This work was supported by DFG Schwerpunktprogramm 1392 (project MA 4113/2-2), cluster of Excellence and DFG Research Center Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain (project B1-9), and the German Ministry of Research and Education (BMBF; project 1364480).

참고 : 동물 실험 윤리에 대한 괴팅겐 대학위원회의 승인을 동물 취급 및 실험을 수행 하였다. 악기와 피펫 제조 1. 준비 <ol><li> 전기 설치는 큰 작동 거리와 실체 현미경으로 구성되어 있으며 사용 된 염료 형광 조명 및 필터 세트가 장착되어 있는지 확인합니다. </li><li> 전기를위한 전용 단일 세포 electroporator 또는 오실로스코프에 부착 된 일반적인 사각 펄스 발생기를 사용합니다. 피펫 홀더와 목욕 전극에 electroporator 출력을 연결합니다. 마이크로 피펫 홀더 및 목욕 전극에 음의 단자에 펄스 발생기의 양극 단자를 연결한다. 피펫 홀더 및 목욕 전극 모두 염화은의 얇은 층으로 코팅은 와이어를 포함하는 확인. </li><li> 정확한 위치 할 수 있도록 미세 조작기에 피펫 홀더를 탑재합니다. </li&gt; <li> 내부 필라멘트와 붕규산 유리 모세관에서 전기의 마이크로 피펫을 제작합니다. </li><li> 수평 마이크로 피펫 풀러를 사용 Bestman 등. (13)에 의해 설명 된대로 패치 클램프 실험 피펫의 제조를 위해 수정 된 프로토콜을 적용 할 수 있습니다. </li><li> 긴 생크 및 단일 세포에 대한 전기 천공 15-20 옴의 높은 저항 피펫 결과 작아 선단 구를 생산하는 파라미터를 적응. 피펫 저항은 세포의 그룹의 표시를 위해, 3-4 옴, 예를 들어, 낮아야한다. </li><li> 전용 단일 셀 electroporator로 피펫 저항 직접 측정 또는 정의 전압 펄스의인가 후에 오실로스코프로 전류를 측정하여 오옴의 법칙으로 계산. </li></ol> 일렉트로 솔루션 2. 준비 <ol><li> 개구리 벨소리 (98 mM의 NaCl을, 2 mM의 KCl을에 형광 결합 된 덱스 트란을 녹이고, 1 mM의 염화칼슘 2, 2 mM의 MGC2 리터, 3 mM의 농도의 5 mM의 포도당, pH를 7.8로 조정하고 5 mM의 나트륨 피루 베이트, 10 mM의 HEPES, 삼투압은 mOsmol / l 230이었다). 낮은 염료 농도가 사용되는 경우 세포는 매우 밝게 표시되지 않을 수 있습니다. 대량의 원액을 준비하고 작은 분취 량으로 나눈다. 저장 (개월간 안정)을 위해 그들을 동결. 참고 : 덱스 트란은 서로 다른 크기와 배출 / 여기 스펙트럼의 다양한 사용할 수 있습니다. (예를 들어, 알렉사 488 덱스 트란 10kD, 알렉사 546 - 덱스 트란 10kD, 알렉사 568 - 덱스 트란 10kD, 알렉사 594 - 덱스 트란 10kD, TMR-덱스 트란 3kD). </li><li> 덱스 트란 용액 (5 μL)의 작은 부피와 긴 피펫 팁으로 마이크로 피펫 백필. 조심스럽게 피펫 팁에서 잔류 기포를 제거하기 위해 손가락으로 마이크로 피펫을 가볍게. </li><li> 피펫 홀더에 마이크로 피펫을 탑재합니다. 피펫 내부의 실버 와이어는 염료 용액과 접촉에 있는지 확인하십시오. </li></ol> 애벌레 X의 3. 선택 laevis의 &lt;/ EM&gt; <ol><li> X의 흰둥이 유충을 사용하여 실험 laevis의. 야생형 동물 공 초점 / 다 광자 영상화 동안 자기 형광 발광 표시하므로 기재된 실험에 적합하지 않은 안료 채워진 melanophores을 갖는다. </li><li> Nieuwkoop 및 페이버 (14) 후 premetamorphotic 올챙이 단계입니다. 실험 단계 45-53의 올챙이를 선택합니다. </li></ol> 형광 결합 된 덱스 트란 4. 일렉트로 <ol><li> 페트리 접시에서 조직의 작은 조각을 놓고 (pH 7로 조정 에틸 3- 벤조 에이트 메탄) 0.02 %의 tricaine를 포함하는 물을 작은 볼륨으로 커버. </li><li> 0.02 %의 tricaine를 포함하는 물에 올챙이를 마취. 몇 분 후 동물 이동 중지. 올챙이를 터치하여 적절한 마취를 확인합니다. 그들은 비 응답해야합니다. </li><li> 조심스럽게 조직 덮여 페트리 접시에 마취에서 올챙이를 전송합니다. </li><li> 반드시 목욕 ELECTR 확인ODE는 전기 회로를 닫습니다. 전극이 젖은 조직과 접촉에 있는지 확인; 올챙이에 직접 접촉 할 필요가 없습니다. </li><li> 미세 조작기를 이용하여 후각 기관에 마이크로 피펫 팁 가까이 놓습니다. </li><li> 피펫 팁과 후각 기관을 덮고있는 피부에 침투 조심스럽게 주 후각 상피 또는 골비 상피 세포의 중앙에 위치한 감각 신경 층으로 끝을 진행합니다. </li><li> 감각 신경에 염료를 전송하는 데 긍정적 인 정사각형 전압 펄스를 트리거합니다. 하나의 전압 펄스를 적용 (예., 25 V, 펄스 길이 25 밀리 초) 또는 복수의 펄스에 (예., 50 V, 펄스 길이 300 마이크로 초, 200 Hz에서 400 밀리 기차 시간). 라벨의 확장 요구에 대한 최적의 전압 펄스 매개 변수를 결정합니다. 표지화 된 세포의 수를 낮추기 위해 전압 펄스 진폭, 지속 시간 및 반복 횟수를 줄인다. P의 높은 전압의 펄스 진폭, 기간 및 횟수를 적용널리 보급 된 라벨에 대한 ulses. </li><li> 실체 현미경의 형광 조명을 사용하여 트리거 펄스에 의해 성공적으로 염료 압출 및 전기를 시각화. 염료는 성공적인 전기 후 세포체와 수상 돌기로 빠르게 확산됩니다. </li><li> 반복 올챙이의 두 번째 후각 기관에 대한 4.5-4.9 단계를 반복합니다. </li><li> 복구를 위해 신선한 물이 가득 비커에 올챙이를 전송합니다. 약 후 5 분은 올챙이가 마취에서 깨어나 정상적인 수영 운동을 시작합니다. </li><li> 24 시간 후 일렉트릭 염료는 감각 신경에 퍼져 결국 축삭 수송을 통해 후각 망울에 도달합니다. </li></ol> 세포와 축삭 프로세스의 생체 시각화 5. 설치 동물 <ol><li> 0.02 %의 tricaine를 포함하는 물에 올챙이를 마취. </li><li> 조심스럽게 예를 들어, 영상 실,에 올챙이를 전송, 작은 실리콘 고무는 올챙이 크기의 홈에 페트리 접시에 덮여있다. &lt;/ 리&gt; <li> 파라 필름의 스트라이프에 작은 사각형을 잘라. 컷 아웃 창을 통해 노출 된 전방 telencephalon를 떠나, 파라 필름과 올챙이를 커버. 올챙이를 손상없이 접시에 바늘 파라 필름을 고정합니다. </li><li> 올챙이가 0.​​02 %의 tricaine을 포함하는 충분한 물에 잠긴되어 있는지 확인합니다. </li><li> 수직 광자 현미경 공 초점 현미경의 무대에서 이미징 챔버를 탑재합니다. </li><li> 후각 망울의 이미지의 3 차원 스택을 획득. 이미지를 만드는 절차는 가능한 한 짧게하고 10 ~ 15 분을 초과하지 않도록하십시오. </li><li> 별도의 탱크에 일반 물에 올챙이를 돌려 빛에 노출되는 것을 방지. 5 분 후, 올챙이는 마취에서 깨어. </li><li> 반복, 지정된 시간 간격 후 5.1-5.7 단계를 예. 매일. </li></ol> 세포와 축삭 프로세스의 전의 VIVO 시각화 6. 설치 동물 <ol><li> 다른 섹션 5프로토콜의 레이블이 감각 신경을 시각화하기 위해 절제 뇌의 준비를 사용합니다. </li><li> 마취와 척수로의 전환에 뇌의 절개하여 올챙이를 죽일. 후각 기관, 후각 신경과 앞쪽에 telencephalon을 포함하는 조직의 블록을 절제. </li><li> 개구리 링거 용액에 조직 블록을 전송하고 두뇌의 복부 측면을 노출 미세 가위로 결합 조직을 제거합니다. </li><li> 촬상 챔버 조직 블록을 전송하고 나일론 스레드 현악기 백금 프레임 고칠. </li><li> 공 초점 / 다 광자 현미경의 무대에서 이미징 챔버를 탑재합니다. </li><li> 후각 망울의 이미지의 3 차원 스택을 획득. </li></ol> 7. 이미지 처리 및 데이터 평가 <ol><li> 쿠페, P. 등에 의해 기술 된 바와 같이 최적화하고 이미지 품질과의 연결 구조의 시각화를 개선하기 위해 필터링을 로컬이 아닌 수단에 적용된다. 15. 참고 : 라이브 표본의 깊은 조직 층에 영상 실험의 데이터는 종종 시끄러운. </li><li> 개요에 대한 이미지 스택의 최대 강도 예측을 만듭니다. </li><li> 시간 경과를 들어 이미징 실험은 감각 뉴런의 단일 명백하게 식별 축삭 대한 데이터 세트를 화면. </li><li> 펭 등 알에 의해 설명 된대로 신경 프로세스의 소프트웨어를 이용한 추적을 통해 세포의 형태를 재구성. (16). </li></ol>

<ol>
	<li>Huard, J. M., Youngentob, S. L., Goldstein, B. J., Luskin, M. B., Schwob, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+olfactory+epithelium+contains+multipotent+progenitors+that+give+rise+to+neurons+and+non-neural+cells.">Adult olfactory epithelium contains multipotent progenitors that give rise to neurons and non-neural cells.</a> J. Comp. Neurol. 400 (4), 486-4810 (1998).</li><li>Schwob, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+regeneration+and+the+peripheral+olfactory+system.">Neural regeneration and the peripheral olfactory system.</a> Anat. Rec. 269 (1), 33-49 (2002).</li><li>Leung, C. T., Coulombe, P. A., Reed, R. 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The authors have nothing to disclose.

여기에 설명 된 실험 절차 유생 X.의 후각 기관의 라벨링 감각 뉴런을 허용 형광 결합 된 덱스 트란과 살아있는 동물에서 감각 축삭의 성장 이후의 시각화의 전기에 의해 laevis의. 생체 내 전기 천공의 파라미터를 변화시킴으로써 표지화 감각 뉴런의 수를 제어 할 수있다. 그것은 거의 또는 단일 셀 감각 상피의 신경 세포의 큰 그룹 레이블을 억제 할 수있는 효과가있다. 이 마이크로 피펫 특성과 전기 펄스에 대해 특히주의하는 것이 중요하다 신경 라벨의 확장 원하는 보장합니다. 높은 피펫 저항 및 전압 펄스 진폭, 지속 시간 및 반복 횟수의 감소는 더 광범위 라벨링 이어질 수 피펫 저항 및 높은 전압 펄스 진폭, 지속 시간 및 펄스의 개수를 감소시키는 반면, 표지화 된 세포의 양을 줄일 수있다. 목전기에 대한 형광 덱스 트란의 전자 사용은 적용되는 설정이 적절한 경우에 즉각적인 시각적 피드백을 제공합니다. 주의 그 진폭, 기간 및 잠재적으로 세포 손상으로 이어질이나 사망 17 셀 수있는 프로토콜에서 제공하는 값을 초과 펄스 수에 대한 매개 변수를 사용하여. 마이크로 피펫의 막힘 또는 파손 팁도 성공적으로 전기를 방해 할 수 있습니다. X의 후각 기관에서 생체 전기에서 postmetamorphotic 개구리의 피부는 강인하고 쉽게 마이크로 피펫으로 침투 할 수 없기 때문에 laevis의 유생 단계로 제한됩니다. 신경 프로세스 생체 가시화 깊은 뇌 영역 또는 혈관에 의해 여기 / 발광 빛의 산란에 의해 방해 될 수있다. 이 문제는 더 큰 뇌에 더 높은 유생 단계에서 특히 분명하게 미세 축삭 프로세스의 명확한 식별이 더 어려워 노이즈 신호가 발생할 수 있습니다. <p= &quot;jove_content&quot;&gt; 제시된 프로토콜은 허가 클래스는 전체 세포 패치의 라벨처럼, 동물을 해부 라벨 동안 세포를 손상, 조직 슬라이스를 준비하거나 다른 방법에 필요한 조직을 고정하지 않고 그대로 후각 시스템의 감각 신경을 시각화 -clamp 실험 18. 생체 시간 경과 이미징 또는 몇 번의 감각 뉴런의 라벨링을 결합 할 때, 긴 시간 간격 동안 하나의 성숙한 감각 뉴런의 사구체 연결을 시각화 할 수있다. 이 방법은 여러 주 동안 미성숙 감각 뉴런의 축삭 돌기 패턴의 발전을 모니터 할 수도있다. 그것은 살아있는 동물에서 하나의 축삭의 성장 패턴을 모니터링 할 수 있습니다으로이 후자의 옵션은 특히 흥미 롭다. 이 축삭지도와 길 찾기를 제어 세포 및 분자 메커니즘을 조사 할 수있는 가능성을 엽니 다. 후각 수용체 발현을 포함하여 여러 가지 요인, 각종 AXOn 개의 안내 분자 및 후각 감각 뉴런의 유도 / 운동량은 감각 신경 축삭 4,5의 목표 발견을 조절하는 것으로 나타났다. 프로토콜 어플리케이션은 후각 감각 뉴런에 한정되지 않고, 또한 예를 들어, 다른 세포 유형을 연구하기 위해 적용될 수있다., 뇌 발달 또는 후각 망울의 승모판 세포의 신경성 영역 / 전구 줄기 세포. 또한 증명 기술은 또한 신경 세포 표지 및 / 또는 연결된 회로 7,19 대한 기능적 정보를 얻을 막 투과성 칼슘 염료를 칼슘 민감성 덱스 트란과 병용하거나 주입 할 수있다. 덱스 트란에 결합 된 형광 물질의 광범위한 이용 가능성은 복수의 개별 셀 또는 다른 색 개체군 표지를 허용한다. 또한 형광 단백질 예 인코딩 DNA 용액을, 플라스미드, 전기 천공에 적합하고 더욱 versatili을 향상시킬 수있다타이 및 기술 (6)의 유용성. 프로토콜은 또한 덱스 트란 및 DNA 또는 청구 morpholinos의 결합 된 전기는 유전자 발현 (13 및 17)를 조작 할 수 있도록 향상 될 수있다. 한 방법은 확실히 복잡하고 척추 동물의 후각 시스템의 축삭 지침을 조절 아직 완전히 이해되지 프로세스를 조사 할 수있는 새로운 도구를 나타냅니다.

The lifelong turnover of sensory neurons distinguishes the olfactory system from many other sensory and neuronal systems1,2. Newly formed sensory neurons are continuously generated in the basal portion of the olfactory epithelium3 and extend their axons into the olfactory bulb, the first relay station of the olfactory system4. However, the cellular and molecular mechanisms controlling the formation and maintenance of the olfactory map are far from being fully understood4,5.
Here, we describe a protocol for labeling sensory neurons of the olfactory organ of larval X. laevis by in vivo electroporation of fluorophore-coupled dextrans. The presented protocol allows visualization of axonal morphology and connectivity, track axonal development over time and study mechanisms regulating axonal wiring and guidance.
Electroporation is a well established method to introduce charged macromolecules, like dextran-coupled dyes and DNA, into cells6,7. The cell membrane is permeabilized by application of short voltage pulses and the molecules are electrophoretically delivered into the cytosol8. Spatially restricted electroporation using a micropipette permits selective labeling of cells including neurons and has been applied in various neuronal systems including the visual system of X. laevis9,10.
We show how the electroporated animals can be used to study axonal growth patterns and morphology in living animals using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. The described procedure allows identifying the coarse topology of axonal projections of sensory neurons of the main and accessory olfactory system11,12. Using in vivo time lapse imaging, it is also suitable to supervise the glomerular connections of single mature sensory neurons, and to monitor the evolution of the axonal projection patterns of immature sensory neurons12. The described protocol can be applied to investigate the structure and formation of olfactory circuits in the intact animal and can be adapted to other cell types within the olfactory and other neuronal systems.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="589">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:100px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">SZX16</td>
			<td style="width:100px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">stereomicroscope with fluorescent illumination</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Axon Axoporator 800A</td>
			<td style="width:100px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">single cell electroporator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">ELP-01D</td>
			<td style="width:100px;">npi electronic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">electroporator</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">MMJ</td>
			<td style="width:100px;">M&#228;rzh&#228;user Wetzlar</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">manual micromanipulator</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">P-1000</td>
			<td style="width:100px;">Sutter</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Horizontal micropipette puller</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:203px;">G150F-4</td>
			<td style="width:100px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">glass capillaries for electroporation pipette fabrication; internal filament makes backfilling easier</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Alexa 488-dextran 10kD</td>
			<td style="width:100px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D22910</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Alexa 546-dextran 10kD</td>
			<td style="width:100px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D22911</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Alexa 568-dextran 10kD</td>
			<td style="width:100px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D22912</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Alexa 594-dextran 10kD</td>
			<td style="width:100px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D22913</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">TMR-dextran 3kD (micro-Ruby)</td>
			<td style="width:100px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D7162</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">microloader pipette tips</td>
			<td style="width:100px;">eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">930001007</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:203px;">tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)</td>
			<td style="width:100px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E10521</td>
			<td style="width:167px;">anesthetic; use gloves</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">A1-MP</td>
			<td style="width:100px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">multiphoton microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">LSM 780</td>
			<td style="width:100px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Imaris</td>
			<td style="width:100px;">Bitplane</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">alternative software for neuronal tracing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the olfactory system as a model to study axonal growth patterns and morphology in vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

설명 된 프로토콜이 성공적으로 전기 및 마취 X.의 후각 시스템의 감각 뉴런의 축삭 프로세스 생체 시각화 적용될 수있다 laevis의, 공 초점 레이저 스캐닝 또는 광자 현미경 (그림 1)를 사용하여. 전기는 형광 결합 된 덱스 트란 입력하고 빠르게 후각 기관의 세포 내부에 확산 할 수 있습니다. 이것은 전압 펄스 트리거링 후 성공적인 라벨을 확인하는 형광 조명을 적용하는 것이 도움이된다. , 전기 파라미터들에 따라 예를 들면., 피펫 저항은, 세포 (도 2A, B) 또는 후각 기관의 단셀 (도 2c)의 그룹이 표시되어있다. 표시된 감각 뉴런의 축삭은 후각 신경 (그림 2D)으로 시각화 할 수 있으며 축삭 프로세스는 성공적인 전기 후, 후각 망울도 보통 24 시간을 관찰 할 수있다(그림 3). 감각 뉴런의 그룹 일렉트로는 후각 망울 (도 3a)에서 거친 배선 패턴을 시각화 허용한다. 단세포 전기 천공은 후각 망울 (도 3C-E)에서 사구체 구조 개별 축색 돌기 패턴, 축삭 분기점 및 연결성을 조사하기 위해 적용될 수있다. X의 투명 흰둥이 올챙이 생체 공 초점 또는 마취 올챙이의 그대로 뇌에 표시된 감각 뉴런의 광자 이미징 laevis의 허가. 동일한 표지 감각 뉴런 (도 4)의 생체 내에서 반복하여 시각화 축삭 성장 패턴의 개발은 며칠 / 주에 걸쳐 추적 될 수있다. 후각 망울의 축삭 패턴이 상당히 달라질 수 일렉트로 시점 감각 신경 세포의 성숙에 따라. 성숙한 신경 세포는 이미 술을 특징으로 정교한 축삭 가지를 가지고사구체에 연결 ED 지역. 성숙한 신경 세포의 축삭의 성장 패턴은 오히려 안정적이지만, 축삭 분기 및 사구체 터프 개선의 신장 (그림 4A-E) 관찰 할 수 있습니다. 감각 뉴런, 연장 된 시간 기간 동안 생체 내에서 관찰 할 수있다 예를 들어., 이상 3 주 이상 (도 4F-I). 한편, 미성숙 신경 축색은 터프 arborizations를 가지지 않는, 초기 성장 과정에 여전히 아직 최종 사구체 타겟에 연결되지 않았다. 실험적 프로토콜은 성숙 동안 이러한 뉴런의 발달을 추적 가능 예., 축삭 신도 분기점 터프 arborizations (도 4J-L)의 확립. 더 예를 들어도 Hassenklöver과 만지니 (12)을 참조하십시오. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52143/52143fig1highres.jpg" width="500"/&gt; 마취 X의 후각 기관의 실험 프로토콜의 그림 1. 개요도. (A) 주 후각 상피의 감각 신경 세포 (MOE) 또는 서 골비 기관 (VNO) laevis의 유충은 형광 덱스 트란 용액을 가득 유리 피펫을 사용하여 전기로 표시되어 있습니다. 표지 된 신경 세포의 축삭은 후각 신경 (ON)을 통해 다음과 결국 후각 망울 (OB)에 도달. (B) 올챙이는 마취 및 레이블 뉴런을 반복해서 특정 시간 간격으로 공 초점 또는 다 광자 현미경을 사용하여 조사 하였다 할 수있다. (C)라고 표시된 세포의 축삭의 성장 패턴의 점증 적 개발은 주 일의 시간 범위에 걸쳐 올 수 있습니다. <img alt="그림 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52143/52143fig2highres.jpg" width="500" /> 그림 2. 선거법후각 기관에서 감각 신경의 troporation. 낮은 저항 피펫으로 (A) 일렉트로는 후각 기관의 여러 세포의 라벨링에 연결됩니다. 이 대표적인 예에​​서 다수의 후각 수용체 뉴런 (ORNs, 작성 화살촉)와 두 개의 기둥 모양의 세포를 지원 SCS (별표) 염색 하였다. 점선은 피펫 저항을 증가, 표지화 된 세포의 수를 제한하고, 후각 상피 (OE). (B) 전기 파라미터를 정제, 예를 들면.의 경계를 구별. 이 예에서, 하나의 감각 신경 세포 (작성 화살촉)와 하나의 인접한지지 세포 (별표)는 전기 후 염색 하였다. 후각 상피 (오픈 화살촉)를 떠나 하나의 축삭을합니다. (C)을 성공적으로 단일 세포 전기 개별 감각 신경 세포 (채워진 화살표) 및 후각 상피의 연결 축삭 (오픈 화살촉)의 독점적 인 라벨로 이어집니다. <strong&gt; (D) 단일 레이블 축삭 (오픈 화살촉)는 후각 망울로 후각 신경 (ON)을 통해 올 수 있습니다. <img alt="그림 3" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/52143/52143fig3highres.jpg" width="400" /> 그림 3. 절제 후각 망울의 후각 축삭 돌기를 시각화. (A) 후각 망울에서 감각 신경의 축삭 돌기의 거친 토폴로지는 낮은 저항 전기 피펫을 사용하여 시각화 할 수 있습니다. 하나의 후각 망울의 반구와 관련 후각 신경 (ON)이 그려져있다. 다른 형광 물질에 결합 된 네 덱스 트란이 후각 기관의 네 먼 위치에서 일렉트로되었다 : 횡 (녹색), 중간 (노란색), 환경부 (적색)과 VNO (오렌지)를 내측. 이것은 액세서리 후각 망울 (AOB) 및 메인 후각 망울 (MOB)의 세 가지 주요 투영 필드를 시각화한다. <str옹&gt; (B) 후각 망울의 구조에 중첩 단일 후각 감각 뉴런의 다른 축삭의 성장 패턴. 묘사는 다른 애벌레 표본에서 파생 된 여러 개의 단일 세포의 염색의 3 차원 재구성을 결합됩니다. 후각 망울로 돌출 된 구형 사구체 (작성 화살촉)에서 술을 arborizations / 시냅스를 형성하는 하나의 후각 축삭 (CE) 예. X에서 그 주 후각 축삭이 (작성 화살촉이, 또한 Hassenklöver 및 만지니 12 참조) 한 개, 두 개 또는 여러 개의 사구체에 연결하기 전에 정기적으로 (오픈 화살촉을) 두 갈래 laevis의. <img alt="그림 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52143/52143fig4highres.jpg" width="500" /> 단일 후각 신경 세포의 축삭의 생체 시간 경과 영상에서 그림 4. (AE)성공적인 단일 세포 전기 후 레이블 축삭 반복 후각 망울 (OB)으로 시각화 할 수 있습니다. 이 예는 일주일 동안 조사 된 개별 축삭을 보여줍니다. 전체적인 형태는 현저하게 변경되지 않으며, 두 개의 주요 분기점 삭제 (오픈 화살촉) 식별 될 수있다. 다른 두 사구체 다발 안정 (별표)를 유지하는 반면 시간의 과정을 통해, 하나의 사구체 술이 지속적으로 감소 (채워진 화살표)를 거쳐 있습니다. (FI)이 대표적인 예는 장기적인 관찰의 가능성을 보여줍니다이 특정 축삭을 조사 하였다으로 3 주 이상합니다. 성장 패턴의 어떠한 명백한 변화가 검출 될 수 없다. (JL)은 성장 과정에서 미성숙 감각 축삭의 예가 도시된다. 그것은 아직 사구체하고 특성 사구체 깃이없는 연결되지 않았습니다. 축삭 가지가 가늘고 긴 오일 후, 축삭은 여러 번 미세 arborizations은 두 갈래로 갈라설립했다.

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The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

모델로 후각 시스템은 축삭 성장 패턴 및 형태를 연구하는<em&gt; 생체</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

10.8K 조회수.  University of Göttingen. We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

비디오: The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of Alzheimer's disease (AD) and is found in Lewy body dementia, inclusion body myositis and cerebral amyloid angiopathy 1-4. Amylopathies progressively develop with time. For this reason simple organisms with short lifespans may help to elucidate molecular aspects of these conditions. Here, we describe experimental protocols to study A&beta;-mediated neurodegeneration using the worm Caenorhabditis elegans. Thus, we construct transgenic worms by injecting DNA encoding human A&beta;42 into the syncytial gonads of adult hermaphrodites. Transformant lines are stabilized by a mutagenesis-induced integration. Nematodes are age synchronized by collecting and seeding their eggs. The function of neurons expressing A&beta;42 is tested in opportune behavioral assays (chemotaxis assays). Primary neuronal cultures obtained from embryos are used to complement behavioral data and to test the neuroprotective effects of anti-apoptotic compounds.

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

We describe methods to study aspects of amylopathies in the worm C. elegans. We show how to construct worms expressing human A&beta;42 in neurons and how to test their function in behavioral assays. We further show how to obtain primary neuronal cultures that can be used for pharmacological testing.

<em&gt; Caenorhabditis의 엘레</emAmylopathy 연구에 대한&gt; 모델 시스템

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

연구

신경과학

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

소뇌 과립 신경 세포의 유전자 조작<em&gt; 체외</em&gt;와<em&gt; 생체</em&gt; 신경 세포의 형태와 마이그레이션을 연구하는

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

본래 Vomeronasal 기관 및 액세서리 후각 망울의 생체 준비

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Microglia as a Surrogate Biosensor to Determine Nanoparticle Neurotoxicity

Nanoparticles found in air pollutants can alter neurotransmitter profiles, increase neuroinflammation, and alter brain function. Therefore, the assay described here will aid in elucidating the role of microglia in neuroinflammation and neurodegenerative diseases. The use of microglia, resident immune cells of the brain, as a surrogate biosensor provides novel insight into how inflammatory responses mediate neuronal insults. Here, we utilize an immortalized murine microglial cell line, designated BV2, and describe a method for nanoparticle exposure using silver nanoparticles (AgNPs) as a standard. We describe how to expose microglia to nanoparticles, how to remove nanoparticles from supernatant, and how to use supernatant from activated microglia to determine toxicity, using hypothalamic cell survival as a measure. Following AgNP exposure, BV2 microglial activation was validated using a tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;) enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). The supernatant was filtered to remove the AgNP and to allow cytokines and other secreted factors to remain in the conditioned media. Hypothalamic cells were then exposed to supernatant from AgNP activated microglia and survival of neurons was determined using a resazurin-based fluorescent assay. This technique is useful for utilizing microglia as a surrogate biomarker of neuroinflammation and determining the effect of neuroinflammation on other cell types.

Microglia (immune cells of the brain), are used as a surrogate biosensor to determine how nanoparticles influence neurotoxicity. We describe a series of experiments designed to assay microglial response to nanoparticles and exposure of hypothalamic neurons to supernatant from activated microglia to determine neurotoxicity.

나노 입자 신경 독성을 결정하는 대리 바이오 센서로 미세 아교 세포

Nanoparticles found in air pollutants can alter neurotransmitter profiles, increase neuroinflammation, and alter brain function. Therefore, the assay ...

A Free-breathing fMRI Method to Study Human Olfactory Function

The study of human olfaction is a highly complex and valuable field with applications ranging from biomedical research to clinical evaluation. Currently, evaluation of the functions of the human central olfactory system with functional magnetic resonance imaging (fMRI) is still a challenge because of several technical difficulties. There are some significant variables to take into account when considering an effective method for mapping the function of the central olfactory system using fMRI, including proper odorant selection, the interaction between odor presentation and respiration, and potential anticipation of or habituation to odorants. An event-related, respiration-triggered olfactory fMRI technique can accurately administer odorants to stimulate the olfactory system while minimizing potential interference. It can effectively capture the precise onsets of fMRI signals in the primary olfactory cortex using our data post-processing method. The technique presented here provides an efficient and practical means for generating reliable olfactory fMRI results. Such a technique can ultimately be applied in the clinical realm as a diagnostic tool for diseases associated with olfactory degeneration, including Alzheimer&#39;s and Parkinson&#39;s disease, as we begin to further understand the complexities of the human olfactory system.

We present the technical challenges and solutions for obtaining reliable functional magnetic resonance imaging (fMRI) data from the human central olfactory system. This includes special considerations in olfactory fMRI paradigm design, descriptions of fMRI data acquisition with an MRI-compatible olfactometer, odorant selection, and a special software tool for data post-processing.

인간의 후각 기능을 연구하기위한 자유 호흡 fMRI 방법

The study of human olfaction is a highly complex and valuable field with applications ranging from biomedical research to clinical evaluation. Currently, ...

Facial Nerve Surgery in the Rat Model to Study Axonal Inhibition and Regeneration

This protocol describes consistent and reproducible methods to study axonal regeneration and inhibition in a rat facial nerve injury model. The facial nerve can be manipulated along its entire length, from its intracranial segment to its extratemporal course. There are three primary types of nerve injury used for the experimental study of regenerative properties: nerve crush, transection, and nerve gap. The range of possible interventions is vast, including surgical manipulation of the nerve, delivery of neuroactive reagents or cells, and either central or end-organ manipulations. Advantages of this model for studying nerve regeneration include simplicity, reproducibility, interspecies consistency, reliable survival rates of the rat, and an increased anatomic size relative to murine models. Its limitations involve a more limited genetic manipulation versus the mouse model and the superlative regenerative capability of the rat, such that the facial nerve scientist must carefully assess time points for recovery and whether to translate results to higher animals and human studies. The rat model for facial nerve injury allows for functional, electrophysiological, and histomorphometric parameters for the interpretation and comparison of nerve regeneration. It thereby boasts tremendous potential toward furthering the understanding and treatment of the devastating consequences of facial nerve injury in human patients.

This protocol describes a reproducible approach to facial nerve surgery in the rat model, including descriptions of various inducible patterns of injury.

축축한 억제 및 재생을 연구하는 쥐 모델의 안면 신경 수술

This protocol describes consistent and reproducible methods to study axonal regeneration and inhibition in a rat facial nerve injury model. The facial ...

Generation of 3-D Collagen-based Hydrogels to Analyze Axonal Growth and Behavior During Nervous System Development

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is centered on culturing small pieces of embryonic or early postnatal rodent brains inside a 3-D hydrogel formed by the rat tail tendon-derived type I collagen with specific porosity. Tissue pieces are cultured inside the hydrogel and confronted to specific brain fragments or genetically-modified cell aggregates to produce and secrete molecules suitable for creating a gradient inside the porous matrix. The steps of this protocol are simple and reproducible but include critical steps to be considered carefully during its development. Moreover, the behavior of growing axons can be monitored and analyzed directly using a phase-contrast microscope or mono/multiphoton fluorescence microscope after fixation by immunocytochemical methods.

Here, we provide a method for analyzing the behavior of growing axons in 3D matrices, mimicking their natural development.

신경계 발달 중 축산 성장과 행동을 분석하는 3-D 콜라겐 기반 하이드로겔 생성

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is ...

Coculture of Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons with Olfactory Ensheathing Glia, as an In Vitro Model of Adult Axonal Regeneration

Olfactory ensheathing glia (OEG) cells are localized all the way from the olfactory mucosa to and into the olfactory nerve layer (ONL) of the olfactory bulb. Throughout adult life, they are key for axonal growing of newly generated olfactory neurons, from the lamina propria to the ONL. Due to their pro-regenerative properties, these cells have been used to foster axonal regeneration in spinal cord or optic nerve injury models.
We present an in vitro model to assay and measure OEG neuroregenerative capacity after neural injury. In this model, reversibly immortalized human OEG (ihOEG) is cultured as a monolayer, retinas are extracted from adult rats and retinal ganglion neurons (RGN) are cocultured onto the OEG monolayer. After 96 h, axonal and somatodendritic markers in RGNs are analyzed by immunofluorescence and the number of RGNs with axon and the mean axonal length/neuron are quantified.
This protocol has the advantage over other in vitro assays that rely on embryonic or postnatal neurons, that it evaluates OEG neuroregenerative properties in adult tissue. Also, it is not only useful for assessing the neuroregenerative potential of ihOEG but can be extended to different sources of OEG or other glial cells.

We present an in vitro model to assess olfactory ensheathing glia (OEG) neuroregenerative capacity, after neural injury. It is based on a coculture of axotomized adult retinal ganglion neurons (RGN) on OEG monolayers and subsequent study of axonal regeneration, by analyzing RGN axonal and somatodendritic markers.

축 축 하 재생의 시험관 내 모델로, 후각 천시 글리아와 축 축 절 망막 신경의 공동 문화

Olfactory ensheathing glia (OEG) cells are localized all the way from the olfactory mucosa to and into the olfactory nerve layer (ONL) of the olfactory ...

Utilizing In Vivo Postnatal Electroporation to Study Cerebellar Granule Neuron Morphology and Synapse Development

Neurons undergo dynamic changes in their structure and function during brain development to form appropriate connections with other cells. The rodent cerebellum is an ideal system to track the development and morphogenesis of a single cell type, the cerebellar granule neuron (CGN), across time. Here, in vivo electroporation of granule neuron progenitors in the developing mouse cerebellum was employed to sparsely label cells for subsequent morphological analyses. The efficacy of this technique is demonstrated in its ability to showcase key developmental stages of CGN maturation, with a specific focus on the formation of dendritic claws, which are specialized structures where these cells receive the majority of their synaptic inputs. In addition to providing snapshots of CGN synaptic structures&#160;throughout cerebellar development, this technique can be adapted to genetically manipulate granule neurons in a cell-autonomous manner to study the role of any gene of interest and its effect on CGN morphology, claw development, and synaptogenesis.

Utilizing In Vivo Postnatal Electroporation to Study Cerebellar Granule Neuron Morphology and Synapse Development

Here we describe a method to visualize synaptogenesis of granule neurons in the mouse cerebellum over the time course of postnatal brain development when these cells refine their synaptic structures and form synapses to integrate themselves into the overall brain circuit.

소뇌 과립 뉴런 형태 및 시냅스 발달을 연구하기 위해 생체 내 출생 후 전기천공법 활용

Neurons undergo dynamic changes in their structure and function during brain development to form appropriate connections with other cells. The rodent ...

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

During neuronal development, axons navigate the cortical environment to reach their final destinations and establish synaptic connections. Growth cones -the sensory structures located at the distal tips of developing axons- execute this process. Studying the structure and dynamics of the growth cone is crucial to understanding axonal development and the interactions with the surrounding central nervous system (CNS) that enable it to form neural circuits. This is essential when devising methods to reintegrate axons into neural circuits following injury in fundamental research and pre-clinical contexts. Thus far, the general understanding of growth cone dynamics is primarily founded on studies of neurons cultured in two dimensions (2D). Although undoubtedly fundamental to the current knowledge of growth cone structural dynamics and response to stimuli, 2D studies misrepresent the physiological three-dimensional (3D) environment encountered by neuronal growth cones in intact CNS tissue. More recently, collagen gels were employed to overcome some of these limitations, enabling the investigation of neuronal development in 3D. However, both synthetic 2D and 3D environments lack signaling cues within CNS tissue, which direct the extension and pathfinding of developing axons. This protocol provides a method for studying axons and growth cones using organotypic brain slices, where developing axons encounter physiologically relevant physical and chemical cues. By combining fine-tuned in utero and ex utero electroporation to sparsely deliver fluorescent reporters along with super-resolution microscopy, this protocol presents a methodological pipeline for the visualization of axon and growth cone dynamics in situ. Furthermore, a detailed toolkit description of the analysis of long-term and live-cell imaging data is included.

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

This protocol demonstrates a straightforward and robust method to study in situ axon growth and growth cone dynamics. It describes how to prepare ex vivo physiologically relevant acute brain slices and provides a user-friendly analysis pipeline.

시투에서 Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures 시각화

During neuronal development, axons navigate the cortical environment to reach their final destinations and establish synaptic connections. Growth cones ...