스 홉킨스 대학, 박사 부부 사이의 라이선스 계약에 따라. Schneck 및 Oelke는이 문서에서 설명 AAPC 제품의 판매에 대학에서받은 로열티 주에받을 수 있습니다. 또한 대학의 정책에 따라 특정 제한 사항이 적용됩니다 NexImmune 주식을 소유. 박사 Schneck 회사 &quot;의 이사회 및 과학 자문위원회의 일원이다.이 배열의 조항은이자 정책의 충돌에 따라 존스 홉킨스 대학에 의해 관리되고있다.

프로토콜에서 가장 중요한 단계는 신호 1 (펩타이드 MHC)와 신호 2 (안티는 Fas 항체)의 적절한 비율을 보장하는 것입니다. 우리는 신호 1 및 2에 대한 완벽한 비율을 정의하는 데 집중 적정 실험을 수행 한; 인한 HLA-A2 IG 이합체 또는 안티는 Fas 항체 농도 차이에 최소한의 변형 KaAPC의 기능을 방해 할 수있는 것이 분명하게되었다. 따라서, 두 신호의 농도는 항상 확인해야합니다 두 단백질의 품질은 자주가 상용 소스에서 주문 된 경우에도 테스트해야합니다. 다른 검출법은 다른 농도이 있으므로 또한, 농도는 항상 동일한 분석에 의해 결정되어야한다. HLA-A2-IG의 기능은 불완전한 폴딩 및 / 또는 비효율적 인 펩타이드 로딩에 손상 될 수 있습니다. 또한 다이머 분자는 단백질의 기능적 활성에 영향을 미칠 수있는 다른 각도에 모을 수있다. 따라서 ACTU이량 체의 알 금액이 다를 수 있습니다 기능 및 특정 KaAPC의 생성에 필요한. 또한, 우리는 KaAPC에 신호 방지는 Fas 항체를 유도하는 죽음에 대한 이상적인 범위는 매우 엄격한 것으로 나타났습니다. 우리의 손의 양에서 큰 3.64 ㎍ / ㎖의 아래 금액은 복용량에 따라 감소 살인 활동 결과 동안 ML의 Fas 긍정적 인 T 세포의 비 특정 살인으로 이어질 / 3.64 μg. 이러한 조건이 아주 꽉 보이지만, 이러한 세부 사항에주의는 기능과 특정 KaAPC이 발생 할 수 있습니다. 현재 KaAPC 표현형은 순진하거나 휴식 항원 특이 T 세포를 대상으로 활성화 된 항원 특이 T 세포, 초기 실험의 고갈에 대한 기능이지만이 인구와 Fas 발현을 감소 항원 특이적인 면역 세포 사멸의 유의 한 유도를 입증하지 않습니다. 따라서, 하나 만들어 놓을 수 있도록 T 세포 휴식의 FA에 상향 조절을 유도 KaAPC에 동시 자극 신호를 가산 상상할 수도KaAPC의 대상으로. 이 가능하지만 세 가지 신호를주의 깊게 기능 KaAPC 표현형을 보장하기 위해 적정해야합니다. 생체 적합성 또는 생분해 성 매트릭스에 비드 플랫폼을 조정하면 생체 적용에 KaAPC을 향상시킬 것입니다. 최근 쉔 등은. KaAPC가 -TRP2 11 B 안티는 Fas (복제 Jo2) 및 안티 그의 / H2-K에 결합 5 μm의 라텍스 구슬을 이용하여 생체 사용의 성공을보고했다. 우리는 인공 항원 제시 세포 (AAPC)의 일반적인 개념이 성공적으로 나노 크기의 입자 (12)에 크기 μm의에서 전송 될 수 있으며, 해당 기능이 입자 형상 (13)에 의해 영향을 받는다는 보여줄 수 있었다. 따라서, 크기 및 / 또는 미래 KaAPC의 모양을 변화시켜 하나의 장기 특정자가 면역 질환의 성공적인 치료를위한 열쇠가 될 수있는 생체 내 기능과 생체 분포에 영향을 미칠 수있을 디자인입니다. <p c아가씨 = &quot;jove_content은&quot;&gt; KaAPC 기증자 조건 및 전처리 독립적이며, 시간과 비용 효율적인 접근 방식 &quot;기성품&quot;사용하기 쉬운으로 셀 기반의 고갈 전략의 주요 단점을 극복. KaAPC은 자기 또는 주변 분비 살인 신호의 목표와 CTL의 세포 용해 이펙터 기능에 민감하지 않습니다. KaAPC는 관련 질환 항원의 확인을 요구하고 특정 HLA 유형에 의존 할 것이다. 제 1 형 당뇨병에 대한 현재 수많은 적합한 HLA-A2 제한 항원 반면, 이식편 대 숙주 병 및 배수 경화증이, 내가 더 증가의 적용 범위를 확장 할 것입니다 분자뿐만 아니라 새로운자가 면역 관련 항원의 지속적인 식별을 이량 체 추가 HLA 클래스의 개발이 확인 된 KaAPC. 또 하나는 동시에 여러 항원을 대상으로 서로 다른 항원에 지시 KaAPC를 사용하여 생각할 수있다. 요약하면, KaAPC는 유연한 플랫폼을위한 기술을 나타내는tigen 특정 T 세포 고갈. 그들의 &quot;레고 같은&quot;자연은 확대하고 시험관 및 생체 적용에 자신의 후속을 향상시킬 수있는 다양한 행렬에 같은 PD1 또는 TRAIL 등의 추가 공동 자극하거나 억제 신호와 같은 새로운 신호를 포함 할 수 있습니다. 우리는 본원 KaAPC, 상이한 특이성을 가진 T 세포 혼합물로부터 항원 특이적인 T 세포의 제거를위한 제 비드 기반 접근법을 생성하는 단계별 프로토콜을 제시한다. <img alt="그림 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51859/51859fig3highres.jpg" width="500" /> 그림 3은 KaAPC는 항원 특이적인 방식으로 CTL을 제거하는 일에의 Fas + 이펙터 메모리 CTL 활성화 PKH26 표지와 혼합하여 동일한 기증자 CMVpp65 특정 CTL PKH67가 표지 :. CMVpp65 KaAPC 1 비율과 공 배양 48 시간 동안. 제어 문화 언로드 KaAPC 또는 1 μg / ml로 처리 하였다의 용해 방지는 Fas-단클론 항체 (클론 CH11). 가능한 세포의 손실을 최소화 처리되지 않은 혼합 CTL 문화 (T 믹스)에서 산출 된 것입니다. T 믹스의 각 CTL 인구에 대한 원본 FACS 데이터가 표시됩니다. 이전 두 T 세포 집단 (10) 상에 별도의 게이팅이 공표 한 세포 사멸을 분석 하였다. 왼쪽 상단 사분면에 묘사 된 숫자는 전체 세포의 %를 나타냅니다. 보여주는 그림은 3 개의 독립적 인 실험에서 대표 한 실험에서 파생됩니다. 이 연구는 원래 혈액에 출판되었다​​. . 쉬츠, C. 외 킬러 인위적인 항원 제시 세포 : 신규 한 전략이 특정 T 세포를 제거하는 피.. 2008, 111, 3546-52. 저작권 혈액의 미국 사회. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51859/51859fig3highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

지난 20 년간 많은 진전이자가 면역 질환의 발병 기전을 이해에서했다. 그러나, 가장 일반적인 치료는 여전히 스테로이드뿐만 아니라 퓨린 유사체와 같은 면역 억제제, 알킬화제 및 칼시 뉴린 억제제 하나에 의존한다. 이러한 약물의 사용은 크게 환자의 예후를 개선했다 아직 처리 기본적인 면역 오작동의 치료법을 제공하지 않는다. 또한, 환자는 감염 및 암의 발생에 취약해진다. 따라서, T 세포 매개자가 면역 질환 및 동종 이식 거부 반응의 치료를위한 궁극적 인 목표는 구체적으로, 동시에, 그대로과 면역 질환 싸울 유능한 나머지 면역 체계를 유지하면서 T 세포를 일으키는 유일한 질환을 대상으로하는 것이다. 살린 항원 제시 세포 (APC)는 말초 T 세포 반응을 억제하는 치료제로 제 빠르면 설명한여러 그룹에 의해 1970 년대. 다음 많은 셀 기반 접근법이 개발 되었기 때문에 (쉬츠 외. 2에서 검토). 면역 세포가자가 면역, 동종 이식 거부 반응 및 만성 감염의 치료를위한 치료 가능성을 나타내는 유망한 결과를 켰을 때의 FasL 발현 킬러-APC 사용하는 전략. 그러나, 궁극적으로 임상 적용 가능성을 제한 FasL의 킬러-APC를 활용 전략에 상당한 제한이있다; APC의 (ⅰ) 세대 분리는 시간, 노동 집약적 비용 (II) 혈구 감소증에서 인해 면역 억제로 고통받는 환자는 제한 금액과 세포의 품질을 제공 (III) 등이 높은에서 FasL의 결과로 세포 사멸 유도 신호에 코팅 또는 APC의 전달 가변 표현형 및 (ⅳ) 킬러-APC 결과적으로 그들의 치료 가능성을 감소 T 세포의 효과기 기능을 세포 독성에 민감하다. 따라서, 정의 재현성 킬러-APC의 pheno을 보장하기 어렵다생체 내에서 T 세포 반응의 항원 특이 변조에 이용 될 수있는 타입. 킬러-APC 3-5 인공 항원 제시 세포 (AAPC)를 표현 FasL의 우리의 이전의 연구를 바탕으로 6,7 우리는 자동 반응성 T 세포의 항원 특이적인 억제 또는 제거에 대한 비드 기반 접근 방식 (KaAPC)을 개발 체외. KaAPC는 HLA-A2-IG 이량 체 (신호 1) 공유 4.5 μm의 상자성 라텍스 구슬의 표면에 고정화 방지는 Fas 항체 (세포 사멸 유도 신호)로 구성되어 있습니다. 그들은 항원 특이적인 방법으로 다수의 특이성 T 세포 배양에서의 Fas / FasL의 중재 방식으로 항원 특이적인 T 세포를 고갈 및 활성화 유도 세포사 (AICD) 경로의 독립적. 타겟팅 T 세포에서 농도 의존적 사멸 이미 30 분 후에 8 빠르게 유도된다. KaAPC 용이하게 제어 된 방식으로 생성 될 수는 선반 phenot 오프 정의 확보YPE 셀 기반 공핍 전략의 단점의 대부분을 극복. 따라서, KaAPC는 T 세포 특정 치료 전략의 분야를 발전, T 세포 매개자가 면역 질환 및 이식 거부 반응의 치료에 큰 잠재력을 표시합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="654">
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:185px;">Name</td>
			<td style="width:157px;">Company</td>
			<td style="width:148px;">Cat #</td>
			<td style="width:164px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">human AB serum</td>
			<td>Atlanta biologicals</td>
			<td>S40110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Sigma/Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium azide</td>
			<td>Sigma/Aldrich</td>
			<td>71289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M-450 epoxybeads</td>
			<td>Invitrogen/Dynal</td>
			<td>14011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MPC-1 magnet</td>
			<td>Invitrogen/Dynal</td>
			<td>12001D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">screw top glass vial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-338AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MACSmix Tube Rotator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-CD95 (clone CH11)</td>
			<td>Milliore</td>
			<td>05-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HLA-A2-Ig dimer</td>
			<td>BD/Pharmingen</td>
			<td>551263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryo-tube 2ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-mouse IgG1 PE</td>
			<td>BD/Pharmingen</td>
			<td>559320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-mouse IgM FITC</td>
			<td>BD/Pharmingen</td>
			<td>553408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S271-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">calcium chloride</td>
			<td>Sigma/Aldrich</td>
			<td>C5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES&#160;</td>
			<td>cellgro/Mediatech</td>
			<td>25-060-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI</td>
			<td>gibco/life technologies</td>
			<td>11875-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96well round bottom plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AnnexinV FITC</td>
			<td>PromoKine</td>
			<td>PK-CA577-1001-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">7-AAD</td>
			<td>BD/Pharmingen</td>
			<td>51-68981E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACS tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352008</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

killer artificial antigen presenting cells (kaapc) for efficient in vitro depletion of human antigen-specific t cells

T 세포 매개 된자가 면역 질환의 치료 전류는 감염 또는 악성 종양을 제어하는​​ 능력의 감소로 장기적으로, 부작용을 동반 글로벌 면역의 전략에 주로 의존한다. 따라서, 새로운 접근법은 질병 표적 세포 매개 그대로 남아 면역 체계를 남겨이 개발 될 필요가있다. 지난 10 년간 세포 면역 요법 전략 다양한 T 세포 매개 성 면역 반응이 개발되었다 변조. 이러한 방법의 대부분은 허용 오차를 유발하는 항원 제시 세포 (APC)에 의존하고있다. 그러나, 기술적으로 어렵고 복잡 할뿐만 아니라, 그러한 셀 기반 접근법은 치료 용량을 제한 세포 독성 T 세포 반응에 매우 민감하다. 여기서 우리는 재를 남기고 병적 T 세포의 고갈을 허용 비 셀룰러 킬러 인공 항원 제시 세포의 세대 (KaAPC)에 대한 프로토콜을 제시maining 면역 체계의 손길이 닿지 않은 및 기능. KaAPC는 항원 특정 방식으로 바람직하지 않은 T 세포 반응을 조절함으로써 면역 질환 및 이식 거부의 치료에 잠재적 인 세포 면역 요법을 갖는 대안이다.

이 프로토콜의 특징은 셀 기반 방식에 비해 도포에 의해 변경되지 않는 동시에 HLA-A2-IG (신호 1)와 안티는 Fas 항체 (세포 사멸 신호)를, 표시 KaAPC 표현형의 정의 생성을 포함 또는 전달 효능 및 쉽게 제작 (그림 1) 중 변조 할 수 있습니다. 또한, KaAPC은 T 세포의 세포 독성 이펙터 기능에 민감하지 않으며 그들의 기능 시험관 조작에 전후자가 항원 제시 세포의 품질에 의존하지 않는다. KaAPC 비는 동족 KaAPC이 T 세포 (도 2)이 소모하지 않을 로딩 동안, 동족의 펩티드와 함께로드 될 때 시험 관내에서 항원 특이적인 T 세포를 파괴 할 수있다. 따라서 KaAPC은 항원 특이적인 방식으로 T 세포의 사멸을 유도한다. 다음으로, 우리는 서로 다른 T 세포 SPE의 혼합물로부터 항원 특이적인 T 세포를 선택적으로 고갈 KaAPC 위해 사용최소한의 세포 독성 이웃 T 세포로 누출되는 것을 보여 cificities (그림 3). 따라서 KaAPC은자가 면역 질환 및 이식 거부의 치료를위한 잠재적 임상 적용 가능성을 가진 인간 활성화 항원 특이적인 T 세포의 시험 관내 항원 특이 고갈위한 정교한 도구를 나타낸다.

Watch this Scientific Journal Video about Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells at JoVE.com

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

지침을 제시 세포 킬러 인공 항원의 생성을 위해 제시되고, KaAPC 인간 항원 특이적인 T 세포의 생체 외 고갈과 항원에 T 세포 - 매개자가 면역 질환의 치료를위한 세포 면역 요법에 대한 대안을위한 효율적인 도구 나머지 면역 체계를 손상시키지 않고 특정 패션.

효율적인위한 킬러 인공 항원 제시 세포 (KaAPC)<em&gt; 체외</em&gt; 인간의 항원 특이 T 세포의 고갈

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

killer-artificial-antigen-presenting-cells-kaapc-for-efficient-vitro

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

9.6K 조회수.  Johns Hopkins University.  지침을 제시 세포 킬러 인공 항원의 생성을 위해 제시되고, KaAPC 인간 항원 특이적인 T 세포의 생체 외 고갈과 항원에 T 세포 - 매개자가 면역 질환의 치료를위한 세포 면역 요법에 대한 대안을위한 효율적인 도구 나머지 면역 체계를 손상시키지 않고 특정 패션. 

비디오: Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) can be used to easily and quickly label a cell population of interest for in vivo investigation. This labeling has classically been used to study proliferation and migration. In the method presented here, we have shortened the timeline after adoptive transfer to look at survival and killing of epitope specific CFSE labeled target cells4-6. The level of specific killing of a CD8 + T cell clone can indicate the quality of the response, as their quantity may be misleading. Specific CD8+ T cells can become functionally exhausted over time with a decline in cytokine production and killing7,8. Also, certain CD8 + T cell clones may not kill as well as others with differing TCR specificities9. For effective Cell Mediated Immunity (CMI), antigens must be identified that produce not only adequate numbers of responding T cells, but also functionally robust responding T cells. Here we assess the percent cell specific killing of two peptide specific T cell clones in BALB/c mice.

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Many infections elicit a strong CTL response, but occasionally, the quantity of responding cells does not correlate to control of the pathogen1. One measure of CTL quality is their ability to kill specifically2. CFSE labeling of target cells can be used to investigate this CTL response quality in vivo3,4.

항원 특정 VIVO에서</emCFSE 라벨 대상 세포를 사용하여> 죽이는 분석

Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) can be used to easily and quickly label a cell population of interest for in vivo investigation.  ...

연구

면역학 및 감염병학

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals may exhibit suppressive immune microenvironment and, in contrast to activating CTL, their autologous antigen presenting cells may tend to tolerize or anergize antigen specific CTL. As a result, although still in the experimental phase, CTL-based adoptive immunotherapy has evolved to become a promising treatment for various diseases such as cancer and virus infections. In initial experiments ex vivo expanded CMV (cytomegalovirus) specific CTL have been used for treatment of CMV infection in immunocompromised allogeneic bone marrow transplant patients. While it is common to have life-threatening CMV viremia in these patients, none of the patients receiving expanded CTL develop CMV related illness, implying the anti-CMV immunity is established by the adoptively transferred CTL1. Promising results have also been observed for melanoma and may be extended to other types of cancer2. 
While there are many ways to ex vivo stimulate and expand human CTL, current approaches are restricted by the cost and technical limitations. For example, the current gold standard is based on the use of autologous DC. This requires each patient to donate a significant number of leukocytes and is also very expensive and laborious. Moreover, detailed in vitro characterization of DC expanded CTL has revealed that these have only suboptimal effector function 3. 
Here we present a highly efficient aAPC based system for ex vivo expansion of human CMV specific CTL for adoptive immunotherapy (Figure 1). The aAPC were made by coupling cell sized magnetic beads with human HLA-A2-Ig dimer and anti-CD28mAb4. Once aAPC are made, they can be loaded with various peptides of interest, and remain functional for months. In this report, aAPC were loaded with a dominant peptide from CMV, pp65 (NLVPMVATV). After culturing purified human CD8+ CTL from a healthy donor with aAPC for one week, CMV specific CTL can be increased dramatically in specificity up to 98% (Figure 2) and amplified more than 10,000 fold. If more CMV-specific CTL are required, further expansion can be easily achieved by repetitive stimulation with aAPC. Phenotypic and functional characterization shows these expanded cells have an effector-memory phenotype and make significant amounts of both TNF&alpha; and IFN&gamma; (Figure 3).

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

A new DC independent method for induction and expansion of antigen-specific T cells is described. HLA A2-Ig based artificial Antigen Presenting Cells (aAPC) are loaded with HLA-A2 restricted peptides to efficiently expand CTL of diverse antigen specificity. This technology holds great potential for CTL-based adoptive immunotherapy.

효율에 대한 HLA - IG 기반 인공 항원 제시 세포 예 생체내</em인간 CTL의> 확장

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals ...

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike classical T cells, NKT cells recognize lipid antigen in the context of CD1 molecules2. NKT cells express an invariant TCR&alpha; chain rearrangement: V&alpha;14J&alpha;18 in mice and V&alpha;24J&alpha;18 in humans, which is associated with V&beta; chains of limited diversity3-6, and are referred to as canonical or invariant NKT (iNKT) cells. Similar to conventional T cells, NKT cells develop from CD4-CD8- thymic precursor T cells following the appropriate signaling by CD1d 7. The potential to utilize NKT cells for therapeutic purposes has significantly increased with the ability to stimulate and expand human NKT cells with &alpha;-Galactosylceramide (&alpha;-GalCer) and a variety of cytokines8. Importantly, these cells retained their original phenotype, secreted cytokines, and displayed cytotoxic function against tumor cell lines. Thus, ex vivo expanded NKT cells remain functional and can be used for adoptive immunotherapy. However, NKT cell based-immunotherapy has been limited by the use of autologous antigen presenting cells and the quantity and quality of these stimulator cells can vary substantially. Monocyte-derived DC from cancer patients have been reported to express reduced levels of costimulatory molecules and produce less inflammatory cytokines9,10. In fact, murine DC rather than autologous APC have been used to test the function of NKT cells from CML patients11. However, this system can only be used for in vitro testing since NKT cells cannot be expanded by murine DC and then used for adoptive immunotherapy. Thus, a standardized system that relies on artificial Antigen Presenting Cells (aAPC) could produce the stimulating effects of DC without the pitfalls of allo- or xenogeneic cells12, 13. Herein, we describe a method for generating CD1d-based aAPC. Since the engagement of the T cell receptor (TCR) by CD1d-antigen complexes is a fundamental requirement of NKT cell activation, antigen: CD1d-Ig complexes provide a reliable method to isolate, activate, and expand effector NKT cell populations.

Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Here we describe a method for activating and expanding human NKT cells from bulk T cell populations using artificial antigen presenting cells (aAPC). The use of CD1d-based aAPC provides a standardized method for generating high numbers of functional NKT cells.

인공 항원은 세포 (aAPC) 중재의 활성화와 자연 킬러 T 세포의 확장을 제시

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer a biologic product with the potential for superior (i) recognition of tumor-associated antigens (TAAs), (ii) persistence after infusion, (iii) potential for migration to tumor sites, and (iv) ability to recycle effector functions within the tumor microenvironment. Most approaches to genetic manipulation of T cells engineered for human application have used retrovirus and lentivirus for the stable expression of CAR1-3. This approach, although compliant with current good manufacturing practice (GMP), can be expensive as it relies on the manufacture and release of clinical-grade recombinant virus from a limited number of production facilities. The electro-transfer of nonviral plasmids is an appealing alternative to transduction since DNA species can be produced to clinical grade at approximately 1/10th the cost of recombinant GMP-grade virus. To improve the efficiency of integration we adapted Sleeping Beauty (SB) transposon and transposase for human application4-8. Our SB system uses two DNA plasmids that consist of a transposon coding for a gene of interest (e.g. 2nd generation CD19-specific CAR transgene, designated CD19RCD28) and a transposase (e.g. SB11) which inserts the transgene into TA dinucleotide repeats9-11. To generate clinically-sufficient numbers of genetically modified T cells we use K562-derived artificial antigen presenting cells (aAPC) (clone #4) modified to express a TAA (e.g. CD19) as well as the T cell costimulatory molecules CD86, CD137L, a membrane-bound version of interleukin (IL)-15 (peptide fused to modified IgG4 Fc region) and CD64 (Fc-&gamma; receptor 1) for the loading of monoclonal antibodies (mAb)12. In this report, we demonstrate the procedures that can be undertaken in compliance with cGMP to generate CD19-specific CAR+ T cells suitable for human application. This was achieved by the synchronous electro-transfer of two DNA plasmids, a SB transposon (CD19RCD28) and a SB transposase (SB11) followed by retrieval of stable integrants by the every-7-day additions (stimulation cycle) of &gamma;-irradiated aAPC (clone #4) in the presence of soluble recombinant human IL-2 and IL-2113. Typically 4 cycles (28 days of continuous culture) are undertaken to generate clinically-appealing numbers of T cells that stably express the CAR. This methodology to manufacturing clinical-grade CD19-specific T cells can be applied to T cells derived from peripheral blood (PB) or umbilical cord blood (UCB). Furthermore, this approach can be harnessed to generate T cells to diverse tumor types by pairing the specificity of the introduced CAR with expression of the TAA, recognized by the CAR, on the aAPC.

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

T cells expressing a CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) are infused as investigational treatment of B-cell malignancies in our first-in-human gene therapy trials. We describe genetic modification of T cells using the Sleeping Beauty (SB) system to introduce CD19-specific CAR and selective propagation on designer CD19+ artificial antigen presenting cells.

임상 신청<em&gt; 잠자는 숲속의 미녀</em유전자 주변과 배꼽 탯줄 혈액에서 T 세포를 수정하는 셀을 제시&gt;과 인공 항원

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological mechanisms involved during the disease is the T cell transfer model of colitis. In this model, immunodeficient mice (RAG-/- recipients) are reconstituted with naive CD4+ T cells from healthy wild type hosts.
This model allows examination of the earliest immunological events leading to disease and chronic inflammation, when the gut inflammation perpetuates but does not depend on a defined antigen. To study the potential role of antigen presenting cells (APCs) in the disease process, it is helpful to have an antigen-driven disease model, in which a defined commensal-derived antigen leads to colitis. An antigen driven-colitis model has hence been developed. In this model OT-II CD4+ T cells, that can recognize only specific epitopes in the OVA protein, are transferred into RAG-/- hosts challenged with CFP-OVA-expressing E. coli. This model allows the examination of interactions between APCs and T cells in the lamina propria.

In this antigen-driven colitis model, OT-II CD4+ T cells expressing a red fluorescent protein were adoptively transferred into RAG-/- mice that express a green fluorescent protein in mononuclear phagocytes (MPs). The hosts were challenged with Escherichia coli (E.coli) expressing the ovalbumin protein (OVA) fused to a cyan fluorescent protein (CFP).

항원 중심의 성 대장염 모델의 개발은 항원이 T 세포에 세포를 제시하여 항원의 프리젠 테이션을 공부하기

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, cloning TCRs specific for various tumor-associated antigens has been the goal of many studies. To elicit an effective T cell response, the TCR must recognize the target antigen with optimal affinity. However, cloning such TCRs has been a challenge and many available TCRs possess sub-optimal affinity for the cognate antigen. In this protocol, we describe a method of cloning de novo high affinity antigen-specific TCRs using existing TCRs by exploiting hemichain centricity. It is known that for some TCRs, each TCR&#945; or TCR&#946; hemichain do not contribute equally to antigen recognition, and the dominant hemichain is referred to as the centric hemichain. We have shown that by pairing the centric hemichain with counter-chains differing from the original counter-chain, we are able to maintain the antigen specificity, while modulating its interaction strength for the cognate antigen. Thus, the therapeutic potential of a given TCR can be improved by optimizing the pairing between the centric and counter hemichains.

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Herein we describe a novel method to generate antigen-specific T cell receptors (TCRs) by pairing the TCR&#945; or TCR&#946; of an existing TCR, possessing the antigen-specificity of interest, with complementary hemichain of the peripheral T cell receptor repertoire. The de novo generated TCRs retain antigen-specificity with varying affinity.

생성<em&gt; 드 노보</em&gt; 중심 Hemichain의 레트로 바이러스 형질 도입에 의해 항원 특이 적 인간 T 세포 수용체

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic self-tolerance. Tregs represent about 5 - 10% of the mature CD4+ T cell subpopulation in mice and humans, with about 1 - 2% of those Tregs circulating in the peripheral blood. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) can be differentiated into functional Tregs, which have a potential to be used for cell-based therapies of autoimmune diseases. Here, we present a method to develop antigen (Ag)-specific Tregs from iPSCs (i.e., iPSC-Tregs). The method is based on incorporating the transcription factor FoxP3 and an Ag-specific T cell receptor (TCR) into iPSCs and then differentiating on OP9 stromal cells expressing Notch ligands delta-like (DL) 1 and DL4. Following in vitro differentiation, the iPSC-Tregs express CD4, CD8, CD3, CD25, FoxP3, and Ag-specific TCR and are able to respond to Ag stimulation. This method has been successfully applied to cell-based therapy of autoimmune arthritis in a murine model. Adoptive transfer of these Ag-specific iPSC-Tregs into Ag-induced arthritis (AIA)-bearing mice has the ability to reduce joint inflammation and swelling and to prevent bone loss.

We present here a method to develop functional antigen (Ag)-specific regulatory T cells (Tregs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) for immunotherapy of autoimmune arthritis in a murine model.

자가 면역 대해 줄기 세포 유래의 항원 특이 적 조절 T 세포의 발달

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the antibody needs to distinguish between highly related structures (e.g., a normal protein and a mutated version thereof). The current way of generating such discriminative mAbs involves extensive screening of multiple Ab-producing B cells, which is both costly and time consuming. We propose here a rapid and cost-effective method for the generation of discriminative, fully human mAbs starting from human blood circulating B lymphocytes. The originality of this strategy is due to the selection of specific antigen binding B cells combined with the counter-selection of all other cells, using readily available Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC). Once specific B cells are isolated, cDNA (complementary deoxyribonucleic acid) sequences coding for the corresponding mAb are obtained using single cell Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) technology and subsequently expressed in human cells. Within as little as 1 month, it is possible to produce milligrams of highly discriminative human mAbs directed against virtually any desired antigen naturally detected by the B cell repertoire.

We describe a method for the production of human antibodies specific for an antigen of interest, starting from rare B cells circulating in human blood. Generation of these natural antibodies is efficient and rapid, and the antibodies obtained can discriminate between highly related antigens.

희귀 한 항 원 특정 B 세포 혈액 순환에서 구별 인간 단일 클론 항 체의 생성

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Described is a simple, in vitro, dye dilution-based method for measuring antigen-specific CD4+ T cell proliferation in human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The development of stable, non-toxic, fluorescent dyes such as carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) allows for rare, antigen-specific T cells to be distinguished from bystanders by diminution in fluorescent staining, as detected by flow cytometry. This method has the following advantages over alternative approaches: (i) it is very sensitive to low-frequency T cells, (ii) no knowledge of the antigen or epitope is required, (iii) the phenotype of the responding cells can be analyzed, and (iv) viable, responding cells can be sorted and used for further analysis, such as T cell cloning.

Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Presented here is a protocol for measuring proliferating CD4+ T cells in response to antigenic proteins or peptides using dye dilution. This assay is particularly sensitive to rare antigen-specific T cells and can be modified to facilitate cloning of antigen-specific cells.

카르복시플루아세인 수치니미딜 에스테르를 이용한 증식 인간 항원 특이적 CD4+ T 세포의 정량화

Described is a simple, in vitro, dye dilution-based method for measuring antigen-specific CD4+ T cell proliferation in human peripheral blood mononuclear ...

High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the spontaneous non-obese diabetes (NOD) mouse model, insulin is the primary target, and genetic manipulation of these animals to remove a single key insulin epitope prevents disease. Thus, selective elimination of professional antigen presenting cells (APCs) bearing this pathogenic epitope is an approach to inhibit the unwanted insulin-specific autoimmune responses, and likely has greater translational potential.
Chimeric antigen receptors (CARs) can redirect T cells to selectively target disease-causing antigens. This technique is fundamental to recent attempts to use cellular engineering for adoptive cell therapy to treat multiple cancers. In this protocol, we describe an optimized T-cell retrovirus (RV) transduction and in vitro expansion protocol that generates high numbers of functional antigen-specific CD8 CAR-T cells starting from a low number of naive cells. Previously multiple CAR-T cell protocols have been described, but typically with relatively low transduction efficiency and cell viability following transduction. In contrast, our protocol provides up to 90% transduction efficiency, and the cells generated can survive more than two weeks in vivo and significantly delay disease onset following a single infusion. We provide a detailed description of the cell maintenance and transduction protocol, so that the critical steps can be easily followed. The whole procedure from primary cell isolation to CAR expression can be performed within 14 days. The general method may be applied to any mouse disease model in which the target is known. Similarly, the specific application (targeting a pathogenic peptide/MHC class II complex) is applicable to any other autoimmune disease model for which a key complex has been identified.

This article describes a protocol for the generation of antigen-specific CD8 T cells, and their expansion in vitro, with the aim of yielding high numbers of functional T cells for use in vitro and in vivo.

자가 면역 당뇨병 모델에서 기능 테스트를 위한 항원 특이적 원발성 원발성 T 세포의 고효율 생성

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the ...