저자는 도움이 SB 시스템과 관련하여 도움이 aAPC 클론 # 4, 박사 페리 해킷을 (미네소타 대학) 생성 및 제공하는 박사 칼 6 월 (펜실베니아 대학) 감사드립니다. 기금 지원 : 암 센터 코어 그랜트 (CA16672), RO1 (CA124782, CA120956, CA141303), R33 (CA116127), P01 (CA148600), 포자 (CA136411), 앨버트 J 구 재단, 버로우즈 웰컴 기금, Gillson Longenbaugh 재단, 암 예방 텍사스의 연구소, CLL 글로벌 연구 재단, 국방부, Noelan L. Bibler의 부동산, 해리 T. Mangurian, 주니어, 백혈병 Immunotherapy을위한 기금, 개인 암 치료 연구소, 백혈병 및 림프종 학회, 림프종 연구 재단, MDACC의 자매 기관 네트워크 기금, 밀러 재단 씨는 허브 Simon 씨, 씨, 부인 조 H. 저울, 토마스 씨 스콧, 암 연구에 대한 국립 재단, 소아 암 연구 재단, 생산 Assistanc윌리엄 로렌스와 블랜치 휴즈 어린이 재단, 세포 치료 (협정)에 대한 전자.

<html> 일 0 또는 전 1. PB와 UCB에서 Mononuclear 세포의 절연 (MNC) <ol><li> 동일한 볼륨 PB, 그리고 PBS-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 네 개의 볼륨이있는 UCB을 희석. </li><li> 40 분 (NO 브레이크) - 50 ML의 원심 분리기 튜브 (들) 30 400 XG에서 원심 분리기에 Ficoll로 천천히 층 희석 혈액 (25 ML) (12 ML). </li><li> 신선한 50 ML의 원심 분리기 튜브에 전송 피펫을 사용하여 mononuclear 세포 분율 (인터페이스)를 수집하고 전송할 수 있습니다. </li><li> PBS-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 함께 50 ML에 볼륨을 준비하고 10 분에 450 XG에 원심 분리기. </li><li> 전체 문화 미디어 (CCM)와 10 분 400 XG에 원심 분리기 50 ML에있는 표면에 뜨는, 부드럽게 다시 중단 세포 펠렛 (들)을 대기음. </li><li> 부드럽게 다시 중단과 수영장 CCM의 셀 알약을하고 Trypan 파랑 제외 방법 (Cellometer, PBMC 프로그램)를 사용하여 세포 수를 수행합니다. </li><li> MNC는 현재 electroporation (Nucleofection)을 사용하거나 나중에 사용하기 위해 cryopreserved 할 수 있습니다. </li></ol>일 0에 Electroporation에 대한 T 세포의 제목 &quot;&gt; 2. 준비 <ol><li> cryopreserved MNC를 사용하는 경우, 신속하게 전체 규모의 electroporation (2 X 10 8 원심 분리하고 2 시간의 잠복 기간 동안 세포 손실 계정에 ~ 20 %를 추가) 37 년 ° C 물 목욕 충분한 세포를 해동. 갓 격리 사용하는 경우 MNC는 2.3 단계로 진행합니다. </li><li> 부드럽게 다시 일시 중지 및 사전 예열 완료 페놀 - 무료 RPMI 문화 미디어 (PF-RPMI)과 10 분 (노 브레이크), 기음의 표면에 뜨는 200 XG에서 원심 분리기를 포함하고 적절하게 크기의 원심 분리기 튜브 (들)에 셀을 전송할 수 있습니다. </li><li> PF-RPMI에있는 MNC를 다시 중지 세포 수 (Cellometer)를 수행하고 10 6 세포 / ML의 농도에서 적절하게 크기의 세포 배양 용기 (들)에 셀을 전송할 수 있습니다. </li><li> humidified 37 ° 품다 2 시간을위한 C / 5퍼센트 CO 2 인큐베이터 ± 30 분. </li><li> 멸균 원심 분리기 튜브 (들), 5 분 (브레이크) 200 XG에서 스핀에 MNC을 전송, 부드럽게 표면에 뜨는 및 R를 대기음전자 중단하고 PF-RPMI의 셀 펠렛 (들)을 이루고 있습니다. </li><li> 셀 수 (Cellometer)를 수행하고 (2 X 10 8 MNC)가 필요 세포 현탁액의 볼륨을 계산합니다. </li><li> 멸균 50 ML의 원심 분리기 튜브 및 10 분 (노 브레이크) 200 XG의 스핀으로 계산 된 볼륨을 전송합니다. </li><li> 더 잔여 미디어가 남아하지 않고 부드럽게 튜브의 측면을 눌러 다시 일시 중지되도록 표면에 뜨는을 대기음. </li></ol> 3. 일 0에 MNC (10 큐벳을 사용하여 전체 규모 프로세스)의 Electroporation (Nucleofection) <ol><li> humidified 37 ° C / 5% CO 2 인큐베이터에서 따뜻한 PF-RPMI 4 ML을 포함하는 열 우물로 멸균 12 잘 판을 사전 품다. </li><li> 준비 및 사전 따뜻한 Lonza Nucleofector 솔루션 인간 T 세포 키트 (제조업체의 지침에 따라 재구성 <a href="http://www.lonza.com" target="_blank">www.lonza.com</a> ) 바이오 내각 (BSC)의 주변 온도. </li><li> 추가 기능에 의해 Nucleofector 솔루션 / DNA 마스터 믹스를 준비보충 Nucleofector 솔루션의 g 100 μl, transposon 15 μg (CD19RCD28/pSBSO로 지정 플라스미드 supercoiled의 DNA)과 반응 / 큐벳 당 transposase 5 μg (pCMV-SB11로 지정 플라스미드 supercoiled DNA의). </li><li> 부드럽게 원심 분리기 튜브의 측면을 클릭하여 세포 펠렛을 (단계 2.8에서) 분산과 Nucleofection 솔루션 / DNA 마스터 믹스 (최종 세포 농도 : 2 X 10 7 cells/100 μl)에 다시 일시 중지합니다. </li><li> 조심스럽게 거품을 피하려면 조심하는 것 10 Lonza의 Nucleofection 큐벳의 각 세포 현탁액 (단계 3.4에서) 100 μl를 전송합니다. </li><li> 한 번 큐벳을 누르면, 프로그램 U-014를 (unstimulated T 세포)를 사용하여 electroporate. </li><li> BSC에 큐벳과 12 잘 플레이트 (단계 3.1) 전송합니다. </li><li> 잘 대응에서 사전 예열 문화 매체의 ~ 500 μl를 추가 (STE에서 조리 12 잘 플레이트에 의해 Amaxa 고급 팁 전송 피펫을 사용하여 각 큐벳에서 electroporated 세포를 수확P 3.1)하고 humidified 37 판을 반환 ° 2 시간을위한 C / 5퍼센트 CO 2 인큐베이터 ± 30 분. </li><li> 2 시간의 잠복, 수확을 따라 모든 우물에서 멸균 원심 분리기 튜브에 세포를 전송합니다. </li><li> 8 분, 주위 온도, 아니 브레이크와 더 잔류 매체는 세포 펠렛을 커버되지 않도록 표면에 뜨는을 기음과 폐기 140 XG에서 원심 분리하여 세포를 씻으십시오. </li><li> 부드럽게 원심 분리기 튜브의 측면을 클릭하여 세포 펠렛을 분산하고 부드럽게 단일 세포 현탁액을 달성하기 위해 CCM에 다시 일시 중지합니다. </li><li> 세포 수를 수행하고 10 6 세포 / CCM에 ML로 세포 농도를 조정합니다. </li><li> 야간 보육의 세포 배양 플라스크 (들)과 장소에 세포 현탁액을 전송합니다. </li><li> EGFP-transfected 세포 (Amaxa 제어 EGFP가 플라스미드 supercoiled 5 μg 5 X 10 6 세포 / 큐벳, pmaxGFP) : 프로세스 단계는 2.1-3.8가 제어 반복했다. </li></ol> 1 일 1 번째 및 이후자극주기 4. 1 일에 유동 세포 계측법에 의한 자동차 식의 분석 <ol><li> electroporated 세포를 수확하고 Trypan 파랑 제외 방법 (Hemocytometer)를 사용하여 세포 수를 수행합니다. </li><li> 3 번 CD, CD4, CD8, 인간 IgG Fcγ (자동차 표현의 측정 등)에 대한 항체 특정와 얼룩 세포 (1 ~ 2 × 10 6). </li><li> FACS Calibur에 세포를 취득하고 자동차의 표현을 계산하는 FCS Express 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석 할 수 있습니다. <ol><li> 공식에 의한 문화의 자동차 + 셀을 계산 : (총 가능한 셀의 번호) X (%의 CAR + 셀) 차 = 번호 + 세포 </li></ol></li></ol> 5. 1 일에 aAPC의 준비 (클론 # 4). aAPC은 (클론 # 4) 공동 명시 원하는 T 세포 공동 stimulatory 분자에 K562 세포 (미국 유형 문화 컬렉션에서 획득 부모 선)에서 파생 된 <ol><li> 37 년 냉동 100 GY 방사능 aAPC의 나누어지는을 해동 °, C 물 목욕. </li><li> 셀은 400 XG, CCM에 10 분에서 원심 분리하여 두 번 세척하고 Cellometer을 (Trypan 파랑 제외)를 사용하여 계산됩니다. </li><li> 자극에 필요한 가능한 aAPC의 수를 계산 : (자동차 + 셀의 번호는) × 2 방사능 aAPC의 = 번호 필요 </li></ol> 6. 차 aAPC로 인한 자극 + 날에 T 세포 하나 1 일의 시작과 후속 자극주기 <ol><li> CCM의 : 1시 2분의 비율 (가능한 aAPC CAR + 셀)에서 무균 용기에 electroporated 전지 (자동차를 표현)와 γ-방사능 aAPC을 (클론 # 4) 섞는다. <ol><li> aAPC 비율은 유동 세포 계측법 electroporation 다음날에 따라 자동차의 표현에 따라 조정되어 있습니다. </li></ol></li><li> 세포 현탁액에 IL-21 (30 NG / ML)를 추가합니다. </li><li> 에서 나누어지는 T-75cm 2 플라스크 (들) 및 / 또는 10 6 세포 / ML의 농도에서 Vue는 생활 문화 가방과 incubat로 돌아나. </li></ol> 일 3, 5 7. 자동차의 지속적인 문화 + T 세포 <ol><li> 반 미디어 변경을 수행, IL-21를 보충하고, 10 6 세포 / ML의 농도에서 T 세포를 유지하고 있습니다. </li></ol> 7 일 8. 첫 번째 aAPC로 인한 자극주기의 끝 <ol><li> 수확 전지는, 계산 및 얼룩을 3 번 CD, CD4, CD8 및 Fcγ (자동차)와 10.1을 단계로 진행합니다. </li></ol> 9. CD56 + 세포 (보통 7 사이의 14 일 electroporation 후)의 고갈 <ol><li> 상자성체의 비즈를 사용하여 CD56 고갈을 수행하는 경우 CD56 + 3 번 CD 제외의 림프구 ≥ 10 %. </li></ol> 자극주기 # 2, # 3, 일 8 → 14 &amp; # 4 대응, 일 15 → 21, &amp; 일 22 → 28 10. 임상 - 충분한 숫자로 T 세포를 전파하는 aAPC의 재귀 추가 <ol><li> stimulatio를 반복N 과정 (4 시간) 등의 단계 4.3-8.1에 설명되어 있습니다. </li><li> 및 다음 각 미디어의 변화 (3 회, 월요일 - 수요일 - 금요일 일정에 따라)에서 일 7 14 21 일부터 문화에 IL-2 (50U/ml)를 추가합니다. </li><li> Cryopreserve (아카이브)를 초과 T 세포는 필요에 따라. <ol><li> T 세포는 제어 속도 냉동고를 사용하여 냉동. </li></ol></li></ol> 일 28 11. 마지막 aAPC로 인한 자극주기의 끝 : 수확 T 세포 <ol><li> 릴리스 테스트 및 주입을위한 T 세포를 Cryopreserve. </li></ol>

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Transposon 및 piggyBac 12,19 및 SB 18,20-22에서와 같은 transposase 시스템, 임상 학년 차의 바이러스로 인한 전달 + T 세포에 대한 대안 유전자 치료에 대한 비 바이러스 성 방법입니다. SB는 인간의 유전자 치료 1,6,23위한 잠재력을 바탕으로 유전자 전달 시스템으로 선정되었습니다. 우리는 SB의 전위 (차를 소개)와 준수 TAA 특정 T 세포의 제조에 플랫폼 기술의 역할을하도록 γ-방사능 aAPC의 재귀 추가 (안정적으로 차를 표현하는 유전자 변형 T 세포를 검색)의 이중 기술을 개발 단계 I / II 시험을위한 cGMP (그림 4)와. γ-방사능 aAPC의 공동 문화 28 일 (4 7 일간 자극을주기) 후, 우리는 일반적으로 인간의 응용 프로그램에 대한 최소한 ~ 10 10 유전자 변형 T 세포가 적절한 생성 할 수 있습니다. 필요에 따라 추가 자극을주기는 t을 수행 할 수 있습니다O 유전자 변형 T 세포의 큰 숫자를 생성합니다. 적은 자동차 + T 세포가 필요한 경우 또한, electroporation 및 전파에 대한 접근 방식은 다시 적은 큐벳을 채용 각의 시작 부분에서 앞으로 aAPC에서 확산의 후속 라운드에 대한 숫자 확대 T 세포의 단지 하위 집합을 들고 크기를 조정 할 수 있습니다 자극주기. 대부분의 electroporated 및 주입 안정적으로 차를 표현을위한 수확 T 세포를 증식. CD4의 가지가 + 및 2 차 생성 차를 표현하는 CD8 + T 세포는 메모리 / 순진한 표현형과 세포를 포함하고 재 감독 특이성 세 특징을 나타냅니다. 첫째, 유전자 변형 T 세포는 특히, 둘째 CD19 + 목표를 lyse CD19 + stimulator 세포에 대한 응답으로 IFN-γ를 생산 그리고 셋째는, CD19에 대한 응답으로 세포 분열 따위에 의해 번식 + 피더 세포, 자동차에 의존 방식으로 13,18의 모든합니다. integr에 대한 우리의 접근 방식SB 시스템에서 비 바이러스 성 DNA의 plasmids의 전자 송금 자동차 transgene을 먹은는 PB와 UCB에서 파생 된 동작 기본 T 세포에서 수행 할 수 있습니다. 우리와 다른 유전자 aAPC 효율적으로 주입 24,25에 대한 T 세포의 임상 - 충분한 숫자를 전파하는 역할을 K562 세포를 수정했습니다. aAPC 및 조직 문화 환경 (예 : IL-21의 추가)을 생성하도록 수정 된 된 환자와 조혈 줄기 세포 이식 후 주입을위한 CD19 특정 T 세포 (표 1) 13,18을 기증 - 파생. 우리는 자동차를 생성 할 수 있습니다 + PB의 T 세포는 단순히 비용, 불편 함, 그리고 apheresis에 의해 PB에서 MNC를 획득 불편을 방지하는 venipuncture하여 얻을. CAR 많은 수의 + MNC의 작은 숫자에서 T 세포를 유도 할 수있는 능력은 특히 allogeneic UCB 이식 후 T 세포를 기적에 호소하고 있습니다. 신생아 기증자의 작은 크기와 익명 재 precludes- 액세스 이후 시점에서이 개인을하고 수확 MNC의 제한된 숫자는 조혈을 방해하지 않도록 T 세포 제조를위한 재료를 시작하기로 사용할 수 있습니다. 제조 공정에 대한 더 진보는 현재 취급을 최소화하기 위해 완전히 폐쇄 WAVE의 생물 반응기와 결합 높은 처리량 electroporation 장치를 포함 진행되고 있습니다. 집계에서 SB와 aAPC는 플랫폼 CD19 별 CAR + cGMP 준수 대체 세포 표면 TAAs를 인식 할 수 유전자 변형 T 세포의 큰 숫자를 생성하도록 구성 할 수 있습니다 T 세포를 생성하는 호소하고 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 </td><td> 공급 업체 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 시약 </td></tr><tr><td> DNA 플라스미드 표현의 GFP (pmaxGFP) </td><td> Lonza </td><td> VPA-1002 (키트) </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> 시그마 </td><td> D8537 </td><td></td></tr><tr><td> CliniMACS PBS-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 70,026 </td><td></td></tr><tr><td> HyQ RPMI-1640 </td><td> 열 과학 </td><td> SH30096.01 </td><td></td></tr><tr><td> 페놀 무료 RPMI-1640 </td><td> 열 과학 </td><td> SH30605.01 </td><td></td></tr><tr><td> Hyclone 태아 소 혈청 </td><td> 열 과학 </td><td> SH3007003HI </td><td></td></tr><tr><td> GlutaMAX(100x) </td><td> Gibco </td><td> 3505-061 </td><td></td></tr><tr><td> Ficoll-Paque </td><td> GE 헬스 케어 Biosciences </td><td> 17-1440-02 </td><td></td></tr><tr><td> 재조합 인간 IL-21 </td><td> PeproTech </td><td> AF-200-21 </td><td></td></tr><tr><td> 재조합 인간 IL-2 (Proleukin) </td><td> 노바티스 </td><td> NDC 65483-116-07 </td><td></td></tr><tr><td> 인간 T 세포 키트 (Nucleofector 솔루션) </td><td> Lonza </td><td> VPA-1002 </td><td></td></tr><tr><td> CliniMACS CD56 시약 </td><td> Miltenyi </td><td> 70,206 </td><td></td></tr><tr><td> 인간의 3 번 CD에 마우스적인 mAb 특정에 FITC-복합 </td><td> BD Biosciences </td><td> 349201 </td><td></td></tr><tr><td> 인간 CD4에 대한 마우스적인 mAb의 특정에 APC-복합 </td><td> BD Biosciences </td><td> 340443 </td><td></td></tr><tr><td> PerCPCy5.5 - 복합인간의 CD8에 마우스적인 mAb 특정에 </td><td> BD Biosciences </td><td> 341051 </td><td></td></tr><tr><td> F (AB &#39;) 인간에 대한 구체적인 염소 항체 2 조각으로 PE-복합 Fcγ </td><td> Invitrogen </td><td> H10104 </td><td></td></tr><tr><td> 나트륨 Azide </td><td> 시그마 </td><td> S2002 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Disposables </td></tr><tr><td> 12 잘 판 </td><td> 코닝 </td><td> 3513 </td><td></td></tr><tr><td> T-75cm 2 플라스크 </td><td> 코닝 </td><td> 430641 </td><td></td></tr><tr><td> 문화 가방 </td><td> VUE 생활 </td><td> 290C, 750C </td><td></td></tr><tr><td> 50 ML의 원심 분리기 튜브 </td><td> BD Biosciences </td><td> 352098 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><strong&gt; 장비 </td></tr><tr><td> Amaxa Nuceleofector II </td><td> Lonza </td><td> AAB-1001 </td><td></td></tr><tr><td> Cellometer </td><td> Bioscience Nexcelom </td><td> Cellometer 비전 </td><td></td></tr><tr><td> Sorvall 전설 RT 원심 분리기 </td><td> Sorvall </td><td> 75004377 </td><td></td></tr><tr><td> BD FACS Calibur </td><td> BD Biosciences </td><td> 342975 </td><td></td></tr><tr><td> 제어 속도 냉동기 </td><td> 대패질하는 사람 </td><td> Kryo 750 </td><td></td></tr><tr><td> Irradiator </td><td> CIS 바이오 국제 </td><td> IBL-437 C # 09433 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> 분자의 표현 (내생 및 소개) </td></tr><tr><td> 셀 라인 </td> &lt;TD&gt; 일반 명 </td><td> 셀 유형 </td><td> 분자 표현 </td></tr><tr><td> CJKT64.86.41BBL.GFP - IL15.CD19 </td><td> 복제 사 </td><td> K562 </td><td> CD86, CD64, CD137L, CD19, GFP 막과 공동 표현은 IL-15을 행 </td></tr></tbody></table> 전체 문화 미디어 (CCM) (최대 30 일까지에 대해 4 ° C에 저장) HyQ RPMI-1640/Phenol-free RPMI-1640 10% FBS 1퍼센트 GlutaMAX 유동 세포 계측법 버퍼 (최대 30 일까지에 대해 4 ° C에 저장) PBS 2퍼센트 FBS 0.1 % 나트륨 Azide </td></tr></tbody></table>

clinical application of sleeping beauty and artificial antigen presenting cells to genetically modify t cells from peripheral and umbilical cord blood

임상 급 T 세포의 효력은 종양 - 관련 항원의 탁월한은 (i) 인식 (TAAs), 주입 후 (II) 끈기 (III)의 가능성이있는 생물학적 제품을 처리하기 위해 immunotherapy과 유전자 치료를 조합하여 향상시킬 수 있습니다 종양이 사이트 마이그레이션 및 종양 microenvironment 내에서 효과기 기능을 재활용 (IV) 능력에 대한 잠재적. 인간 응용 프로그램에 대한 설계 T 세포의 유전자 조작에 가장 접근은 차량 1-3의 안정 표현 레트로 바이러스와 lentivirus를 사용했습니다. 이 생산 시설의 제한된 수의에서 임상 수준의 재조합 바이러스의 제조 및 출시에 의존으로이 방법은,하지만 현재 좋은 제조 관행 (GMP)을 준수은 비용이 많이들 수있다. DNA의 종 10분의 1 일 recombin의 비용 약의 임상 학년으로 생성 될 수 있기 때문에 nonviral plasmids의 전자 전송은 전달에 대한 매력적인 대안입니다개미 GMP 수준의 바이러스. 우리가 인간의 응용 4-8에 뷰티 (SB) transposon과 transposase 잠자는 숲속의 적응 통합의 효율성을 향상시킬 수 있도록 지원합니다. 우리 SB 시스템은 관심의 유전자 (CD19RCD28 지정 예 2 차 생성 CD19 특정 자동차 transgene)와 TA의 다이 뉴클레오타이드에 transgene이 9-11를 반복 삽입 transposase (예 : SB11)에 대한 코딩 transposon로 구성이 DNA의 plasmids를 사용 . 우리가 TAA (예 : CD19)뿐만 아니라 T 세포 costimulatory 분자 CD86, CD137L을 표현하도록 수정 K562-파생 인공 항원 제시 세포를 (aAPC) (클론 # 4)을 사용하여 유전자 변형 T 세포의 임상 - 충분한 숫자를 생성하려면 단클론 항체의로드에 대한 인터루킨 (IL) -15 (펩타이드는 수정 IgG4 FC 영역에 융합) 및 CD64 (FC-γ 수용체 1) 막 바인딩 된 버전 (적인 mAb) 12. 이 보고서에서, 우리는 complia에서 수행 할 수있는 절차를 설명과 nce CD19 별 CAR + 인간 응용 프로그램에 적합한 T 세포를 생성 할 수 cGMP. 이것은 γ-방사능 aAPC의 모든 - 7 일 추가 (자극을주기)에 의해 안정 integrants의 검색에 이어 두 DNA의 plasmids, SB transposon (CD19RCD28)와 SB transposase (SB11)의 전자 전달 동기에 의해 달성되었다 (클론 # 4) 수용성 재조합 인간 IL-2 및 IL-21 13의 존재 인치 일반적으로 4 사이클 (연속 문화 28 일)이 안정적으로 차를 표현 T 세포의 임상 - 매력적인 번호를 생성하기 위해 수행됩니다. 제조 임상 급 CD19 특정 T 세포에이 방법론은 말초 혈 (PB) 또는 탯줄 혈액 (UCB)에서 파생 된 T 세포에 적용 할 수 있습니다. 또한이 접근 방식은 aAPC에서 자동차로 인정 TAA, 표현과 소개 자동차의 특이성을 페어링하여 다양한 종양 유형에 대한 T 세포를 생성 할 무력화 할 수 있습니다.

우리는 DNA의 plasmids과 γ-방사능 aAPC에서 T 세포의 전파 전자 송금이 인간 응용 프로그램 PB와 UCB에서 파생 된 T 세포의 임상 - 매력적인 번호를 생성하기 위해 사용될 수 있다는보고합니다. 이러한 유전자 변형 T 세포는 주요 histocompatibility 복합 독립적 인 TAA CD19을 인식 도입 차를 표현한다. SB-파생 DNA의 plasmids은 CD28와 3 번 CD-ε 14 신호, 그리고하는 것은 (II) transposase, SB11 15가 이전에 13 설명되어있는은 (i) transposon, 2 차 생성 CAR (CD19RCD28), 16,17를 표현하는 . 현재 연구에서 사용 된 plasmids은 Waisman 임상 Biomanufacturing 시설 (매디슨, WI)에 의해 상업적으로 생산되었다. K562 세포 (미국 유형 문화 컬렉션에서 얻은 부모의 선), 공동 명시 원하는 T 세포 공동 stimulatory 분자 (aAPC의 세포 표면 3 90% 각 도입 분자)에서 파생 aAPC (클론 # 4),로 이전 12 설명했다. 여기 CD19 특정 T 세포는 PB 나 UCB 숫자 자동차에 의존 방식으로 T 세포를 (그림 1 확대 aAPC의 추가 다음 차를 소개 SB의 전위를 사용하여에서 파생 mononuclear 세포 (MNC)에서 생성 될 수 있다고 보여 4) 13,18. 열 큐벳 (2x10 7 MNC / 큐벳)이 transposon (CAR)에 대한 코딩 플라스미드 DNA의 15 μg (CD19RCD28/pSBSO)와 transposase (SB11)에 대한 코딩 플라스미드 DNA의 5 μg (pCMV-SB11)를 사용하여 각받는 사람에 대한 electroporated 있습니다. MNC는 제한하거나 실험실 작업에 다시 크기를 조정하는 경우 큐벳의 수는 감소 될 수있다. electroporation의 날은 자극주기 # 1의 &quot;주 0&quot;로 정의됩니다. 유동 세포 계측법과 문화 조건에 대한 컨트롤로, autologous T 세포는 가짜 electroporated합니다 (DNA 플라스미드 제외) 숫자 상호 링크에는 3 번 CD에 T 세포를 유지하기 위해 OKT3가 미리로드 된 γ-방사능 aAPC (클론 # 4)에 확대 확산. 우리 연구outinely electrotransfer와 일 electroporation 후 T 세포 (그림 2B)의 생존 능력의 효율성을 평가. 초기 시점에서 제어 DNA 플라스미드 (pmaxGFP 지정) 및 차에서 EGFP의 표현은 통합 episomal 플라스미드의 단백질 표현을 반영합니다. 일반적으로, 일 electroporation은 우리가 40-50% 사이의 T 세포 생존 능력과 ~ 40 % (그림 2A)에서 ~ 60 %와 CAR 표현에서 EGFP 발현을 측정합니다. 수용성 재조합 인간 IL-2 및 IL-21의 존재에 γ-방사능 aAPC의 재귀 추가는 안정적으로 차 (CD19RCD28)를 표현하는 T 세포를 검색합니다. 3 번 CD 제외 CD56 + NK 세포는 이러한 NK 세포의 비율이 T 세포에 표현 CAR의 비율이 낮은 경우 특히 ≥ 10 %와 경우 CD56 별 상자성체의 비즈를 사용하여 문화의 고갈됩니다. 이 고갈은 proliferatio을 유지하기 위해 aAPC의 능력을 방해 NK 세포의 급속한 전면에 자라 난을 방지자동차의 N + T 세포. 상황에서 CAR + T 세포에서 NK 세포의 고갈은 지난 2 자극을주기 동안 수행하지만,이 일부 CAR + T 세포에서 CD56의 공동 표현으로 인해 원하는 세포의 손실을 소개하고 있습니다. T 세포는 하루에 14 지난 Vue는 생활 문화 봉투를 사용하여 기능적으로 닫힌 체계에서 재배되었다. 유전자 변형 및 전파 T 세포의 일부는 일반적으로 미래의 분석에 대한 보관 자료의 원천 역할을하고 할 aAPC의 공동 문화의 날 14 일 21 일 (자극주기의 끝 # 2 또는 # 3)에 cryopreserved 아르 예상치 못한 문제가 이후 제조 과정에서 발생하는 경우 해동. T 세포는 일반적으로 (그림 3)에 나 문화의 날 28 수확됩니다 정기적으로 명시&gt; 90 % CAR이며&gt; 80% 가능한 (그림 2C, D). 우리는 이전에 aAPC의 공동 문화 4 주 후 3 번 CD의 평균 접이식 확장 + T 세포는 19,800입니다 것으로 나타났습니다 ± CA로 11,313을<html> R + 표현의 90 %되는 ± 7.5 13. 이 T 세포는 cryopreserved와의 프로세스와 안전 및 제조 제품의 치료 가능성에 알려 릴리스 테스트를 받아야 있습니다. 릴리스 테스트는 사전 임상 실험에 수신자로 주입으로 분석 증명서를 생성하는 임상 실험실 개선 개정 (CLIA)을 준수 실시됩니다. <img alt="그림 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50070/50070fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50070/50070fig1.jpg" /> 그림 1. CAR + PB와 UCB에서 T 세포를 electroporate하고 전달하는 과정을 요약 단계. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50070/50070fig1large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . upload/50070/50070fig2highres.jpg &quot;SRC =&quot;/ files/ftp_upload/50070/50070fig2.jpg &quot;/&gt; 그림 2. PB에서 유전자 변형 T 세포의 특성화. 유전자 전달의 효율성을 평가하는 첫번째 자극주기의 날 0시 EGFP의 (A) 표현. CD19 별 CAR의 표현 (CD19RCD28가)와 같은 +, CD8 +와 CD4 + electroporation 후 (B) 약 24 시간과 (C) 28일 aAPC의 공동 문화 이후의 T 세포에는 3 번 CD에 유동 세포 계측법에 의해 평가합니다. 차에서 비슷한 표현은 UCB-파생 T 세포로 관찰되었다. (D) 자동차 표현의 동력학이 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50070/50070fig2large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 3" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50070/50070fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50070/50070fig3.jpg" /> 그림 3. PB-파생 차의 전파3 번 CD +와 CAR + 재조합 인간 IL-2 용해와 IL-21의 존재에 γ-방사능 aAPC에 반복 공동 문화 PB에서 파생 된 T 세포의 숫자 확장 + T 세포. 평가. 위쪽 화살표는 각 자극주기의 시작을 표​​시하는 γ-방사능 aAPC의 추가를 나타냅니다. UCB-파생 CAR + T 세포는 숫자 확장과 비슷한 속도를냅니다. <img alt="그림 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50070/50070fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50070/50070fig4.jpg" /> 4 그림. 유전자 자동차를 수정하고 전파하는 SB와 aAPC 시스템을 사용하여 제조 공정의 개략도는 + PB와 UCB에서 파생 된 T 세포. CD19 별 CAR + T 세포는 SB-파생 supercoiled DNA의 plasmids과 공동 문화 이후의 전자 전송에 의해 생성 된 존재하는 O에서 K562-파생 aAPC (클론 # 4)에F 재조합 인간 가용성 IL-2 및 IL-21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50070/50070fig4large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <table border="1"><tbody><tr><td width="5"> T 세포 소스 </td><td width="9"> Transposon * </td><td width="9"> Transposase </td><td width="26"> T 세포 주입 </td><td width="1"> IRB # </td><td width="1"> NIH-OBA # </td><td width="1"> IND # </td></tr><tr><td> Autologous (환자 파생) ** </td><td> CD19RCD28 </td><td> SB11 </td><td> autologous 조혈 줄기 세포 이식 후 </td><td> 2007-0635 </td><td> 0804-922 </td><td> 14,193 </td></tr><tr><td> Allogeneic (기증자 - 파생) </td><td> CD19RCD28 </td><td> SB11 </td><td> allogeneic 조혈 줄기 세포 이식 후 </td><td> 2009-0525 </td><td> 0910-1003 </td><tD&gt; 14,577 </td></tr><tr><td> Allogeneic (기증자 - 파생) </td><td> CD19RCD28 </td><td> SB11 </td><td> allogeneic 탯줄 혈액 이식 후 </td><td> 2010-0835 </td><td> 1001년에서 1022년까지 </td><td> 14,739 </td></tr></tbody></table> * 표 1. MDACC에서 FDA의 후원하에 임상 시험은 CD19 특정 차를 불러 일으킬 수 + T 세포는 aAPC에 전파. T 세포는 SB transposon이 2 차 생성 CAR에 대한 코딩 집행 표현, 지정 CD19RCD28, 그 CD28과 3 번 CD-ε을 통해 신호를 통해 ​​CD19에 대한 특정 표시됩니다. ** 체험은 인용 발명 5에 설명되어 있습니다.

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Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

CD19 별 키메라 항원 수용체 (자동차)를 표현하는 T 세포는 우리의 첫번째 인 인간 유전자 치료 시험에서 B-세포 malignancies의 investigational 치료로 주입됩니다. 우리는을 사용하여 T 세포의 유전자 변형을 설명<em&gt; 잠자는 숲속의 미녀</em디자이너 CD19 + 인공 항원 제시 세포에 CD19 별 자동차 및 선택적 전파를 소개하는&gt; (SB) 시스템.

임상 신청<em&gt; 잠자는 숲속의 미녀</em유전자 주변과 배꼽 탯줄 혈액에서 T 세포를 수정하는 셀을 제시&gt;과 인공 항원

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

clinical-application-sleeping-beauty-artificial-antigen-presenting

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

18.2K 조회수.  U.T. MD Anderson Cancer Center. CD19 별 키메라 항원 수용체 (자동차)를 표현하는 T 세포는 우리의 첫번째 인 인간 유전자 치료 시험에서 B-세포 malignancies의 investigational 치료로 주입됩니다. 우리는을 사용하여 T 세포의 유전자 변형을 설명 잠자는 숲속의 미녀 (SB) 시스템.

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HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals may exhibit suppressive immune microenvironment and, in contrast to activating CTL, their autologous antigen presenting cells may tend to tolerize or anergize antigen specific CTL. As a result, although still in the experimental phase, CTL-based adoptive immunotherapy has evolved to become a promising treatment for various diseases such as cancer and virus infections. In initial experiments ex vivo expanded CMV (cytomegalovirus) specific CTL have been used for treatment of CMV infection in immunocompromised allogeneic bone marrow transplant patients. While it is common to have life-threatening CMV viremia in these patients, none of the patients receiving expanded CTL develop CMV related illness, implying the anti-CMV immunity is established by the adoptively transferred CTL1. Promising results have also been observed for melanoma and may be extended to other types of cancer2. 
While there are many ways to ex vivo stimulate and expand human CTL, current approaches are restricted by the cost and technical limitations. For example, the current gold standard is based on the use of autologous DC. This requires each patient to donate a significant number of leukocytes and is also very expensive and laborious. Moreover, detailed in vitro characterization of DC expanded CTL has revealed that these have only suboptimal effector function 3. 
Here we present a highly efficient aAPC based system for ex vivo expansion of human CMV specific CTL for adoptive immunotherapy (Figure 1). The aAPC were made by coupling cell sized magnetic beads with human HLA-A2-Ig dimer and anti-CD28mAb4. Once aAPC are made, they can be loaded with various peptides of interest, and remain functional for months. In this report, aAPC were loaded with a dominant peptide from CMV, pp65 (NLVPMVATV). After culturing purified human CD8+ CTL from a healthy donor with aAPC for one week, CMV specific CTL can be increased dramatically in specificity up to 98% (Figure 2) and amplified more than 10,000 fold. If more CMV-specific CTL are required, further expansion can be easily achieved by repetitive stimulation with aAPC. Phenotypic and functional characterization shows these expanded cells have an effector-memory phenotype and make significant amounts of both TNF&alpha; and IFN&gamma; (Figure 3).

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

A new DC independent method for induction and expansion of antigen-specific T cells is described. HLA A2-Ig based artificial Antigen Presenting Cells (aAPC) are loaded with HLA-A2 restricted peptides to efficiently expand CTL of diverse antigen specificity. This technology holds great potential for CTL-based adoptive immunotherapy.

효율에 대한 HLA - IG 기반 인공 항원 제시 세포 예 생체내</em인간 CTL의> 확장

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals ...

연구

면역학 및 감염병학

Expansion of Human Peripheral Blood  &gamma;&delta; T Cells using Zoledronate

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and anti-infective activity.1 The majority of &gamma;&delta; T cells in peripheral blood have the V&gamma;9V&delta;2 T cell receptor. These cells recognize antigen in a major histocompatibility complex-independent manner and develop strong cytolytic and Th1-like effector functions.1Therefore, &gamma;&delta; T cells are attractive candidate effector cells for cancer immunotherapy. V&gamma;9V&#x03B4;2 T cells respond to phosphoantigens such as (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate (HMBPP), which is synthesized in bacteria via isoprenoid biosynthesis;2 and isopentenyl pyrophosphate (IPP), which is produced in eukaryotic cells through the mevalonate pathway.3 In physiological condition, the generation of IPP in nontransformed cell is not sufficient for the activation of &gamma;&delta; T cells. Dysregulation of mevalonate pathway in tumor cells leads to accumulation of IPP and &gamma;&delta; T cells activation.3 Because aminobisphosphonates (such as pamidronate or zoledronate) inhibit farnesyl pyrophosphate synthase (FPPS), the enzyme acting downstream of IPP in the mevalonate pathway, intracellular levels of IPP and sensitibity to &gamma;&delta; T cells recognition can be therapeutically increased by aminobisphosphonates. IPP accumulation is less efficient in nontransfomred cells than tumor cells with a pharmacologically relevant concentration of aminobisphosphonates, that allow us immunotherapy for cancer by activating &gamma;&delta; T cells with aminobisphosphonates. 4 Interestingly, IPP accumulates in monocytes when PBMC are treated with aminobisphosphonates, because of efficient drug uptake by these cells. 5 Monocytes that accumulate IPP become antigen-presenting cells and stimulate V&gamma;9V&delta;2 T cells in the peripheral blood.6 Based on these mechanisms, we developed a technique for large-scale expansion of &gamma;&delta; T cell cultures using zoledronate and interleukin-2 (IL-2).7 Other methods for expansion of &gamma;&delta; T cells utilize the synthetic phosphoantigens bromohydrin pyrophosphate (BrHPP)8 or 2-methyl-3-butenyl-1-pyrophosphate (2M3B1PP).9 All of these methods allow ex vivo expansion, resulting in large numbers of &gamma;&delta; T cells for use in adoptive immunotherapy. However, only zoledronate is an FDA-approved commercially available reagent. Zoledronate-expanded &gamma;&delta; T cells display CD27-CD45RA- effector memory phenotype and thier function can be evaluated by IFN-&gamma; production assay. 7

Expansion of Human Peripheral Blood  &amp;#947;&amp;#948; T Cells using Zoledronate

A method to expand &gamma;&delta; T cells from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) is described. PBMC-derived &gamma;&delta; T cells are stimulated and expanded using zoledronate and interleukin-2 (IL-2). Large scale expansion of &gamma;&delta; T cells can be applied to autologous cellular immunotherapy of cancer.

Zoledronate를 사용하는 사람 말초혈의 확장 γδ T 세포

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and ...

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where the CB does not contain appreciable numbers of virus-experienced T cells which can protect the recipient from infection.1-4 We and others have shown that virus-specific CTL generated from seropositive donors and infused to the recipient are safe and protective.5-8 However, until recently, virus-specific T cells could not be generated from cord blood, likely due to the absence of virus-specific memory T cells. 
In an effort to better mimic the in vivo priming conditions of na&iuml;ve T cells, we established a method that used CB-derived dendritic cells (DC) transduced with an adenoviral vector (Ad5f35pp65) containing the immunodominant CMV antigen pp65, hence driving T cell specificity towards CMV and adenovirus.9 At initiation, we use these matured DCs as well as CB-derived T cells in the presence of the cytokines IL-7, IL-12, and IL-15.10 At the second stimulation we used EBV-transformed B cells, or EBV-LCL, which express both latent and lytic EBV antigens. Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL are used to stimulate the T cells in the presence of IL-15 at the second stimulation. Subsequent stimulations use Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL and IL-2. 
From 50x106 CB mononuclear cells we are able to generate upwards of 150 x 106 virus-specific T cells that lyse antigen-pulsed targets and release cytokines in response to antigenic stimulation.11 These cells were manufactured in a GMP-compliant manner using only the 20% fraction of a fractionated cord blood unit and have been translated for clinical use.

Here we describe the first good manufacturing practice (GMP)-compliant method of producing virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) from umbilical cord blood, a source of predominantly na&#238;ve T cells.

탯줄 혈액에서 세포 독성 T 림프구 확장이 대상 사이토 메갈로 바이러스, 엡스타인 - 바 바이러스, 그리고 아데노 바이러스

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike classical T cells, NKT cells recognize lipid antigen in the context of CD1 molecules2. NKT cells express an invariant TCR&alpha; chain rearrangement: V&alpha;14J&alpha;18 in mice and V&alpha;24J&alpha;18 in humans, which is associated with V&beta; chains of limited diversity3-6, and are referred to as canonical or invariant NKT (iNKT) cells. Similar to conventional T cells, NKT cells develop from CD4-CD8- thymic precursor T cells following the appropriate signaling by CD1d 7. The potential to utilize NKT cells for therapeutic purposes has significantly increased with the ability to stimulate and expand human NKT cells with &alpha;-Galactosylceramide (&alpha;-GalCer) and a variety of cytokines8. Importantly, these cells retained their original phenotype, secreted cytokines, and displayed cytotoxic function against tumor cell lines. Thus, ex vivo expanded NKT cells remain functional and can be used for adoptive immunotherapy. However, NKT cell based-immunotherapy has been limited by the use of autologous antigen presenting cells and the quantity and quality of these stimulator cells can vary substantially. Monocyte-derived DC from cancer patients have been reported to express reduced levels of costimulatory molecules and produce less inflammatory cytokines9,10. In fact, murine DC rather than autologous APC have been used to test the function of NKT cells from CML patients11. However, this system can only be used for in vitro testing since NKT cells cannot be expanded by murine DC and then used for adoptive immunotherapy. Thus, a standardized system that relies on artificial Antigen Presenting Cells (aAPC) could produce the stimulating effects of DC without the pitfalls of allo- or xenogeneic cells12, 13. Herein, we describe a method for generating CD1d-based aAPC. Since the engagement of the T cell receptor (TCR) by CD1d-antigen complexes is a fundamental requirement of NKT cell activation, antigen: CD1d-Ig complexes provide a reliable method to isolate, activate, and expand effector NKT cell populations.

Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Here we describe a method for activating and expanding human NKT cells from bulk T cell populations using artificial antigen presenting cells (aAPC). The use of CD1d-based aAPC provides a standardized method for generating high numbers of functional NKT cells.

인공 항원은 세포 (aAPC) 중재의 활성화와 자연 킬러 T 세포의 확장을 제시

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike ...

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for isolating precursor B-cells at four different stages of differentiation. Because genes are expressed and epigenetic modifications occur in a tissue specific manner, it is vital to discriminate between tissues and cell types in order to be able to identify alterations in the genome and the epigenome that may lead to the development of disease. This method can be adapted to any type of cell present in umbilical cord blood at any stage of differentiation.	
This method comprises 4 main steps. First, mononuclear cells are separated by density centrifugation. Second, B-cells are enriched using biotin conjugated antibodies that recognize and remove non B-cells from the mononuclear cells. Third the B-cells are fluorescently labeled with cell surface protein antibodies specific to individual stages of B-cell development. Finally, the fluorescently labeled cells are sorted and individual populations are recovered. The recovered cells are of sufficient quantity and quality to be utilized in downstream nucleic acid assays.

Here we describe a protocol for isolating subsets of precursor B-cells from umbilical cord blood. A sufficient quantity and quality of nucleic acids may be extracted from the cells and used in subsequent assays utilizing DNA or RNA.

탯줄 혈액에서 전구체 B-세포 하위 집합의 절연

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied by adverse side effects such as a reduced ability to control infections or malignancies. Therefore, new approaches need to be developed that target only the disease mediating cells and leave the remaining immune system intact. Over the past decade a variety of cell based immunotherapy strategies to modulate T cell mediated immune responses have been developed. Most of these approaches rely on tolerance-inducing antigen presenting cells (APC). However, in addition to being technically difficult and cumbersome, such cell-based approaches are highly sensitive to cytotoxic T cell responses, which limits their therapeutic capacity. Here we present a protocol for the generation of non-cellular killer artificial antigen presenting cells (KaAPC), which allows for the depletion of pathologic T cells while leaving the remaining immune system untouched and functional. KaAPC is an alternative solution to cellular immunotherapy which has potential for treating autoimmune diseases and allograft rejections by regulating undesirable T cell responses in an antigen specific fashion.

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Guidelines are presented for the generation of killer artificial antigen presenting cells, KaAPC, an efficient tool for in vitro depletion of human antigen-specific T cells and an alternative solution to cellular immunotherapy for the treatment of T cell-mediated autoimmune diseases in an antigen-specific fashion without compromising the remaining immune system.

효율적인위한 킬러 인공 항원 제시 세포 (KaAPC)<em&gt; 체외</em&gt; 인간의 항원 특이 T 세포의 고갈

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.

This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.

말초 혈액에서 인간 Alloantigen 특정 T 세포의 생성

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological mechanisms involved during the disease is the T cell transfer model of colitis. In this model, immunodeficient mice (RAG-/- recipients) are reconstituted with naive CD4+ T cells from healthy wild type hosts.
This model allows examination of the earliest immunological events leading to disease and chronic inflammation, when the gut inflammation perpetuates but does not depend on a defined antigen. To study the potential role of antigen presenting cells (APCs) in the disease process, it is helpful to have an antigen-driven disease model, in which a defined commensal-derived antigen leads to colitis. An antigen driven-colitis model has hence been developed. In this model OT-II CD4+ T cells, that can recognize only specific epitopes in the OVA protein, are transferred into RAG-/- hosts challenged with CFP-OVA-expressing E. coli. This model allows the examination of interactions between APCs and T cells in the lamina propria.

In this antigen-driven colitis model, OT-II CD4+ T cells expressing a red fluorescent protein were adoptively transferred into RAG-/- mice that express a green fluorescent protein in mononuclear phagocytes (MPs). The hosts were challenged with Escherichia coli (E.coli) expressing the ovalbumin protein (OVA) fused to a cyan fluorescent protein (CFP).

항원 중심의 성 대장염 모델의 개발은 항원이 T 세포에 세포를 제시하여 항원의 프리젠 테이션을 공부하기

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological ...

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

Platelet production occurs principally in the bone marrow in a process known as thrombopoiesis. During thrombopoiesis, hematopoietic progenitor cells differentiate to form platelet precursors called megakaryocytes, which terminally differentiate to release platelets from long cytoplasmic processes termed proplatelets. Megakaryocytes are rare cells confined to the bone marrow and are therefore difficult to harvest in sufficient numbers for laboratory use. Efficient production of human megakaryocytes can be achieved in vitro by culturing CD34+ cells under suitable conditions. The protocol detailed here describes isolation of CD34+ cells by magnetic cell sorting from umbilical cord blood samples. The necessary steps to produce highly pure, mature megakaryocytes under serum-free conditions are described. Details of phenotypic analysis of megakaryocyte differentiation and determination of proplatelet formation and platelet production are also provided. Effectors that influence megakaryocyte differentiation and/or proplatelet formation, such as anti-platelet antibodies or thrombopoietin mimetics, can be added to cultured cells to examine biological function.

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

A highly pure population of megakaryocytes can be obtained from cord blood-derived CD34+ cells. A method for CD34+ cell isolation and megakaryocyte differentiation is described here.

Megakaryocyte 차별화와 인간에서 혈소판 형성 코드 혈액 파생 CD34+ 세포

Platelet production occurs principally in the bone marrow in a process known as thrombopoiesis. During thrombopoiesis, hematopoietic progenitor cells ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the antibody needs to distinguish between highly related structures (e.g., a normal protein and a mutated version thereof). The current way of generating such discriminative mAbs involves extensive screening of multiple Ab-producing B cells, which is both costly and time consuming. We propose here a rapid and cost-effective method for the generation of discriminative, fully human mAbs starting from human blood circulating B lymphocytes. The originality of this strategy is due to the selection of specific antigen binding B cells combined with the counter-selection of all other cells, using readily available Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC). Once specific B cells are isolated, cDNA (complementary deoxyribonucleic acid) sequences coding for the corresponding mAb are obtained using single cell Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) technology and subsequently expressed in human cells. Within as little as 1 month, it is possible to produce milligrams of highly discriminative human mAbs directed against virtually any desired antigen naturally detected by the B cell repertoire.

We describe a method for the production of human antibodies specific for an antigen of interest, starting from rare B cells circulating in human blood. Generation of these natural antibodies is efficient and rapid, and the antibodies obtained can discriminate between highly related antigens.

희귀 한 항 원 특정 B 세포 혈액 순환에서 구별 인간 단일 클론 항 체의 생성

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...