This work was supported in part by grants from the National Multiple Sclerosis Society (RG 5001-A-3 to S.J.C.), the National Institutes of Health (NS065808 to E.R.B.; NS078392 to S.J.C.), start-up funds from the UConn Health Center (to SJC) and the Kim Family Fund (UCHC in support of K.I.C.).

동물을 포함한 모든 절차는 동물 애호 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 정책에 따라 수행 된 실험 동물 복지 사무소 (NIH)에 의해 만 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인과 규정 코네티컷 보건 센터. 혼합 폐해 문화의 1 준비 <ol><li> 사용하기 전에 모든기구를 소독. 차가운 유지하기 위해 얼음에 유지 세 멸균 60mm 배양 접시에 (MG 2 + 또는 칼슘을 2 +)에는 양이온을 포함하지 않는 얼음처럼 차가운 무균 행크의 균형 소금 용액 (HBSS) 3 ㎖를 추가합니다. </li><li> 이전 17, 18 설명한 바와 같이, 산후 P0-P2 마우스 새끼의 피질을 분리합니다. 참고 : 같은 해마와 같은 피질 하 구조는, 이러한 문화에 포함되지 않습니다. </li><li> NE를 사용하여 조심스럽게 수막을 제거하고 신선한 HBSS에 고립 피질을 전송하고 효소 조직을 떼어 놓다제조 업체의 프로토콜에 따라 우랄 조직 해부 키트. </li><li> 플레이트 멸균 T-175 플라스크에 세포와 미디어에 밤새 품어 [둘 베코 변형 이글 배지 1X 페니실린 / 스트렙토 마이신이 포함 된 10 % 소 태아 혈청 (DMEM) (FBS)]. </li><li> 신선한 미디어 다음 일 모든 미디어를 교체합니다. 약 3 주 동안 또는 세포 단층이 설정 될 때까지, 일반 미디어 변화, 문화를 배양하기 위해 계속합니다. 주 : 1 비율 19 :이 단층은 약 10 성상 세포 및 미세 아교 세포로 구성됩니다. </li></ol> 혼합 폐해 문화에서 2 Globoid 세포 유도 <ol><li> ECM 코팅 된 커버를 준비합니다. <ol><li> 30 분 동안 멸균 페트리 접시에 멸균 한 N 염산 (HCL) 원형 커버 슬립 (95 %)을 적 십니다. 멸균 수의 3 배에 커버 슬립을 세척 한 후 적어도 20 분 동안 95 %의 EtOH에 흡수. 다음 자연 건조를 할 수 있습니다. </li><li> 희석 세포 MATR 장소 방울파라 필름의 시트 상 IX (ECM) 단백질 도료 (ML 멸균 인산 완충 용액에 용해 라미닌 10 μg / 예 : 150-250 μL / 액적 [PBS]). 이 물방울에 배치 할 때 커버 슬립 터치 없기 때문 방울을 배포합니다. 조심스럽게 집게를 사용하여 물방울에 건조 된 각 coverslip에 배치합니다. </li><li> 약에 대한 방울에 커버 슬립을 둡니다. 새시와 문화 후드 내부에 4 ~ 6 시​​간 마감했다. </li><li> 24 - 웰 플레이트의 각 웰에 ECM - 코팅 된 커버 (ECM 코팅 사이드)를 놓는다. 멸균 PBS 배와 잘 각을 세척하고 필요할 때까지 4 ° C에 보관하십시오. </li></ol></li><li> Coverslips는에 도금에 대한 폐해 세포를 준비합니다. <ol><li> 아교 문화에서 매체를 대기음 부드럽게 멸균 PBS의 10 ml의 폐해 단층 배를 씻는다. 다음으로, T-175에 8 ~ 10 ㎖의 트립신-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션을 추가하고, 37 ° C에서 5 ~ 10 분 동안 배양한다. </li><li> 단일 층의 대부분이 분리 된 경우, 완전한 미디어 (20)를 가하여플라스크에 트립신을 중지합니다. 50ml의 원뿔형 튜브에 분리 된 세포를 포함하는 매체를 수집하고, 실온에서 300 XG에서 10 분 동안 스핀. </li><li> 부드럽게 P1000 피펫을 사용하여 용액을 피펫 팅하여 신선한 완전한 미디어 2 ㎖에 세포를 다시 일시 중지 한 후 펠렛을 방해하지 않고 상등액을 흡인하고. </li><li> 원하는 밀도 (예를 들면 105 세포 / ㎖)에 완전 배지에서 세포를 일시 중지 한 후 다시 혈구를 사용하여 세포의 수를 결정하고. ECM - 코팅 된 커버 (24 웰 플레이트의 각 웰에 500 ㎕의 예) 위에 세포 플레이트. 37 ° C에서 배양의 각 웰 3-5 일 추가 신선한 전체 미디어를 추가하거나 세포가 원하는 시각적 합류로 성장할 때까지. </li></ol></li><li> Psychosine로 처리. <ol><li> 주식 농도 디메틸 설폭 사이드에서 (108.3 밀리미터) (DMSO)에 psychosine를 복원합니다. 작업 주식을 만들기 위해 100 %의 EtOH이 주식을 희석하는 수n은 10 μM의 최종 농도를 달성하기 위하여 24 웰 플레이트의 각 웰에 첨가한다. </li><li> psychosine를 추가하는 때, 부드럽게 문화 미디어에 psychosine을 혼합 배양 플레이트 소용돌이 친다. 일주에 10 μM 다른 모든 일의 상당을 추가하여 psychosine 보충. </li></ol></li><li> psychosine 치료 7 일 후, 미디어와 각 웰에 차가운 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)의 피펫 500 μl를 수집합니다. 20 분 세포를 해결하기 위해 상온에서 품어. 그런 다음, PBS로 각 웰 배를 씻어 (아래 참조) 면역 세포 화학 처리 될 때까지 4 ° C에서 접시를 유지합니다. 주 : 필요한 경우 세포 배양액이 시점에서 효소 또는 ELISA 분석을 위해 수집 될 수있다. </li></ol> 3 면역 세포 화학 (ICC)는 Globoid 세포를 시각화 <ol><li> 버퍼 [PBS + 0.3 % 트윈 20 + 5 % 정상 염소 혈청 (NGS)] 차단에 PBS를 교체하고 실온에서 1 시간 동안 세포를 배양한다. </li><li> 에서년 Iba-1에 대해 차 항혈청에 고정 된 세포를 cubate [(1 : 1000) PBS에 희석 + 0.3 % + 2 % NGS-20 트윈] 실온에서 적어도 1 시간 동안, 그 다음 PBS 3X 5 분 간격으로 각을 잘 씻어 / 씻는다. </li><li> 핵을 식별 할 수 : 4 &#39;, 6 - diamidino-2 - 페닐 인돌 (1000 DAPI, 1)와 항체 라벨 및 카운터 얼룩 차를 식별 할 수있는 적절한 보조 형광 접합 된 항체를 추가합니다. 실온에서 1 시간 동안 차 항체 용액에 부화 PBS 3X 5 분간 씻어. </li><li> 설치 매체를 사용하여 슬라이드를 현미경 각 커버 글라스를 탑재합니다. 시각 및 정량 분석​​을위한 형광 현미경에서 볼 슬라이드. </li></ol> (4) 분석 및 차 문화 Globoid 세포의 특성 <ol><li> 문화 globoid 셀을 식별하기 위해 다음과 같은 세 가지 형태 학적 기준을 사용 <ol><li> , 미세 아교 세포 마커 면역 양성 라벨에 의해 이바-1 +를 형광 현미경을 사용하여 globoid 세포를 식별합니다. </li><li> 확인polynucleated (즉, 포함 된 두 개 이상의 DAPI 긍정적 인 핵)로 globoid 세포. </li><li> 미세 아교 세포를 휴식의 높은 지형 모양과 구별 둥근 형태로 globoid 세포를 식별합니다. NOTE : 세포 배양에서 이러한 유동 세포 계측법에 의해 세포 표면 마커 분석 및 정량을 위해 수집 될 수있다. </li></ol></li><li> 미세 아교 세포 및 globoid 세포의 탐식 활성을 측정 <ol><li> psychosine 처리 된 미세 아교 세포의 탐식 활성을 평가하기 위해, 제조업체의 지침에 따라 우물에 FITC 표지 라텍스 구슬을 추가합니다. 이전 PFA로 고정에 형광 - 복합 라텍스 구슬 48 시간을 추가합니다. (3 절에서 설명) 면역 세포 화학 (2.4 절에서 언급 한 바와 같이) 구슬로 처리 된 세포 및 프로세스를 수정합니다. </li><li> 그들은 형광 표지 된 비드 형광 발광 스펙트럼을 겹치지 않도록 형광 공역 이차 항체를 선택한다. </li><li> Analyz전자 해당 셀 식별하여 이바-1 + 미세 아교 세포의 phagocytotic 프로필 형광 표지 구슬 주식 - 지역화. 참고 : Psychosine는 미세 아교 세포를 활성화합니다. Phagocytosed 구슬이 문화 속에서 단핵 및 다핵 이바-1 + 세포 내에서 확인할 수 있습니다. </li></ol></li></ol> 정제 된 미세 아교 세포 배양에서 Globoid 세포의 (5) 유도 참고 : 성상 세포 및 미세 아교 세포 사이의 세포 간 신호를 해독하는 다른 방법이 체외 globoid 셀 모델의 또 다른 장점이다. 다음 단계 (5.2 절 참조)에 설명 된대로 replating 또는 공동 배양을위한 기본 미세 아교 세포의 정제, 문화에서 자신의 낮은 준수 속성에 의해 달성 될 수있다. <ol><li> 50 ML 원뿔 튜브에 합류 혼합 된 아교 문화 매체를 수집하고 배양기에서 37 ° C에서 그것을 유지한다. </li><li> 차 혼합 폐해 문화에서 미세 아교 격리입니다.<ol><li> 합류 혼합 신경교 배양 T175 플라스크에서 매체를 제거한 후, [+ 25 mM의 4 - (2 - 히드 록시 에틸) -1 - 피페 라진 에탄 술폰산 (HEPES) + 25 mM의 중탄산 나트륨 (시그마) 완전한 미디어 이루어지는] 따뜻한 흔들면서 용지를 추가한다. 100 회전 (37 ° C에서) 진탕 기에서 3 ~ 4 시간 동안 플라스크를 흔들어. 50 ML 원뿔 튜브에이 동요 플라스크에서 용지를 수집합니다. 참고 :이 미디어 플라스크에서 덜 부착 된 미세 아교 세포가 포함됩니다. </li><li> 실온에서 10 분 동안 300 XG에서 미디어 스핀. 성상 세포 에어컨 미디어 2 ㎖의 세포를 다시 일시 중지 한 후 뜨는을 대기음 (단계 5.1에서 수집). </li><li> 혈구를 사용하고 기판 코팅 된 커버 상에 미세 아교 세포를 플레이트 인수 세포의 수를 구축 면역 세포 화학 (2.1 절 참조), 또는 다른 종류의 세포와 공동 배양 globoid 세포의 미래를 수집 초저 준수의 웰 플레이트에 접시, 같은 희소 돌기 아교 세포로 (내림차순으로) 다음 섹션에서 ribed. 참고 : 일단 미세 아교 세포가 (2.3 절 참조) 전술 한 바와 같이 psychosine (10 μM)로 처리 할 수​​있다 도금. </li></ol></li><li> 세포 독성 분석을위한 기본 희소 돌기 아교 세포와 공동 배양. NOTE : 기본 희소 돌기 아교 세포의 배양, 또는 희소 돌기 아교 세포의 전구 세포 상에 후속 공동 배양 낮은 부착 판으로부터 psychosine 처리 된 미세 아교 세포의 컬렉션은 시험 관내에서 이러한 globoid 유사 세포의 잠재적 인 세포 독성 기능을 검사하는데 사용될 수있다. <ol><li> 설립 방법 (18, 20)를 사용하여 기본 희소 돌기 아교 세포의 문화를 개발한다. psychosine 처리 된 미세 아교 세포를 수집하려면, 부드럽게 우물의 바닥에서 느슨하게 부착 세포를 분리 피펫. 10 분 동안 300 XG에서, 원심 분리기를 세포를 수집하고 신중 Neurobasal 매체 이루어지는 희소 돌기 아교 세포의 분화 매체 [에서 재현 탁, L-글루타민 (1X), B-27 보조제 (1X), 및 트리 요오 도티 로닌 (T3, 10 NG / ㎖ )]. </li><li> 혈구를 이용하여 세포의 수를 계산하고 대략 한 결과, 1 × 105 세포 / ml로 배양 희소 돌기 아교 세포 상에 미세 아교 세포를 시드 : 2 소교 / 희소 돌기 아교 세포의 비율. 최대 3 일 동안 공동 문화로 품어. </li><li> 면역 세포에 대한 세포를 수정 (2.4 절 참조). ELISA를위한 세포 배양 배지를 수집하거나 필요한 화학 분석. </li></ol></li></ol>

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The authors declare no conflicts of interest.

본원에 기재된 프로토콜 개발 및 미세 아교 세포 활성화 및 세포 globoid 기능적 특성을 연구하는 새로운 모델 시스템을 제공한다. 임 외의 사전 작업. HEK293 세포주를 사용하여 globoid 셀 형상 (21)의 연구에 대한 본 프로토콜의 개발을위한 템플릿을 제공 하였다. 이 모델에서 파생 된 globoid 세포가 GLD에 식별 가능한 고유 globoid 세포에서 다르다는 것을 지적하는 것도 중요합니다. GLD에서...

또한 크라 질환으로 알려져 Globoid 세포 leukodystrophy (GLD)는, galatocerebrosidase (galc) 유전자 하나의 기능 돌연변이의 손실로 인한 ​​치명적인 탈수 초성 질환이다. GLD의 가장 일반적인 형태는 초기 아동기에 발병으로 대표되는 자주 시대 2,3의 오년 전에 모터와 조기 사망으로 이어지는인지 기능 저하의 공격적인 임상 경과 특징으로 유아 변종이다. 유전자 검사는 GLD (4)의 진단을 확인하는 데 사용된다. GLD의 신경 병리학은 globoid 세포 5-7라는 대폭적인 탈수 초화, 신경 쇠약, astrogliosis과 부풀어 오른 멀티 핵 미세 아교 세포의 존재를 알 수있다. 이러한 눈에 띄는 세포의 특정 기능이 애매 남아있다하더라도 종종 자신의 세포질에서 tubulous 내포물을 포함 globoid 세포의 식별은 지난 구십칠년에 대한 GLD의 정의하는 기능을하고있다. 비 myel의 참여GLD의 병인에 inating 아교 세포 (미세 아교 세포와 성상 세포는) 길이의이 질병 팔에 심각한 탈수 초화에 차 반응으로 간주되고있다. 흥미롭게도, 1916 5 KNUD 크라 만든이 질병의 첫 번째 설명,라는 이름의 한 지질 파편을 포함하는 다핵 식세포의보고 형성은 &#39;세포를 globoid&#39;이 질병의 특성을 정의합니다. GLD에서의 역할 오랫동안 무시되어 있지만 Globoid 세포는 GLD 병리의 특징 기능입니다. 흥미롭게도,이 세포는 GLD의 CNS 조직에서 가장 오래된 특성을 변경 중입니다. 지식의 부족으로 인해 다핵 식세포, 다른 질환이라는 거대 세포의 형성은 일반적으로 오히려 초기 병원성 원동력이 9보다 병리의 결과로 간주되는 것을 전제로하고 있습니다. 따라서, WHI에 의한 메커니즘을 조사하는 몇몇 연구가 있었다CH globoid 세포는 특히 GLD의 CNS에서 식세포로부터 형성된다. 이 보고서에 기술 된 절차에 CNS globoid 셀 형성의 중요성과 탐식 활성의보다 높은 수준을 나타내 시험 관내 미세 아교 세포 및이 세포의 유도 psychosine multinucleation 이전 시연에 초점을 맞춘다. 이러한 관찰과 일치, twitcher 뇌에서 globoid 세포 자주 식세포 활동의 높은 수준을 제안, PAS 양성 파편이 포함되어 있습니다. Globoid 세포도 페리틴에 대한 면역 양성으로 발견된다 (미세 아교 세포 마커) 10, KP-1 / CD68 (단핵 세포 마커), 그리고 일부는 멘틴에 대한 긍정적 인 (중간 필라멘트 단백질과 성상 세포의 마커 및 활성화 된 미세 아교 세포) 11, HLA-DRA (MHCII 표면 수용체), 및 TNF-α 07 및 12 년 Iba-1 (미세 아교 세포를 식별하는 데 사용되는 칼슘 결합 단백질). 마커의 컬렉션을 기반으로 globoid 세포를 개발하는 미세 아교 세포에서 발생독특한 표현형. 자신의 고유성에도 불구하고, 특정 기능과 GLD의 병인에 대한 GC를 기부금은 크게 간과하고있다. Globoid 세포는 만성 탈수 초화의 이차 결과로 생각되고있다. 그러나 GLD의 백질 병리 globoid 세포의 시간적 관계를 검사하는 과거의 연구는 출생 초기 기간의 후반에 globoid 배아 세포의 존재를 확인했다; 희소 돌기 아교 세포의 세포 사멸 및 명백한 탈수 초화 (13) 위의 시간. 따라서, GLD의 신경 병리학의 발달의 시간적 순서 globoid 세포가이 병 (14)에서 탈수 초화의 사전에 형성되는 것이 나왔다. 이 GLD에서 globoid 세포의 초기 형성이 희소 돌기 아교 세포 손상 15 차, 반응성 응답보다는 정의 병원성 이벤트를 나타낼 수있는 우리의 가설되었다. 또한, GLD에서 미세 아교 세포 활동의 조절 이상은 사실상 간주하고있다R 16이 질병을 치료하기위한 hematopeotic 줄기 세포 요법의 장기 효능을 제한. 따라서 psychosine에 응답하여 미세 아교 세포 기능 및 조절, 및 globoid 세포를 조사 GLD의 병인에 새로운 통찰력을 제공 할 것으로 기대된다. 최근까지 globoid 세포 형성을 연구하기에 적절한 모델의 부족은 정확한 기능과 GLD의 병리 이러한 세포의 기여에 대한 이해를 제한했다. 최근 연구에서, globoid 유사 세포가 GLD 축적 병원성 지질 독소 psychosine 직접적인 반응으로 형성 될 수 있다고 판단 하였다. 우리는 미세 아교 세포를 발견,하지만 대식 세포는 활성화되고 15 psychosine에 대한 응답으로 주 아교 문화 globoid 세포로 변환됩니다. globoid 세포로이 변환은 세포 외 단백질 분해 효소, 매트릭스 메탈 (MMP) -3 (15)에 의해 매개되는 것으로 밝혀졌다. 최근 우리이 체외 모델 시스템 개발이 psychosine 활성화 된 미세 아교 세포 및 globoid 세포를 이러한 연구 결과를 확장하고 결정한 희소 돌기 아교 세포 및 희소 돌기 아교 세포의 전구 세포에 강력하게 독성이. 따라서, GLD, psychosine와이 질병의 미세 아교 세포에 대한 신흥 차 및 가능한 병원성 역할을 지원할 것이다 탈수 초화 이전 globoid 세포 형성의 초기 축적의 맥락에서 고려 될 때. 우리는이 질병에 대한 우리의 이해에 기여할 GLD의 발병 기전에 대한 새로운 정보를 발표 할 예정이다 globoid 세포 형성의 연구를 제안한다. 또한, GLD의 새로운 휴대 전화 모델은 새로운 치료 접근 방법이 질병의 병리학 적 변화를 테스트 할 수 해결할 수있는 새로운 형식을 제공 할 수있다. 따라서이 보고서에서 우리는 비 myelinating 아교 세포의 차 문화 psychosine 유도 globoid 세포의 체외 개발에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="884">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:500px;">Hank&#8217;s balanced salt solution (HBSS) containing no cations (Mg2+ and Ca2+).&#160;</td>
			<td style="width:297px;">Life technologies</td>
			<td style="width:87px;">14175-095</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neural Tissue Dissociation Kit</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-092-628</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">40 uM cell-strainer</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22363547</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hank&#8217;s balanced salt solution (HBSS) containing cations (Mg2+ and Ca2+).&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-092</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s modified eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995-065</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicilin/Streptomycin</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>15070-063</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laminin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>25299-056</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Psychosine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9256</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>19208</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Normal Goat Serum (NGS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PCN5000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Iba-1</td>
			<td>WAKO</td>
			<td>019-19741</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor conjugated antisera</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Various</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mounting Media</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>OB100-01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phagocytic Assay Kit</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td>500290</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BP310-500</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro model for the study of cellular pathophysiology in globoid cell leukodystrophy

globoid 셀 leukodystrophy (GLD)의 중추 신경계에서 독특한 풍부 globoid 세포 불리는 다중 핵 미세 아교 세포의 정확한 기능은 불분명하다. 지식이 격차는 연구를위한 체외 모델의 적절한의 부족에 의해 방해되었다. 여기서, 우리는 기본 뮤린 신경교 배양 시스템을 설명 GLD 검색된 특성 globoid 세포 닮은 미세 아교 세포의 multinucleation psychosine에서 결과하는 치료. 이 신규 한 시스템을 사용하여, 우리는 globoid 세포 연구 및 분석 조건의 모드를 정의. 이 모델 시스템의 사용 가능성은 매트릭스 메탈 (MMP)에 대한 잠재적 인 역할을 식별 우리의 이전 연구에서 입증되었다 -3 GLD에서. 시험 관내 시스템이 신규 이러한 독특한 세포의 형성 및 기능뿐만 아니라 잠재적 인 치료 조작, 공부하는 유용한 모델이 될 수있다.

이 프로토콜은 서면으로, 마무리 (: 실험 워크 플로 계획 그림 1 참조) 시작부터 완료하는 데 약 삼십육일이 걸릴 것으로 예상된다. 그것은이 주 문화 시스템 &#39;globoid 같은&#39;세포의 개발은 신뢰성과 재현성 모두 것을 우리의 경험이다 : psychosine 님의 다핵 세포의 형성은 지속적으로 치료 칠일으로 관찰된다. 대형의 식별을 가능하게 핵 반대 얼룩과 함께 이바-1?...

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An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

Globoid cells are a defining pathological feature of Krabbe disease, a leukodystrophy currently lacking an effective long-term therapy. We have developed a cell culture model to study the innate biology and pathogenic potential of activated microglia and their transformation into globoid cells.

<em&gt; 체외</em&gt; Globoid 셀 Leukodystrophy에서 휴대 병태 생리의 연구에 대한 모델

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

7.8K 조회수.  University of Connecticut Health Center. Globoid cells are a defining pathological feature of Krabbe disease, a leukodystrophy currently lacking an effective long-term therapy. We have developed a cell culture model to study the innate biology and pathogenic potential of activated microglia and their transformation into globoid cells. 

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An Optic Nerve Crush Injury Murine Model to Study Retinal Ganglion Cell Survival

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible vision loss. Examples of such diseases in human include traumatic optic neuropathy and optic nerve degeneration in glaucoma. It is characterized by typical changes in the optic nerve head, progressive optic nerve degeneration, and loss of retinal ganglion cells, if uncontrolled, leading to vision loss and blindness.
The optic nerve crush (ONC) injury mouse model is an important experimental disease model for traumatic optic neuropathy, glaucoma, etc. In this model, the crush injury to the optic nerve leads to gradual retinal ganglion cells apoptosis. This disease model can be used to study the general processes and mechanisms of neuronal death and survival, which is essential for the development of therapeutic measures. In addition, pharmacological and molecular approaches can be used in this model to identify and test potential therapeutic reagents to treat different types of optic neuropathy.
Here, we provide a step by step demonstration of (I) Baseline retrograde labeling of retinal ganglion cells (RGCs) at day 1, (II) Optic nerve crush injury at day 4, (III) Harvest the retinae and analyze RGC survival at day 11, and (IV) Representative result.

This protocol shows how to retrogradely label retinal ganglion cells, and how to subsequently make an optic nerve crush injury in order to analyze retinal ganglion cell survival and apoptosis. It is an experimental disease model for different types of optic neuropathy, including glaucoma.

망막 신경절 세포의 생존을 공부 시신경의 호감 상해 Murine 모델

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible ...

연구

신경과학

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The blood-brain barrier (BBB) consisting of EC, astrocyte end-feet, pericytes and the basal membrane is responsible for the protection and homeostasis of the brain parenchyma. In vitro BBB models are common tools to study the structure and function of the BBB at the cellular level. A considerable number of different in vitro BBB models have been established for research in different laboratories to date. Usually, the cells are obtained from bovine, porcine, rat or mouse brain tissue (discussed in detail in the review by Wilhelm et al. 1). Human tissue samples are available only in a restricted number of laboratories or companies 2,3. While primary cell preparations are time consuming and the EC cultures can differ from batch to batch, the establishment of immortalized EC lines is the focus of scientific interest.
Here, we present a method for establishing an immortalized brain microvascular EC line from neonatal mouse brain. We describe the procedure step-by-step listing the reagents and solutions used. The method established by our lab allows the isolation of a homogenous immortalized endothelial cell line within four to five weeks. The brain microvascular endothelial cell lines termed cEND 4 (from cerebral cortex) and cerebEND 5 (from cerebellar cortex), were isolated according to this procedure in the F&ouml;rster laboratory and have been effectively used for explanation of different physiological and pathological processes at the BBB. Using cEND and cerebEND we have demonstrated that these cells respond to glucocorticoid- 4,6-9 and estrogen-treatment 10 as well as to pro-infammatory mediators, such as TNFalpha 5,8. Moreover, we have studied the pathology of multiple sclerosis 11 and hypoxia 12,13 on the EC-level. The cEND and cerebEND lines can be considered as a good tool for studying the structure and function of the BBB, cellular responses of ECs to different stimuli or interaction of the EC with lymphocytes or cancer cells.

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

This method describes how to isolate and immortalize microvascular endothelial cells from mouse brain. We describe a step-by-step protocol starting from the homogenization of brain tissue, digestion steps, seeding and immortalization of the cells. Usually, it takes about five weeks to obtain a homogenous, immortalized microvascular endothelial cell line.

로 불후의 손쥐 뇌 Microvascular 내피 세포 라인의 생성<em&gt; 체외에서</em&gt; 혈액 뇌 장벽 모델

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

소뇌 과립 신경 세포의 유전자 조작<em&gt; 체외</em&gt;와<em&gt; 생체</em&gt; 신경 세포의 형태와 마이그레이션을 연구하는

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

모델로 후각 시스템은 축삭 성장 패턴 및 형태를 연구하는<em&gt; 생체</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the study of nerve regeneration and myelination. The glial cells of the peripheral nervous system, Schwann cells (SC), are key facilitators of these processes; it is therefore crucial that the interactions of these cellular components are studied together. Direct contact between DRG neurons and glial cells provides additional stimuli sensed by specific membrane receptors, further improving the neuronal response. SC release growth factors and proteins in the culture medium, which enhance neuron survival and stimulate neurite sprouting and extension. However, SC require long proliferation time to be used for tissue engineering applications and the sacrifice of an healthy nerve for their sourcing. Adipose-derived stem cells (ASC) differentiated into SC phenotype are a valid alternative to SC for the set-up of a co-culture model with DRG neurons to study nerve regeneration. The present work presents a detailed and reproducible step-by-step protocol to harvest both DRG neurons and ASC from adult rats; to differentiate ASC towards a SC phenotype; and combines the two cell types in a direct co-culture system to investigate the interplay between neurons and SC in the peripheral nervous system. This tool has great potential in the optimization of tissue-engineered constructs for peripheral nerve repair.

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) are structures containing the sensory neurons of the peripheral nervous system. When dissociated, they can be co-cultured with SC-like adipose-derived stem cells (ASC), providing a valuable model to study in vitro nerve regeneration and myelination, mimicking the in vivo environment at the injury site.

루트 신경절 신경 세포와 차별화 된 지방 유래 줄기 세포를 이룬다 :<em&gt; 체외</em&gt; 공동 문화 모델은 주변 신경 재생을 연구하는

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These neurotropic cancer cells have a unique ability to migrate unidirectionally along nerves towards the central nervous system (CNS). The dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model is a three dimensional (3D) in vitro model frequently used for studying the interaction between neural stroma and cancer cells. In this model, mouse or human cancer cell lines are grown in ECM adjacent to preparations of freshly dissociated cultured DRG. In this article, the DRG isolation protocol from mice, and implantation in petri dishes for co-culturing with pancreatic cancer cells are demonstrated. Five days after implantation, the cancer cells made contact with the DRG neurites. Later, these cells formed bridgeheads to facilitate more extensive polarized, neurotropic migration of cancer cells.

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

This video article shows the use of the dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model in pancreatic ductal adenocarcinoma.

등쪽 뿌리 신경절 모델 : 암성 신경 침략의 생체 외 모델링에서

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly controlled formation and maintenance of complex neuronal networks are not completely understood thus far. The open questions concerning neurons in health and disease are diverse and reaching from understanding the basic development to investigating human related pathologies, e.g.,&#160;Alzheimer&#39;s disease and&#160;Schizophrenia. The most detailed analysis of neurons can be performed in vitro. However, neurons are demanding cells and need the additional support of astrocytes for their long-term survival. This cellular heterogeneity is in conflict with the aim to dissect the analysis of neurons and astrocytes. We present here a cell-culture assay that allows for the long-term cocultivation of pure primary neurons and astrocytes, which share the same chemically defined medium, while being physically separated. In this setup, the cultures survive for up to four weeks and the assay is suitable for a diversity of investigations concerning neuron-glia interaction.

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

This protocol describes the indirect neuron-astrocyte coculture for compartmentalized analysis of neuron-glia interactions.

간접 신경-성상 세포 공동 배양 분석 일 :<em&gt; 체외</em&gt; 신경 세포 - glia 상호 작용의 상세한 조사를위한 셋업

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, their distinct dendritic morphologies, their specific patterns of axonal connectivity, and their selective firing responses. The molecular and cellular mechanisms responsible for these aspects of differentiation during development are still poorly understood.
Here, we describe combined protocols for labeling and characterizing the structural connectivity and excitability of cortical neurons. Modification of the in utero electroporation (IUE) protocol allows the labeling of a sparse population of neurons. This, in turn, enables the identification and tracking of the dendrites and axons of individual neurons, the precise characterization of the laminar location of axonal projections, and morphometric analysis. IUE can also be used to investigate changes in the excitability of wild-type (WT) or genetically modified neurons by combining it with whole-cell recording from acute slices of electroporated brains. These two techniques contribute to a better understanding of the coupling of structural and functional connectivity and of the molecular mechanisms controlling neuronal diversity during development. These developmental processes have important implications on axonal wiring, the functional diversity of neurons, and the biology of cognitive disorders.

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

This manuscript provides protocols that use in utero electroporation (IUE) to describe the structural connectivity of neurons at the single-cell level and the excitability of fluorescently labeled neurons. Histology is used to characterize dendritic and axonal projections. Whole-cell recording in acute slices is used to investigate excitability.

자궁 내 일렉트로는 신경 세포의 부분 집단의 흥분 및 단일 세포의 연결을 연구에 접근

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network dynamics in neuronal cultures. In contrast with more traditional methods, such as patch-clamping, which can only record activity from a single cell, MEAs can record simultaneously from multiple sites in a network, without requiring the arduous task of placing each electrode individually. Moreover, numerous control and stimulation configurations can be easily applied within the same experimental setup, allowing for a broad range of dynamics to be explored. One of the key dynamics of interest in these in vitro studies has been the extent to which cultured networks display properties indicative of learning. Mouse neuronal cells cultured on MEAs display an increase in response following training induced by electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neuronal cells on MEAs; successfully record from over 95% of the plated dishes; establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation; and sort, plot, and interpret the results from such experiments. The use of a proprietary system for stimulating and recording neuronal cultures is demonstrated. Software packages are also used to sort neuronal units. A custom-designed graphical user interface is used to visualize post-stimulus time histograms, inter-burst intervals, and burst duration, as well as to compare the cellular response to stimulation before and after a training protocol. Finally, representative results and future directions of this research effort are discussed.

Mouse neuronal cells cultured on multi-electrode arrays display an increase in response following electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neurons, how to record activity, and how to establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation.

미세 전극 배열에서 신경 세포 배양의 자극에 대한 네트워크 반응의 시간 의존적 증가

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal

Understanding the ephemeral changes that occur during brain development and maturation requires detailed high-resolution imaging in space and time at cellular and subcellular resolution. Advances in molecular and imaging technologies have allowed us to gain numerous detailed insights into cellular and molecular mechanisms of brain development in the transparent zebrafish embryo. Recently, processes of refinement of neuronal connectivity that occur at later larval stages several weeks after fertilization, which are for example control of social behavior, decision making or motivation-driven behavior, have moved into focus of research. At these stages, pigmentation of the zebrafish skin interferes with light penetration into brain tissue, and solutions for embryonic stages, e.g., pharmacological inhibition of pigmentation, are not feasible anymore.
Therefore, a minimally invasive surgical solution for microscopy access to the brain of awake zebrafish is provided that is derived from electrophysiological&#160;approaches. In teleosts, skin and soft skull cartilage can be carefully removed by micro-peeling these layers, exposing underlying neurons and axonal tracts without damage. This allows for recording neuronal morphology, including synaptic structures and their molecular contents, and the observation of physiological changes such as Ca2+ transients or intracellular transport events. In addition, interrogation of these processes by means of pharmacological inhibition or optogenetic manipulation is feasible. This brain exposure approach provides information about structural and physiological changes in neurons as well as the correlation and interdependence of these events in live brain tissue in the range of minutes or hours. The technique is suitable for in vivo brain imaging of zebrafish larvae up to 30 days post fertilization, the latest developmental stage tested so far. It, thus, provides access to such important questions as synaptic refinement and scaling, axonal and dendritic transport, synaptic targeting of cytoskeletal cargo or local activity-dependent expression. Therefore, a broad use for this mounting and imaging approach can be anticipated.

Here we present a method to image the zebrafish embryonic brain in vivo upto larval and juvenile stages. This microinvasive procedure, adapted from electrophysiological approaches, provides access to cellular and subcellular details of mature neuron and can be combined with optogenetics and neuropharmacological studies for characterizing brain function and drug intervention.

두개골과 피부 제거에 의해 깨어 얼룩말 물고기 애벌레와 청소년에서 완전히 활성 뇌 조직의 생체 내 이미징

Understanding the ephemeral changes that occur during brain development and maturation requires detailed high-resolution imaging in space and time at ...