이 연구는 보조금 번호 FO 315/4-1 및 DFG SFB 688에서 독일 Forschungsgemeinschaft DFG의 지원을했습니다.

1. 뇌 Microvessels의 절연 <ol><li> 각 준비 중 여성의 5-10 신생아 마우스 (3-5일 이전)을 사용합니다. </li><li> 지역 IACUC / 수의사 추천에 따라 마우스를 안락사시켜야 즉시 뇌를 제거하고 다음과 같은 솔루션을 포함하는 페트리 접시에 전송 : 15 밀리미터 Hepes (산도 7.4), 153 MM NaCl, 5.6 MM KCl, 2.3 MM CaCl 2 X 2H 2 O, 2.6 MM MgCl 2 X 6H 2 O, 1 % (w / V) BSA (이하와 같은 A를 버퍼링 참조). </li><li> 특별히 명시하지 않는 한, 모든 절연 절차는 층류의 후드 아래에 실내 온도 (RT) (22-24 ° C)에서 수행해야합니다. 버퍼에, meninges 및 모세관 조각을 제거 후, ​​머리를 (소뇌와 뇌간이없는 꿈) 잘라 멸균 메스를 사용하여. 조직가 조각 피펫 아래로 더 clumps가 나타나지 때까지 10 ML의 피펫을 사용합니다. RT에서 5 분 250 XG에서 50 ML 팔콘 튜브와 원심 분리기에 정지 전송합니다. </li></ol> 참고 : Meninges는 뇌 세포의 표면에 얇은 투명 멤브레인으로 식별 할 수 있습니다. 그들은 조심스럽게 무균 집게로 제거 할 수 있습니다. <ol start="4"><li> 표면에 뜨는 폐기하십시오. </li><li> 4.5 ML 버퍼에있는 펠릿을 분해 0.75 %의 1.5 ML (w / V)와 collagenase / dispase (로슈)와 37 번 45 분 ° 물 욕조에서 C (가끔 흔들어)에 품다. </li><li> 한편, 콜라겐 IV (0.1 밀리그램 / 50 MM 아세트산에 용해 ML)로 코팅 네 우물을하여 12 잘 접시를 준비합니다. 1 시간에 준수 할 수 있습니다. </li><li> 15 ML 얼음처럼 차가운 버퍼 A. Resuspend 철저하게 펠릿의 추가하여 소화를 중지합니다. </li><li> RT에서 10 분 250 XG에서 정지 원심 분리기. </li><li> 표면에 뜨는 폐기하십시오. </li><li> myelin을 제거하려면, 4 ° C.에 20 분 1,000 XG에서 10 ML 25% (w / V) BSA (시그마, 순도&gt; 98%)와 원심 분리기를 추가 25 % BSA는 1X PBS (PAA Laboratories의)에 용해 및 0.2 μm의 F를 통해 필터링해야합니다ilter). </li><li> 표면에 뜨는을주의 깊게을 삭제, 10 ML 버퍼에있는 펠릿을 분해하고 새로운 팔콘 튜브에 전송할 수 있습니다. </li><li> RT에서 5 분 250 XG에서 정지 원심 분리기. 그 결과 펠렛은 내피 세포가 포함되어 있습니다. </li><li> PBS로 두 번 콜라겐 IV-코팅 12도 판을 씻으십시오. </li><li> 이 우물, 각도 2 ML에 4 성장 매체의 ML (DMEM 10 % FCS, 50U/ml 페니실린 / 스트렙토 마이신, 1 % L-글루타민을 포함)와 플레이트 세포 현탁액에서 펠렛을 Resuspend. 37 번 45 분 4 μg / ML 및 배양의 최종 농도 ° 세포 문화 인큐베이터에서 C로 puromycin을 추가합니다. 이 단계는 급속하게 준수 세포의 제거를 할 수 있습니다. 참고 : Puromycin는 24 시간에 추가됩니다. 만 뇌 ECS는 다른 세포 유형에 puromycin 14 독성이며,이를 흡수 할 수 있습니다. </li><li> 이 새로운 우물 (이 우물은 EC 분획을 포함)에 단계 1.14에서 비 준수 세포를 포함하는 2 ML 매체를 전송합니다. STE의 준수 세포로 우물을 작성P 2 ML 신선한 매체 (이 우물은 다른 세포 유형, 예를 들어 섬유 아세포, astrocytes을 포함하고 병렬로 성장하고 형태의 비교에 사용할 수 있습니다)에 1.14. </li><li> 다음 날 매체를 변경합니다. </li></ol> 2. 브레인 Microvascular 내피 세포를 Immortalizing <ol><li> GP + E-86 네오 (GPENeo) 15 섬유 아세포, 분비 10% 열 inactivated FCS, 50U/ml 페니실린 / 스트렙토 마이신, 2 MG / ML G418을 (포함 DMEM 매체에 polyoma 중 T의 종양 유전자와 복제 - 결함 바이러스를 배양 . 젤라틴 코팅 플라스크에 PAA Laboratories의) 참고 : Polyoma 중 T의 종양 유전자의 transfection은 4~6주 문화의 내피 형태로 세포의 동질적인 monolayer로 이어지는 비 ECS를 통해 ECS의 성장 우위가 발생합니다. GPENeo가 상업적으로 사용할 수 없으며 (원본 출판물에 4,16을 참조하시기 바랍니다) 공유 공공 소재로 얻을 수 있습니다. </li><li> 에 대한 바이러스 함유 미디어를 사용하려면<html> 불멸화, 24 H에 G418 무료 매체에 GPENeo 세포를 배양. </li><li> GPEneo 표면에 뜨는 10 ML을 제거 및 8 μg / ML의 최종 농도에 Polybrene (hexadimethrine 브롬화) (시그마)를 추가, 세포 파편을 제거하는 필터 0.45 μm을 통해 소독. </li><li> 1 부에서 준비 EC 문화에서 성장 매체를 제거하고 우​​물에 GPEneo 표면에 뜨는 / Polybrene 혼합물의 2 ML를 추가합니다. 신선한 GPEneo Polybrene / 표면에 뜨는 혼합물을 사용하여 다음 날을 반복 참고 :. Polybrene는 바이러스 입자)으로 감염을 촉진하기 셀 벽에 구멍을하는 데 사용됩니다. </li><li> GPEneo 표면에 뜨는 / Polybrene 혼합에게 다음 날 제거 PBS로 두 번 세포를 씻고 그것에게 매 3 일마다 변경의 성장 매체에있는 세포를 유지하고 있습니다. 합류 후, 콜라겐 IV - 코팅 접시에 세포에게 1시 2분을 분할. </li><li> 일반적으로, 안정적 뇌성 내피 (cEND) 셀 라인 4~5주 나중에 취득해야합니다. </li></ol>E &quot;&gt; 3. 뇌 Microvascular 내피 세포 육성 <ol><li> 10 ML 미리 예열 매체 15 ML-팔콘의 물을 욕조 및 전송에 cryoaliquot에서 세포를 해동. </li><li> RT에서 5 분 250 XG에서 정지 원심 분리기. </li><li> 매체를 제거합니다 (도금에 대한 세포 밀도가 적어도 1 회 10 4 셀 / ML이어야 함) 사전 예열 성장 매체와 콜라겐 IV 코팅 T 25cm 2 세포 배양 플라스크에서 펠렛을 전송합니다. </li><li> 다음 날 매체를 변경하고 세포가 합류에 도달 한 후 (보통 후 5 일) 셀을 분할. </li></ol> 4. cEND - 세포의 분리 (참고 : 분할 만 일주일에 한 번씩 수행 할 경우, 1시 4분보다 높은 분리하지 마십시오). <ol><li> , 중간을 제거 PBS로 세포를 씻어. </li><li> 37 품다 따뜻한 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션 (PAA Laboratories의) (T 75cm 2 플라스크), 3 ML을 추가 ° C 및 셀 레이어가 (보통 5-15 분 이내) 분산 될 때까지 기다리십시오. </li><li> 5 ML O를 추가합니다F 성장 매체는 최대 피펫 아래로, 그리고 IV-코팅 플라스크 새로운 콜라겐으로 전송됩니다. </li></ol> 5. cEND - 세포의 동결 <ol><li> 4 단계에서 설명 된대로 세포 현탁액을 확보 </li><li> RT에서 5 분 250 XG에서 정지 원심 분리기. </li><li> 6 ML 냉동 매체 (95 % 성장 매체, 5 % DMSO)에 세포 펠릿 (1 T 75cm 2 플라스크로부터 얻은) Resuspend. </li><li> . 한 cryo-나누어지는이 T 25cm 2 플라스크에 놓는 할 수 있습니다 : 네 개의 1.5 ML cryo-aliquots 참고로 세포 현탁액을 나눈다. </li><li> 액체 질소 증기 온도에서 cryo-aliquots를 저장합니다. </li></ol> 450 ML DMEM, 10 % FCS, 10 ML L-글루타민, 2% 가상 - 키트, 2퍼센트 NEAA, 10 ML의 나트륨의 pyruvate, 50 U / ML 페니실린 / 스트렙토 마이신 : 성장 매체를 cEND 6. 대표 결과 cEND 및 cerebEND 세포가 내피의 immunostainings을 특징으로 한차 BBB는 transendothelial 전기 저항 (티에르)와 투자율의 측정에 의해뿐만 아니라 마커. cEND과 cerebEND이 합류에서 성장 억제를 전시 단단히 포장 길쭉한 세포 monolayers과 뇌 ECS의 주요 문화와 비슷한 형태했다. 세포는 immunofluorescence (그림 3) 4,5으로 표시된 셀 셀 접합에서 지역화 된 claudin-5, occludin 및 VE-cadherin 단백질 잘 감지 레벨을 표명했다. 혈청 - 감소 미디어에서 배양의 cEND 전지는 티에르의 증가 (Ωcm 2 150 2퍼센트 혈청의 존재 500 Ωcm 2 혈청 10 %의 존재에서) 하이드로 코티손의 추가에 의해 potentiated되었습니다 (800 Ωcm으로 이어 2) 혹은 인슐린 (1,000 Ωcm 2) 4. 21일에 대한 혈청 - 할인 매체에 배양 cEND의 Monolayers이있어서 900 Ωcm 2 (그림 4)의 티에르. 티에르는 어셈블리를 사용하여 측정되었다포함하는 전류 전달 및 전압 측정 전극 (세계 정밀 계측기). 비교를 들어, 1 차 microvascular 뇌 ECS는 Ωcm 2, 상업적으로 이용 가능한 마우스 세포주 bEnd.3는 스님 2005 년과 토스 동부 표준시를 참조 최근 검토 100-140 Ωcm 2 (중 티에르 값을 가지고 200-600의 티에르 값을 가지고보고되었습니다 알., 2011 년 17,18). 또한, 4 시간 이상 같은 비 충전 분자 질량 4, 10, 70, 500 kDa의 FITC-dextrans, 또는 2퍼센트 FCS 차별화 매체에 cEND의 monolayer에서 fluorescein (300 다)와 같은 고분자의 통로가 감소되었다 10% FCS를 포함하는 성장 매체에 유지 관리 전지와 비교 : paracellular 플럭스는 FITC-dextrans 10 70 kDa에 26%까지 fluorescein의 제어 세포의 30 %로 축소되었고, 플럭스는 FITC에 대한 제어 세포의 4.5 %로 감소되었다 - dextrtan 500 kDa. 값을 티에르와 마찬가지로 투자율은 gluc의 면전에서 배양 세포에서 낮은 수준에 있었어요ocorticoids (GC) 4. 더 연구에서, 우리는 글루코 코르티코이드 대상 유전자, occludin, claudin-5 및 뇌 혈관 내피 4,7,9에서 VE-cadherin을 확인. GC 치료는 이러한 단백질의 표현의 증가와 세포 골격에 대한 VE-cadherin의 다시 정리하기로 하였다. 꼭 접합 단백질 occludin과 claudin-5의 직접 GC로 인한 규정은 발기인 지역 4,7,19에서 GC 응답 요소를 통해 나타납니다. 또한, claudin-5는 혈관 내피 10 소설 에스트로겐 대상으로 확인되었다. 내피 부전 underlies 여러 가지 질병을. 우리는 산소 / 포도당 박탈 (OGD) 조건 하에서 cEND을 배양. OGD는 GC와 proteasome 억제제를 bortezomib 12 결합 치료 후 재구성 할 수있는 BBB 기능의 중단에되었다. OGD 조건은 포도당 통풍 관에서 강한 인상을 이끌어 포도당 transpor의 표현에MK801, NMDA 수용체 - 13 비 경쟁적 억제제를 추가로 감소 될 수 cerebEND의 감마선. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig1.jpg" /> 1 그림. 뇌 microvascular 내피 세포 (cEND) 절연을 차례로 일주일 정도. 가벼운 현미경 사진의 형태는 6x (A)와 15x (B) 확대에 따라 촬영 된 것입니다. 내피 세포의 섬 형성 식민지가 표시됩니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig2.jpg" /> 그림 2. 절연 및 불멸화 후 뇌 microvascular 내피 세포 (cEND)의 형태 일개월. 가벼운 현미경 사진은 15x 배율에서 촬영 된 것입니다. 합류, 동질적인 내피 세포 monolayer를 볼 수 있습니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig3.jpg" /> 그림 3. 불후의 뇌 microvasculAR 내피 세포 특급 claudin-5, occludin 및 VE-cadherin. CEND 세포는 콜라겐 IV-코팅 coverslips에 성장과 claudin-5에 대한 항체 (A), occludin (B)와 VE-cadherin (C) 물들되었습니다. 이미지는 40x 확대에 따라 Zeiss Axioscop2 현미경을 사용하여 촬영 된 것입니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig4.jpg" /> 4 그림. cEND monolayer. CEND의 transendothelial 전기 저항 측정 (티에르)는 콜라겐 IV-코팅 transwell 필터 (기공 크기 0.4 μm)에서 성장했다. 합류에 도달 한 후 셀 2% FCS를 포함하는 매체에 유지되었다. 티에르는 전류 전달 및 전압 측정 전극을 포함하는 어셈블리를 사용하여 7, 14, 21 일 후에 측정되었다.

<ol>
	<li>Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+the+blood-brain+barrier.">In vitro models of the blood-brain barrier.</a> Acta Neurobiol. Exp (Wars). 71, 113 (2011).</li><li>Forster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+hydrocortisone+and+TNFalpha+on+tight+junction+proteins+in+an+in+vitro+model+of+the+human+blood-brain+barrier.">Differential effects of hydrocortisone and TNFalpha on tight junction proteins in an in vitro model of the human blood-brain barrier.</a> J. Physiol. 586, 1937 (2008).</li><li>Weksler, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier-specific+properties+of+a+human+adult+brain+endothelial+cell+line.">Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line.</a> FASEB. J. 19, 1872 (2005).</li><li>Forster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occludin+as+direct+target+for+glucocorticoid-induced+improvement+of+blood-brain+barrier+properties+in+a+murine+in+vitro+system.">Occludin as direct target for glucocorticoid-induced improvement of blood-brain barrier properties in a murine in vitro system.</a> J. Physiol. 565 (Pt 2), 475 (2005).</li><li>Silwedel, C., Forster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+susceptibility+of+cerebral+and+cerebellar+murine+brain+microvascular+endothelial+cells+to+loss+of+barrier+properties+in+response+to+inflammatory+stimuli.">Differential susceptibility of cerebral and cerebellar murine brain microvascular endothelial cells to loss of barrier properties in response to inflammatory stimuli.</a> J. Neuroimmunol. 179, 37 (2006).</li><li>Forster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoid+effects+on+mouse+microvascular+endothelial+barrier+permeability+are+brain+specific.">Glucocorticoid effects on mouse microvascular endothelial barrier permeability are brain specific.</a> J. Physiol. 573 (Pt 2), 413 (2006).</li><li>Burek, M., Forster, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+characterization+of+the+murine+claudin-5+promoter.">Cloning and characterization of the murine claudin-5 promoter.</a> Mol. Cell Endocrinol. 298, 19 (2009).</li><li>Forster, C., Kahles, T., Kietz, S., Drenckhahn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dexamethasone+induces+the+expression+of+metalloproteinase+inhibitor+TIMP-1+in+the+murine+cerebral+vascular+endothelial+cell+line+cEND.">Dexamethasone induces the expression of metalloproteinase inhibitor TIMP-1 in the murine cerebral vascular endothelial cell line cEND.</a> J. Physiol. 580 (Pt.3), 937 (2007).</li><li>Blecharz, K. G., Drenckhahn, D., Forster, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoids+increase+VE-cadherin+expression+and+cause+cytoskeletal+rearrangements+in+murine+brain+endothelial+cEND+cells.">Glucocorticoids increase VE-cadherin expression and cause cytoskeletal rearrangements in murine brain endothelial cEND cells.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 28, 1139 (2008).</li><li>Burek, M., Arias-Loza, P. A., Roewer, N., Forster, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claudin-5+as+a+novel+estrogen+target+in+vascular+endothelium.">Claudin-5 as a novel estrogen target in vascular endothelium.</a> Arterioscler. Thromb Vasc. Biol. 30, 298 (2010).</li><li>Blecharz, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoid+effects+on+endothelial+barrier+function+in+the+murine+brain+endothelial+cell+line+cEND+incubated+with+sera+from+patients+with+multiple+sclerosis.">Glucocorticoid effects on endothelial barrier function in the murine brain endothelial cell line cEND incubated with sera from patients with multiple sclerosis.</a> Mult. Scler. 16, 293 (2010).</li><li>Kleinschnitz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoid+insensitivity+at+the+hypoxic+blood-brain+barrier+can+be+reversed+by+inhibition+of+the+proteasome.">Glucocorticoid insensitivity at the hypoxic blood-brain barrier can be reversed by inhibition of the proteasome.</a> Stroke. 42, 1081 (2011).</li><li>Neuhaus, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addition+of+NMDA-receptor+antagonist+MK801+during+oxygen/glucose+deprivation+moderately+attenuates+the+upregulation+of+glucose+uptake+after+subsequent+reoxygenation+in+brain+endothelial+cells.">Addition of NMDA-receptor antagonist MK801 during oxygen/glucose deprivation moderately attenuates the upregulation of glucose uptake after subsequent reoxygenation in brain endothelial cells.</a> Neurosci. Lett. 506, 44 (2012).</li><li>Perriere, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Puromycin-based+purification+of+rat+brain+capillary+endothelial+cell+cultures.+Effect+on+the+expression+of+blood-brain+barrier-specific+properties.">Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties.</a> J. Neurochem. 93, 279 (2005).</li><li>Golenhofen, N., Ness, W., Wawrousek, E. F., Drenckhahn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+induction+of+the+stress+protein+alpha-B-crystallin+in+vascular+endothelial+cells.">Expression and induction of the stress protein alpha-B-crystallin in vascular endothelial cells.</a> Histochem Cell Biol. 117, 203 (2002).</li><li>Risau, W., Engelhardt, B., Wekerle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+function+of+the+blood-brain+barrier:+incomplete+presentation+of+protein+(auto-)antigens+by+rat+brain+microvascular+endothelium+in+vitro.">Immune function of the blood-brain barrier: incomplete presentation of protein (auto-)antigens by rat brain microvascular endothelium in vitro.</a> J. Cell Biol. 110, 1757 (1990).</li><li>Abbott, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+CNS+barriers:+evolution,+differentiation,+and+modulation.">Dynamics of CNS barriers: evolution, differentiation, and modulation.</a> Cell Mol. Neurobiol. 25, 5 (2005).</li><li>Toth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patented+in+vitro+blood-brain+barrier+models+in+CNS+drug+discovery.">Patented in vitro blood-brain barrier models in CNS drug discovery.</a> Recent Pat. CNS Drug Discov. 6, 107 (2011).</li><li>Harke, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoids+regulate+the+human+occludin+gene+through+a+single+imperfect+palindromic+glucocorticoid+response+element.">Glucocorticoids regulate the human occludin gene through a single imperfect palindromic glucocorticoid response element.</a> Mol. Cell Endocrinol. 295, 39 (2008).</li><li>Kiefer, F., Courtneidge, S. A., Wagner, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+properties+of+the+middle+T+antigens+of+polyomaviruses.">Oncogenic properties of the middle T antigens of polyomaviruses.</a> Adv. Cancer Res. 64, 125 (1994).</li><li>Kiefer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+transformation+by+polyomavirus+middle+T+antigen+in+mice+lacking+Src-related+kinases.">Endothelial cell transformation by polyomavirus middle T antigen in mice lacking Src-related kinases.</a> Curr. Biol. 4, 100 (1994).</li><li>Ong, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ShcA+and+Grb2+mediate+polyoma+middle+T+antigen-induced+endothelial+transformation+and+Gab1+tyrosine+phosphorylation.">ShcA and Grb2 mediate polyoma middle T antigen-induced endothelial transformation and Gab1 tyrosine phosphorylation.</a> EMBO J. 20, 6327 (2001).</li><li>O'Connell, K. A., Edidin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+lymphoid+endothelial+cell+line+immortalized+by+simian+virus+40+binds+lymphocytes+and+retains+functional+characteristics+of+normal+endothelial+cells.">A mouse lymphoid endothelial cell line immortalized by simian virus 40 binds lymphocytes and retains functional characteristics of normal endothelial cells.</a> J. Immunol. 144, 521 (1990).</li><li>Roux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+gamma-glutamyl+transpeptidase+and+alkaline+phosphatase+activities+in+immortalized+rat+brain+microvessel+endothelial+cells.">Regulation of gamma-glutamyl transpeptidase and alkaline phosphatase activities in immortalized rat brain microvessel endothelial cells.</a> J. Cell Physiol. 159, 101 (1994).</li><li>Montesano, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+proteolytic+activity+is+responsible+for+the+aberrant+morphogenetic+behavior+of+endothelial+cells+expressing+the+middle+T+oncogene.">Increased proteolytic activity is responsible for the aberrant morphogenetic behavior of endothelial cells expressing the middle T oncogene.</a> Cell. 62, 435 (1990).</li><li>Steiner, O., Coisne, C., Engelhardt, B., Lyck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+immortalized+bEnd5+and+primary+mouse+brain+microvascular+endothelial+cells+as+in+vitro+blood-brain+barrier+models+for+the+study+of+T+cell+extravasation.">Comparison of immortalized bEnd5 and primary mouse brain microvascular endothelial cells as in vitro blood-brain barrier models for the study of T cell extravasation.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 31, 315 (2010).</li><li>Skaper, S. D., Conn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Neurosciences. 2, 1303 (1990).</li><li>Ishii, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombomodulin,+an+endothelial+anticoagulant+protein,+is+absent+from+the+human+brain.">Thrombomodulin, an endothelial anticoagulant protein, is absent from the human brain.</a> Blood. 67, 362 (1986).</li><li>Minagar, A., Alexander, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+disruption+in+multiple+sclerosis.">Blood-brain barrier disruption in multiple sclerosis.</a> Mult. Scler. 9, 540 (2003).</li></ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

설명 절차는 혈관 내피 기능의 특정 변경 사항을 공부하고 다른 마우스 종자에서뿐만 아니라 다른 똑 아웃 마우스 종자에서 ECS microvascular의 분리에 사용될 수 있습니다. 불멸화의 방법으로 우리는 손쥐 polyomavirus, Polyoma 중간 T 항원의 oncoprotein과 변환을 사용했습니다. 이 생체과 체외 20,21,22에 빠르게 미숙 한 내피 세포를 변환합니다. 문학에 설명 된 ECS의 불멸화의 다른 방법은 예를 들어 SV40 대형 유인원 Vacuolating 바이러스의 T 항원 40 23 아데노 바이러스 유전자 산물 E1A 24 또는 인간의 telomerase 3 촉매 subunit의 overexpression와 불멸화가 포함되어 있습니다. PymT있는 불멸화는 짧은 시간에 신생아 쥐에서 동질 EC 문화를 취득 할 수 있습니다 손쥐 미숙 한 ECS, 대한 구체적인 있습니다. 불멸화는 세포와 일의 속성을 변경불후의 세포 라인으로 얻은 전자 결과는 기본 셀이나 마우스와 생체 내 실험과 중 비교해야합니다. PymT 불후의 EC는 urokinase 형 plasminogen 활성화의 증가 생산으로 인한 fibrinolytic 활동의 높은 수준을 표현하는 설명과 plasminogen 활성 억제제 25 생산을 감소되었습니다. PymT의 직접 비교 체외 BBB 모델에 모두 잘 T 세포 부착 연구 26에 적합 것으로 밝혀 기본으로 bEND5 세포주 ECS을 불후의. 설명 절차에 따라 설립 셀 라인 세포가 노화하는 동안 이러한 속성을 잃게로, BBB 및 EC junctional 단백질의 높은 표현으로 장벽 속성을 유지하기 위해 낮은 통로 번호 사용할 수 있습니다. 따라서 장벽 특성의 손실 후, 새로운 세포 라인의 준비가 고려되어야한다. 셀 도금 밀도는이 세포 증식에​​ 중요하므로, ECS 높은해야합니다. 이것은뿐만 아니라 불후의 ECS의 유지와 격리 절차를 수행하는 동안 고려되어야합니다. 각각의 새 셀 라인은 그 장벽 속성 및 다른 세포 유형 가능한 오염 물질에 대한 테스트해야합니다. EC의 monolayers는 oligodendrocytes, astrocytes 및 pericytes 4,27으로 오염을 제외 할 기본 항체와 같은 안티 galactocerebroside, 안티 glial fibrillary 산성 단백질과 항 평활근 항원 물들 할 수 있습니다. meningal의 vasculature에 의해 오염을 배제하기 위해 thrombomodulin의 표현은 뇌 28를 제외한 모든 혈관 침대로 표현되는, 테스트 할 수 있습니다. 흥미롭게도, 다른 뇌 영역에서 격리 불후의 microvascular 내피 세포 라인 프로 염증성 자극에 자신의 장벽 속성과 민감도에 차이가 있습니다. 예를 들어, 뇌성 cEND과 소뇌 cerebEND 셀 라인 4,5 언급 할 수 있습니다. CerebEND는 비교에서 보여주요 긴밀한 연결 구성 요소 claudin-1과 occludin의 낮은 표현 수준을 cEND합니다. 그러나, claudin-3 -12의 수준 cerebEND의 상위 있었다. cerebEND 세포의 장벽 기능은 cEND 세포의 장벽 속성은 5 것보다 TNFα 염증 중재자과 치료, 아래 훨씬 더 고통. 염증 자극에 높은 소뇌 취약점은 다발성 경화증 환자와 뇌척수염 29 면역의 동물 모델 실험에서 생체에서 관찰 할 수 있습니다. 이러한 흥미로운 연구 결과는 뇌에 타겟 미래의 약물을 개선하기 위해, 생성하고 다른 뇌 영역에 대한 체외 모델에서 개인을 특징의 필요성을 보여줍니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> 소 혈청 알부민 (BSA) </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> A7906 </td><td> 순도&gt; 98% </td></tr><tr><td> 콜라겐 IV </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> C5533 </td><td> 50 ㎜ 아세트산 50 μg / ML </td></tr><tr><td> Collagenase / Dispase </td><td> 로슈 </td><td> 10269638001 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco의 수정 이글 배지 (DMEM) </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> D5796 </td><td></td></tr><tr><td> 디메틸 sulfoxide (DMSO) </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> D2650 </td><td></td></tr><tr><td> 태아 혈청 (FCS) </td><td> PAA Laboratories의 </td><td> A15110-1333 </td><td> 최종 농도 10 %, 열 inactivated (56시 30 분 ° C) </td></tR&gt; <tr><td> L-글루타민 </td><td> Biochrom AG </td><td> K0282 </td><td> 저장 용량 : ≤ -15 ° C </td></tr><tr><td> 가상 Vitamine </td><td> Biochrom AG </td><td> K0373 </td><td> 저장 용량 : ≤ -15 ° C </td></tr><tr><td> NA-pyruvate </td><td> Biochrom AG </td><td> L0473 </td><td></td></tr><tr><td> Neomycin (G418) </td><td> PAA Laboratories의 </td><td> P11-012 </td><td></td></tr><tr><td> 비 필수 아미노산 (NEA) </td><td> Biochrom AG </td><td> K0293 </td><td> 4에 저장 ° C </td></tr><tr><td> Penicilin / 스트렙토 마이신 </td><td> Biochrom AG </td><td> A2212 </td><td> 저장 용량 : ≤ -15 ° C </td></tr><tr><td> 인산염은 염분 (PBS)를 버퍼 </td><td> Biochrom AG </td><td> L1825 </td><td></td></tr><tr><td> Polybrene (hexadimethrine 브롬화) </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> 107689 </td><td> PBS의 0.8 MG / ML, -20 ° C에서 저장 </td></tr><tr><td> Puromycin </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> P8833 </td><td></td></tr><tr><td> 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> Biochrom AG </td><td> L1825 </td><td> 0.05 %, PBS에 0.​​02 % EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td></tr></tbody></table>

generation of an immortalized murine brain microvascular endothelial cell line as an in vitro blood brain barrier model

상피 및 내피 세포 (EC)는 외부 및 내부 환경에서 조직을 보호 paracellular 장벽을 구축하고있다. EC의 구성하는 혈액 - 뇌 장벽 (BBB), astrocyte 최종 피트, pericytes 및 기초 멤브레인은 뇌 실질의 보호와 항상성에 대한 책임을지고 있습니다. 체외 BBB 모델에서 BBB의 구조와 기능을 공부하는 일반적인 도구가 세포 수준에서. 체외 BBB 모델에서 다른의 상당한 숫자는 지금까지 다른 실험실에서 연구에 설립되었습니다. 일반적으로 세포는 소, 돼지, 쥐 또는 마우스 뇌 조직 (빌헬름 외하여 검토 상세하게 설명 1.)에서 얻을 수 있습니다. 인간 조직 샘플은 실험실 또는 기업 2,3의 제한된 숫자 만 사용할 수 있습니다. 기본 셀 준비가 시간이 많이 걸릴 수 있으며 EC의 문화가 일괄 배치로 다를 수 있지만,의 설립은 EC 린에게 불후의에스 과학 관심의 초점이다. 여기, 우리는 신생아 마우스 뇌에서 불후의 두뇌 microvascular EC 라인을 수립하는 방법을 제시한다. 우리는 시약 및 솔루션에 사용 된 절차의 단계별 정보를 설명합니다. 우리 연구소에 의해 설립 방법에 4 내지 5 주 내에 균일 한 불후의 내피 세포 라인의 절연을 할 수 있습니다. 뇌 microvascular 내피 세포 라인 cEND 4 칭했다 (대뇌 피질에서)와 5 (소뇌 피질에서) cerebEND, 포스터의 실험실에서이 절차에 따라 격리 된 효과적으로 BBB의 다양한 생리 학적 및 병리학 과정의 설명에 사용되었습니다. cEND 및 cerebEND를 사용하여 이러한 세포가 글루코 코르티코이드 - 4,6-9에 응답하고 같은 TNFalpha 5,8 등 프로 선동적인 질문입니다 중재자에뿐만 아니라 에스트로겐 치료 10 명 보여주고 있습니다. 또한, 우리는 여러 SC의 병리학을 공부했습니다lerosis 11 EC 수준에서 hypoxia 12,13. cEND 및 cerebEND 라인 림프구 나 암 세포와 EC의 다른 자극 또는 상호 작용에 ECS의 BBB, 세포 응답의 구조와 기능을 공부하기에 좋은 도구로 간주 될 수 있습니다.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model at JoVE.com

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

이 방법은 마우스의 뇌에서 microvascular 내피 세포를 분리하고 불멸하게하다하는 방법에 대해 설명합니다. 우리는 뇌 조직, 소화 단계, 시딩하고 세포의 불멸화의 균질화부터 단계별로 절차를 설명합니다. 보통, 그것은 동질, 불후의 microvascular 내피 세포 라인을 얻기 위해 다섯 주 소요됩니다.

로 불후의 손쥐 뇌 Microvascular 내피 세포 라인의 생성<em&gt; 체외에서</em&gt; 혈액 뇌 장벽 모델

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The ...

generation-an-immortalized-murine-brain-microvascular-endothelial

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

18.7K 조회수.  University of Wurzburg. 이 방법은 마우스의 뇌에서 microvascular 내피 세포를 분리하고 불멸하게하다하는 방법에 대해 설명합니다. 우리는 뇌 조직, 소화 단계, 시딩하고 세포의 불멸화의 균질화부터 단계별로 절차를 설명합니다. 보통, 그것은 동질, 불후의 microvascular 내피 세포 라인을 얻기 위해 다섯 주 소요됩니다.

비디오: Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

초음파 혈액 - 뇌 장벽 파괴 및 망간 향상된 MRI를 사용하여 기능성 Neuroimaging

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

연구

신경과학

Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional complex of tight and adherens junctions. Together with other cell-types such as astrocytes or pericytes, they form the neurovascular unit (NVU), which specifically regulates the interchange of fluids, molecules and cells between the peripheral blood and the CNS. Through this complex and dynamic system BMECs are involved in various processes maintaining the homeostasis of the CNS. A dysfunction of the BBB is observed as an essential step in the pathogenesis of many severe CNS diseases. However, specific and targeted therapies are very limited, as the underlying mechanisms are still far from being understood. 
Animal and in vitro models have been extensively used to gain in-depth understanding of complex physiological and pathophysiological processes. By reduction and simplification it is possible to focus the investigation on the subject of interest and to exclude a variety of confounding factors. However, comparability and transferability are also reduced in model systems, which have to be taken into account for evaluation. The most common animal models are based on mice, among other reasons, mainly due to the constantly increasing possibilities of methodology. In vitro studies of isolated murine BMECs might enable an in-depth analysis of their properties and of the blood-brain-barrier under physiological and pathophysiological conditions. Further insights into the complex mechanisms at the BBB potentially provide the basis for new therapeutic strategies.
This protocol describes a method to isolate primary murine microvascular endothelial cells by a sequence of physical and chemical purification steps. Special considerations for purity and cultivation of MBMECs as well as quality control, potential applications and limitations are discussed.

Brain microvascular endothelial cells (BMEC) are interconnected by specific junctional proteins forming a highly regulated barrier separating blood and the central nervous system (CNS), the so-called blood-brain-barrier (BBB). The isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells, as discussed in this protocol, enables detailed in vitro studies of the BBB.

차 설치류 뇌 미세 혈관 내피 세포의 분리

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional ...

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the gold-standard experimental model to study basic neurophysiological mechanisms involved in the formation and maintenance of neuronal cell assemblies. However, in vitro studies have been limited to the recording of the electrophysiological activity generated by bi-dimensional (2D) neural networks. Nonetheless, given the intricate relationship between structure and dynamics, a significant improvement is necessary to investigate the formation and the developing dynamics of three-dimensional (3D) networks. In this work, a novel experimental platform in which 3D hippocampal or cortical networks are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are realized by seeding neurons in a scaffold constituted of glass microbeads (30-40 &#181;m in diameter) on which neurons are able to grow and form complex interconnected 3D assemblies. In this way, it is possible to design engineered 3D networks made up of 5-8 layers with an expected final cell density. The increasing complexity in the morphological organization of the 3D assembly induces an enhancement of the electrophysiological patterns displayed by this type of networks. Compared with the standard 2D networks, where highly stereotyped bursting activity emerges, the 3D structure alters the bursting activity in terms of duration and frequency, as well as it allows observation of more random spiking activity. In this sense, the developed 3D model more closely resembles in vivo neural networks.

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

In this work, a novel experimental model in which 3D neuronal cultures are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are built by seeding neurons in a scaffold made up of glass microbeads on which neurons grow and form interconnected 3D structures.

마이크로 전극 배열에 3D 엔지니어링의 연결을 문화의 인터페이스 : 혁신을<em&gt; 체외</em&gt; 실험 모델

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have validated the utility of this method for enhancing neuronal preservation and overall brain slice viability. The implementation of this technique by early adopters has facilitated detailed investigations into brain function using diverse experimental applications and spanning a wide range of animal ages, brain regions, and cell types. Steps are outlined for carrying out the protective recovery brain slice technique using an optimized NMDG artificial cerebrospinal fluid (aCSF) media formulation and enhanced procedure to reliably obtain healthy brain slices for patch clamp electrophysiology. With this updated approach, a substantial improvement is observed in the speed and reliability of gigaohm seal formation during targeted patch clamp recording experiments while maintaining excellent neuronal preservation, thereby facilitating challenging experimental applications. Representative results are provided from multi-neuron patch clamp recording experiments to assay synaptic connectivity in neocortical brain slices prepared from young adult transgenic mice and mature adult human neurosurgical specimens. Furthermore, the optimized NMDG protective recovery method of brain slicing is compatible with both juvenile and adult animals, thus resolving a limitation of the original methodology. In summary, a single media formulation and brain slicing procedure can be implemented across various species and ages to achieve excellent viability and tissue preservation.

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol demonstrates the implementation of an optimized N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. A single media formulation is used to reliably obtain healthy brain slices from animals of any age and for diverse experimental applications.

최적화 된 N를 사용 하 여 급성 뇌 조각의 준비-메 틸-D-glucamine 보호 복구 방법

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains brain homeostasis. The principal sites of the barrier are endothelial cells of the brain capillaries whose barrier function results from tight intercellular junctions and efflux transporters expressed on the plasma membrane. This function is regulated by pericytes and astrocytes that together form the neurovascular unit (NVU). Several neurological diseases such as stroke, Alzheimer&#39;s disease (AD), brain tumors are associated with an impaired BBB function. Assessment of the BBB permeability is therefore crucial in evaluating the severity of the neurological disease and the success of the treatment strategies employed.
We present here a simple yet robust permeability assay that have been successfully applied to several mouse models both, genetic and experimental. The method is highly quantitative and objective in comparison to the tracer fluorescence analysis by microscopy that is commonly applied. In this method, mice are injected intraperitoneally with a mix of aqueous inert fluorescent tracers followed by anesthetizing the mice. Cardiac perfusion of the animals is performed prior to harvesting brain, kidneys or other organs. Organs are homogenized and centrifuged followed by fluorescence measurement from the supernatant. Blood drawn from the cardiac puncture just before perfusion serves for normalization purpose to the vascular compartment. The tissue fluorescence is normalized to the wet weight and serum fluorescence to obtain a quantitative tracer permeability index. For additional confirmation, the contralateral hemi-brain preserved for immunohistochemistry can be utilized for tracer fluorescence visualization purposes.

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Here we present a mouse brain vascular permeability assay using intraperitoneal injection of fluorescent tracers followed by perfusion that is applicable to animal models of blood-brain barrier dysfunction. One hemi-brain is used for assessing permeability quantitatively and the other for tracer visualization/immunostaining. The procedure takes 5 - 6 h for 10 mice.

Vivo에서 혈액-뇌 장벽 침투성 분석 결과 사용 하 여 마우스에 붙일 추적기 표시

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier (BBB). Rats with induced ischemic stroke were established and used as in vivo models to investigate the functional integrity of the BBB. Spectrophotometric detection of Evans blue (EB) in the brain samples with ischemic injury could provide reliable justification for the research and development of novel therapeutic modalities. This method generates reproducible results, and is applicable in any laboratory without a need for special equipment. Here, we present a visualized and technical guideline on the detection of the extravasation of EB following induction of ischemic stroke in rats.

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

The overall goal of this procedure is to provide a highly reproducible technique for in vivo assessment of the blood-brain barrier disruption in rat models of ischemic stroke.

허 혈 성 뇌졸중의 쥐 모델에서 뇌혈관 장애의 비보에 평가

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier ...

A Preclinical Model to Assess Brain Recovery After Acute Stroke in Rats

The purpose of this study was to establish and validate an animal brain ischemia model in the recovery and sequela stages. A middle cerebral artery occlusion/reperfusion (MCAO/R) model in male Sprague-Dawley rats was chosen. By changing the rat&#39;s weight (260&#8722;330 g), the thread bolt type (2636/2838/3040/3043) and the brain infarct time (2-3 h), a higher Longa&#39;s score, a larger infarct volume and a greater model success ratio were screened using the Longa&#39;s score and TTC staining. The optimum model condition (300 g, 3040 thread bolt, 3 h brain infarct time) was acquired and used in a 1-90 day observation period after reperfusion via assessment of sensorimotor functions and infarct volume. At these conditions, the bilateral asymmetry test had a significant difference from 1 to 90 days, and the grid-walking test had a significant difference from 1 to 60 days; both differences could be a suitable sensorimotor functional test. Thus, the most appropriate condition of a novel rat model in the recovery and sequela stages of brain ischemia was found: 300 g rats that underwent MCAO with a 3040 thread bolt for a 3 h brain infarct and then reperfused. The appropriate sensorimotor functional tests were a bilateral asymmetry test and a grid-walking test.

The&#160;purpose of this study is to establish and validate an animal model for research in the recovery and sequela stages of brain ischemia by testing brain infarction and sensorimotor function after middle cerebral artery occlusion/reperfusion (MCAO/R) after 1-90 days in rats.

쥐에서 급성 뇌졸중 후 뇌 회복을 평가하는 전임상 모델

The purpose of this study was to establish and validate an animal brain ischemia model in the recovery and sequela stages. A middle cerebral artery ...

Whole Neonatal Cochlear Explants as an In vitro Model

Untreated hearing loss imposes significant costs on the global healthcare system and impairs individuals' quality of life. Sensorineural hearing loss is characterized by the cumulative and irreversible loss of sensory hair cells and auditory nerves in the cochlea. Entire and vital cochlear explants are one of the fundamental tools in hearing research to detect hair cell loss and to characterize the molecular mechanisms of the inner ear cells. Many years ago, a protocol for neonatal cochlear isolation was developed, and although it has been modified over time, it still holds potential for improvement. 
This paper presents an optimized protocol for isolating and culturing whole neonatal cochlear explants in multi-well culture chambers that enables the study of hair cells and spiral ganglion neuron cells along the entire length of the cochlea. The protocol was tested using cochlear explants from mice and rats. Healthy cochlear explants were obtained to study the interaction between hair cells, spiral ganglion neuron cells, and the surrounding supporting cells. 
One of the main advantages of this method is that it simplifies the organ culture steps without compromising the quality of the explants. All three turns of the organ of Corti are attached to the bottom of the chamber, which facilitates in vitro experiments and the comprehensive analysis of the explants. We provide some examples of cochlear images from different experiments with live and fixed explants, demonstrating that the explants retain their structure despite exposure to ototoxic drugs. This optimized protocol can be widely used for the integrative analysis of the mammalian cochlea.

Whole Neonatal Cochlear Explants as an In vitro Model

The current protocol updates previous protocols and incorporates relatively straightforward approaches for culturing high-quality cochlear explants. This provides reliable data acquisition and high-resolution imaging in live and fixed cells. This protocol supports the ongoing trend of studying inner ear cells.

체외 모델로서의 전체 신생아 인공와우 이식

Untreated hearing loss imposes significant costs on the global healthcare system and impairs individuals' quality of life. Sensorineural hearing loss is ...

세포 장벽 무결성을 평가하기 위한 경내피 저항성 측정

Barrier Functional Integrity Recording on bEnd.3 Vascular Endothelial Cells via Transendothelial Electrical Resistance Detection

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic physiological structure composed of microvascular endothelial cells, astrocytes, and pericytes. By coordinating the interaction between restricted transit of harmful substances, nutrient absorption, and metabolite clearance in the brain, the BBB is essential in preserving central nervous system homeostasis. Building in vitro models of the BBB is a valuable tool for exploring the pathophysiology of neurological disorders and creating pharmacological treatments. This study describes a procedure for creating an in vitro monolayer BBB cell model by seeding bEnd.3 cells into the upper chamber of a 24-well plate. To assess the integrity of cell barrier function, the conventional epithelial cell voltmeter was used to record the transmembrane electrical resistance of normal cells and CoCl2-induced hypoxic cells in real-time. We anticipate that the above experiments will provide effective ideas for the creation of in vitro models of BBB and drugs to treat disorders of central nervous system diseases.

저자 스포트라이트: 세포 장벽 무결성을 평가하기 위한 TEER 검출의 응용 

This protocol describes a dependable and efficient in vitro model of the brain blood barrier. The method uses mouse cerebral vascular endothelial cells bEnd.3 and measures transmembrane electrical resistance.

경내피 전기 저항 검출을 통한 bEnd.3 혈관 내피 세포의 장벽 기능 무결성 기록

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic physiological structure composed of microvascular endothelial cells, astrocytes, and pericytes. By coordinating ...