이 프로토콜을 사용하면 자가 면역 질환 치료에 원하는 안전한 접근 방식인 많은 기능성 항원 특이적 T 세포를 생성할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 고효율 트랜스듀션 프로세스와 많은 수의 기능성 T 세포를 제공한다는 것입니다. 이 기술은 항원이 알려져 있는 타입-1 당뇨병 및 그밖 자기 면역 질병을 취급하기 위하여 확장될 수 있습니다.
더욱이, CAR T 세포는 특정 유형의 암에 대한 유망한 치료법일 수 있다. 이 방법은 다른 CARs를 표현하는 면역 세포를 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 좋은 수락 기술을 가지고, 전체 프로토콜을 읽고 사전에 전체 실험을 계획하는 것이 중요합니다.
이 2주 간의 긴 프로토콜에는 미니 단계가 포함되어 있으며 성공은 각 단계의 적절한 성능에 따라 달라집니다. 이 방법의 시각적 데모는 학습자가 올바르게 따르는 데 매우 중요합니다. 원고에 설명된 대로 트랜스페션을 위해 피닉스 세포를 준비한다.
세포에서 불어오는 것을 최소화하기 위해 배지를 첨가하고 제거할 측면 벽을 표시하는 것이 좋습니다. 제로 날에는 세포에서 슈퍼 네티미터를 흡인하고 PBS의 5 밀리리터로 씻어. 조심스럽게 플레이트의 측면 벽에 드롭 방향으로 감소 된 혈청 배지의 일곱 밀리리터를 추가하고 인큐베이터로 다시 세포를 전송합니다.
1.5 밀리리터의 감소된 혈청 배지를 14mm 라운드 하단 폴리프로필렌 튜브 2개에 추가합니다. 40 마이크로미터의 트랜스페션 시약을 튜브 중 하나에 추가하고 다른 하나는 5 마이크로 그램의 포장 플라스미드와 함께 CAR 플라스미드를 리디렉션 한 항체 15 마이크로그램을 추가합니다. 실온에서 튜브를 5분간 배양한 다음 플라스미드 튜브에 경질 시약을 추가합니다.
용액을 세 번 위아래로 부드럽게 파이프로 섞고 실온에서 적어도 20 분 동안 배양하십시오. 피닉스 세포에 혼합물의 3 밀리리터를 추가하고 조직 배양 인큐베이터에 배치합니다. 4~5시간 후에 는 세포에 FCS 1밀리리터를 추가하고 섭씨 37도에서 하룻밤 사이에 배양합니다.
다음 날, 세포에서 상체를 제거하고 신선한 예온 배양 배지의 4 밀리리터를 추가합니다. 피닉스 세포로부터 배지를 함유하는 바이러스를 수집하고 여과하여 2일째에 바이러스를 수확하여 잔류 세포 이물질을 제거합니다. 밀리리터당 200개의 국제 유닛의 최종 농도를 위해 바이러스에 재조합 인간 IL-2 스톡을 추가하고 즉시 트랜스듀션에 사용하십시오.
피닉스 세포에 신선한 배지 4 밀리리터를 넣고 하룻밤 동안 인큐베이터에 넣습니다. 두 번째 트랜스퍼션을 위해 다음 날에 바이러스 수집을 반복하고 세포를 폐기합니다. 하루 전에 murine CD8 T 세포를 파종하기 전에, 24 웰 플레이트의 각 웰에 항 마우스 CD3 및 CD28 항체의 혼합물의 1 밀리리터를 추가하고 4섭씨에서 하룻밤 동안 플레이트를 배양한다.
제로 날에는 마우스 비장을 수확하고 얼음에 세포 배양 접시에 PBS의 10 밀리리터에 담근 세포 여조기에 넣습니다. 세포 배양 후드에서 각 비장을 3~5개로 자르고 주사기의 멸균 플런저를 사용하여 와이어 메쉬를 통해 조직을 누릅니다. 희석된 적혈구 용해 버퍼 1~4개를 재연하고 실온에서 5분 동안 배양한 다음 세포 계수를 계산하기 위해 Trypan Blue로 셀 서스펜션의 10 마이크로리터를 희석하여 적혈구를 부드럽게 제거합니다.
그리고 7 분 동안 350 배 g에서 원심분리하여 세포의 나머지 부분을 펠릿. 마우스 CD8 T 세포 격리 키트를 사용하여 CD8 T 세포를 농축하고 400 마이크로리터의 완충제에 세포 펠릿을 일시 중단하여 1회 10회당 비오틴 항체 칵테일100마이크로리터를 8세포에 한다. 세포 현탁액을 잘 섞고 섭씨 4도에서 5분간 배양하여 항체 결합을 허용합니다.
그런 다음 라벨링 버퍼 300마이크로리터와 제8세포에 1회 10회당 안티 비오틴 마이크로비드 200마이크로리터를 추가합니다. 잘 섞어서 섭씨 4도에서 10분 간 추가로 배양하세요. 한편, 분리기 위에 분리 열을 설정하고 라벨링 버퍼의 세 밀리리터로 세척합니다.
40 마이크로미터 셀 스트레이너를 기둥 위에 놓고 스트레이너를 통해 비드 및 셀 혼합물의 1밀리리터를 분리 열로 전달합니다. 미리 냉각된 15 밀리리터 튜브로 흐름을 수집하고 제조업체의 지시에 따라 컬럼을 세척하여 동일한 튜브로 유출물을 수집합니다. 세포를 계산하고 5 분 동안 350 배 g에서 원심 분리로 수집합니다.
T 셀 배지와 원심분리기 의 2 밀리리터로 다시 씻어. 그런 다음 밀리리터 당 250, 000 ~ 500, 000 세포의 농도로 예열된 T 세포 배지에서 이를 다시 중단합니다. 이전에 준비된 CD3 및 CD28 항체 코팅 플레이트를 멸균 PBS 1밀리리터로 세 번 세척하고 각 웰에 셀 서스펜션의 2밀리리터를 추가합니다.
소용돌이 치는 움직임을 사용하여 세포를 균등하게 분배합니다. 대조군으로서, 동일한 수의 CD8 T 세포를 플레이트의 단일 비코팅 우물로 플레이트에 플레이트와 배양하고 48시간 동안 10%의 이산화탄소 가스 탱크 인큐베이터에서 37도의 세포배양증을 한다. 첫날에는 24웰 플레이트의 우물에 0.5 밀리리터의 섬유네틴을 추가하고 섭씨 4도에서 밤에 배양하여 인간 섬유네틴 조각 코팅 플레이트를 준비하십시오.
다음 날, fibronectin 용액을 제거하고 잘 당 2 %BSA및 PBS의 1 밀리리터를 추가합니다. 플레이트를 실온에서 30분 동안 배양하고 처리된 우물을 멸균 PBS 1밀리리터로 세척합니다. 플레이트는 세척 용액을 제거 한 후 사용할 준비가되어 있습니다.
Trypan Blue를 사용하여 활성화된 CD8 T 셀을 계산합니다. 원심분리로 수집합니다. 그리고 트랜스듀션을 위해 밀리리터당 5백만 개의 실행 가능한 세포로 재보좌합니다.
활성 CD8 셀 서스펜션의 마이크로리터 100개를 각 웰에 추가합니다. 그런 다음 배지를 함유한 이전에 준비된 바이러스의 1.5~2밀리리터를 추가하고 소용돌이 운동을 사용하여 세포를 균등하게 분배한다. 접시를 지글록 백에 밀봉하고 원심분리기는 섭씨 37도에서 90분 동안 2, 000배 g로 밀봉합니다.
원심분리기에서 플레이트를 제거하고 생물학적 안전 캐비닛에 가져 가라. 조심스럽게 비닐 봉지를 제거하고 접시의 외부가 매체로 오염되지 않았는지 확인합니다. 플레이트를 섭씨 37도이산화탄소 인큐베이터로 옮기습니다.
4 시간 후, 각 우물에서 매체의 1 밀리 리터를 제거하고, 미리 온전한 완전한 T 세포 매체의 1 밀리리터로 대체하고 인큐베이터에 다시 접시를 넣습니다. 이 프로토콜의 중요한 측면은 하이 티터 바이러스, 건강한 활성화 된 T 세포 및 적절한 변환 방법입니다. 세포는 유동 세포 분석을 위해 PE 크기 7개의 공주 항CD8, AF647 공주 항 CD3 및 BV 421 공주 방지 CD28과 함께 공동 염색하였다.
CD8 T 세포의 약 70%가 CAR 발현을 나타내는 GFP를 공동 발현하였다. 또한 CD28 및 CD3를 공동 표현했습니다. 중요한 것은, 모든 GFP 양성 세포는 또한 I-Ag7 인슐린 BR3 테트라머와 공동 염색되어 세포 표면에 CAR의 발현을 나타내지만 대조테티머와는 달리 염색하였다.
더욱이, 선별된 시험 및 제어 CAR T 세포는 각각 코그네이트 리간드를 발현하는 표적 세포와 공동 배양 후에만 높은 수준의 인터페론 감마를 분비하여, 이는 트랜스포메이트 세포가 모체 항체의 표적을 향한 CD8 이펙터 T 세포 표현형을 갖는것을 확인한다. 바이러스 생산자 세포의 변환, 1 차 CD8 T 세포의 격리 및 이러한 T 세포의 활성화는이 실험의 가장 중요한 단계이다. 건강한 활성화 된 T 세포와 적절한 시약이있는 이러한 T 세포의 전이가 있으면 유리한 결과를 보장합니다.
이 방법은 다른 T 세포를 변환하는 데 사용할 수 있지만 특정 T 세포 유형에 맞게 사용자 지정해야 합니다. 이 프로토콜은 항원 특이적 키메라 항원 수용체 T 세포 요법을 통해 제1형 당뇨병예방의 길을 열어준다.
