Name: application of fluorescent nanoparticles to study remodeling of the endo-lysosomal system by intracellular bacteria
Uploaded: 2015-01-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
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This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft by grant Z within Sonderforschungsbereich 944 &#8216;Physiology and Dynamics of Cellular Microcompartments&#8217; and HE1964/18 within priority program 1580.

10 nm의 금 나노 입자 (골드 NP에) 15 1. 합성 <ol><li> 솔루션을 준비 : 160 ml의 밀리-Q, 또는 두 번 증류 물에 2 ml의 1 % 수성 금 염화을 추가합니다. </li><li> 용액 B를 준비 : 32 ml의 밀리-Q, 또는 두 번 증류 물에 8 ml의 1 % 트라이 구연산 나트륨 × 2 H 2 O 160 ㎕의 1 % 타닌산을 추가합니다. </li><li> 60 ° C에 용액 A와 B를 따뜻하게하고 교반하면서 그들을 섞는다. 바로 다크 블루 색상을 관찰합니다. 약 15 분 후 붉은 색을 관찰한다. 그 후, 95 ° C까지 가열 5 분을 유지하고 RT에 대한 해결책을 냉각. </li><li> 탄소 코팅 격자에 NP 현탁액의 드롭을 추가하고 공기를 건조 할 수 있습니다. 투과형 전자 현미경으로 된 NP의 크기 및 형태를 확인한다. </li></ol> 로다 민 N-히드 록시 숙신 에스테르 (NHS)와 BSA와 레이블 골드 NP에 2. 코팅 (16) <ol><li> 30 분 동안 15,000 XG에 1.5 ㎖의 에펜 도르프 튜브에 900 μL에게 원심 분리기를 금 NPS를 추가합니다. 연산전통적, 5 월 한 번에 여러 개의 튜브를 준비합니다. </li><li> 900 μL의 펠렛 살균 밀리 Q 물을 다시 중단하고 100 μL 2 ㎎ / ㎖ BSA / PBS를 추가, 상층 액을 버리고 30 분 동안 800 rpm으로 소용돌이에 섞는다. </li><li> 초과 BSA를 제거하려면 60 분 동안 15,000 XG에서 준비를 원심 분리기. </li><li> 상층 액을 제거하고, 125 μl의 PBS에서 금 BSA NPS를 다시 일시 중지, 1 M 중탄산 12.5 μl를 추가합니다. </li><li> 즉시 사용하기 전에, 로다 민 NHS / DMSO의 10 ㎎ / ㎖ 용액을 제조 금 BSA NP에 현탁액 1ml를 할 로다 민 NHS / DMSO 용액 30 μl를 추가합니다. 빛에 노출을 피하고, 800 rpm으로 혼합 동안 실온에서 2 시간 (또는 O / N)에 대한 반응을 품어. </li><li> 48 시간 - 36의 기간 동안 5 버퍼 변경 4 ºC에서 PBS에 대한 투석을 통해 금 BSA-로다 민 NPS를 정화. </li><li> , NPS를 안정화 각 1 ml의 금 BSA-로다 민 NP에에 200 ㎎ / ㎖ BSA / PBS의 10 μl를 추가합니다. 15, 무료 또는 BSA-로다 민 발표 원심 분리기를 제거하려면,60 분 동안 000 XG. 빛에 대한 노출을 피하기 위해, 4 ° C에서 OD (520), 및 저장소를 측정, 2 ㎎ / ㎖ BSA / PBS에 펠렛을 재현 탁. </li><li> 밀리-Q 또는 더블 증류수로 NP에 10 배 희석, 탄소 코팅 격자 상에 드롭을 추가하고, 공기를 건조 할 수 있습니다. 투과 전자 현미경 (TEM)으로 NP에의 크기 및 형태를 확인한다. 주 : NP 제제에서 사용되는 모든 재료는 멸균시키고, 동작은 세포 배양 후드에서 화염 또는 옆 벤치에 행 하였다. </li></ol> HeLa 세포 3. 문화 <ol><li> 영구적 LAMP1-GFP를 발현하는 HeLa 세포를 10 % 소 태아 혈청 (FCS)와 DMEM에서 배양하고, 5 % CO 2를 함유하는 분위기하에 37 ℃에서 성장된다. </li><li> 8 잘 챔버 슬라이드 (Ibidi)에서 잘 50,000의 밀도로 세포를 종자 및 / N을 O를 품어. </li></ol> 박테리아 4. 문화 <ol><li> 사용 살모넬라 엔테 혈청 형 Typhimurium의 NCTC 12023 줘야D 타입 (WT) 변형. 비교를 위해, SIF에 대한 키 이펙터 시파 부족 SPI2-T3SS 및 Δ 시파에서 Δ ssaV 결함이있는 돌연변이 균주를 사용합니다. 강화 된 GFP의 구성 적 발현 플라스미드 pFPV25.1을 품고 균주를 사용합니다. 참고 : 세균 균주가 50 ㎍ / ㎖의 카르 베니 실린 및 / 또는 50 ㎍ / ㎖의 카나마이신 (Δ ssaV, Δ 시파의 추가와 함께 50 ㎍ / ml의 카르 베니 실린 (WT)와 LB의 추가와 함께 (LB) 루리아 - 베르 타니 국물에 일상적으로 배양 )의 플라스미드를 유지하는 데 필요한. </li><li> 다음 신선한 LB에 1:31 희석 3.5 시간 동안 성장을 계속, 적절한 항생제로 3 ㎖ LB에서 박테리아의 단일 콜로니를 접종하고 폭기 진탕 조건에서 37 ºC에서 / N을 O 성장. 이 시간 시점에서 배양 후반 로그 상에 도달하고 박테리아 매우 침습적이다. &#39;롤러 드럼&#39;폭기 테스트 튜브 문화를 배양하는 것이 편리하다. </li></ol> HeLa 세포의 감염에 의해 5.살모넬라 균과 골드 BSA-로다 민 NPS는 체이스 - 라벨 (방식에 대한 그림 1 참조) 펄스 <ol><li> 계대 배양 균의 OD (600)를 측정하고 1 ㎖의 PBS (~ 3 × 108 CFU / ㎖) 600 = 0.2 중독 묽은의 다양성을 달성하기 위해 8 웰 챔버 슬라이드에서 HeLa 세포에 박테리아의 적당량을 추가 감염 100 (MOI). </li><li> 비 내면화 박테리아를 제거하기 위해 PBS로 3 회, 세포 배양기에서 30 분 동안 인큐베이션 세척 (이 시점을 0 시간의 감염 후, 0 시간 또는 파이로 설정 하였다). 100 ㎍ / ㎖의 겐타 마이신을 함유하는 신선한 배지 300 μl를 추가하고 1 시간 동안 유지한다. 그런 다음 배양 시간의 나머지 10 ㎍ / ㎖의 겐타 마이신을 포함하는 새로운 매체와 매체를 교체하십시오. </li><li> 1 시간 동안 100 ㎍ / ㎖의 젠타 마이신을 함유하는 배양 배지로 배양 한 후, 배지는 공동 (30 mM의 HEPES, pH가 7.4, FCS, L 글루타민, 페놀 레드 및 중탄산 나트륨없이 이글스 MEM) 매질을 묘화로 대체10 ㎍ / ㎖의 겐타 마이신을 ntaining. 골드 BSA-로다 NPS는 OD = 0.1 (520)의 최종 농도를 얻기 위해 HeLa 세포에 첨가 하였다. 참고 : 골드 BSA-로다 민 NPS는 또한 감염 전에, 또는 다양한 시간 포인트 파이에서 세포에 첨가 할 수있다 </li><li> 1 시간 배양 한 후, 배지를 제거 PBS로 3 회 세척하고, 배양 시간의 나머지 10 % FCS 및 10 ㎍ / ㎖의 겐타 마이신을 포함하는 새로운 영상 매체의 300 μl를 추가합니다. 참고 : 배양 기간이 사용 된 NP 및 세포주의 농도에 따라 달라질 수 있습니다. RAW264.7 대 식세포를 위해, 우리는 충분히 내재화 허용 OD 520 = 0.05의 농도로 된 NP와 그 30 분의 인큐베이션을 관찰했다. </li></ol> 6. 이미징 <ol><li> 서로 다른 시간 지점에서 고해상도 이미징을위한 가습 환경 챔버와 공 초점 레이저 주사 (CLSM) 또는 회전 디스크 (SD) 현미경으로 공 초점 이미징 시스템을 사용합니다. </li><li> 온도 C에 스위치가 안정 될 때까지 시스템을 조작부 기다립니다. 이러한 확대, 스캔 속도, 해상도, Z-스택 등 GFP에 적합한 여기 / 방출 설정을 사용하여 금 BSA-로다 민 NP에 같은 이미지 설정을 최적화합니다. 이 프로토콜의 경우, 512 X 512 픽셀의 400 Hz의 스캔 속도, 해상도 및 0.25 μm 인 Z-스텝 크기를 사용한다. GFP 각각 아르곤 레이저 (488 nm의)와 헬륨 네온 레이저 (543 nm의)를 사용하여 금 BSA-로다 민을 흥분. 세포의 형태를 관찰하기위한 명 시야 (BF) 채널을 포함. 현미경 시스템 및 다른 감염 조건의 경우, 설정은 적절하게 조정되어야한다. 참고 사진 승수 (PMT) 검출기로 검출 된 BF 채널과 신호의 광원과 같은 아르곤 레이저를 사용합니다. </li><li> 표시된 시간 - 점에서 PI, 스테이지 현미경 및 기록 이미지에 감염된 세포를 함유하는 8 웰 챔버 슬라이드 마운트. </li></ol> 이미지 7. 분석 <ol><li> 현미경 이미지 분석 소프트웨어를 사용 (참조 <strong&gt; 재료 및 장비의 표) 세포 내 살모넬라 균에 의해 엔도 - 리소좀 시스템의 개조를 분석합니다. &#39;열기&#39;를 클릭하고 파일을 선택하여 데이터를 엽니 다. 참고 : 또한, 같은 ImageJ에 나 피지 같은 오픈 소스 소프트웨어 패키지 양적 이미지에 사용될 수있다 분석한다. </li><li> 아이콘 뷰를 능가 클릭의 개체 도구 모음에서 <img alt="아이콘" fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/52058/52058icon1.jpg" /> 새로운 표면 항목을 추가 할 수 있습니다. 에 클릭 <img alt="아이콘" fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/52058/52058icon2.jpg" /> (다음). </li><li> 관심 (ROI)의 지역을 선택 세그먼트 ROI를 분석합니다. 보기 영역에서 이미지 위에 겹쳐 사각형 테두리가 절에서는 투자 수익 (ROI)을 대표한다. Y-, 해당 x 축에 값을 입력하고 Z- 필드 또는 직접 크기와 ROI의 위치를​​ 변경하려면 미리보기 사각형에 화살표를 클릭합니다. 다음을 클릭합니다 <img alt="아이콘" fo:content-width=".1in" src<html> = &quot;/ 파일 / ftp_upload / 52058 / 52058icon2.jpg&quot;/&gt; (다음). </li><li> 소스 채널로 선택 채널 3 (금 BSA-로다 민 NP에 대한 신호). 결과 영역의 부드러움을 설정하는 부드러운 옵션을 선택합니다. 수동으로 값을 정의 또는 자동으로 생성 된 값을 적용합니다. 임계 값의 경우, 절대 강도 옵션을 선택합니다. </li><li> 임계 조정 용의 옵션을 선택하고 값을 설정. 보기 영역에서, 표면 임계 미리보기가 회색으로 표시됩니다. </li><li> 탭 분류 표면에 생성 된 표면은 여러 기준에 의해 필터링 할 수 있습니다. 기본 필터는 다른 필터 &#39;복셀&gt; (10)의 수&#39;는 &#39;추가&#39;를 클릭하여 포함시킬 수있다. 필터링이 필요없는 경우, 삭제 버튼을 클릭하여 모든 필터를 삭제합니다. 클릭 <img alt="아이콘" fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/52058/52058icon2.jpg" /> (다음). </li><li> 표면 생성을 완료하려면 클릭/files/ftp_upload/52058/52058icon3.jpg은 &quot;/&gt; (마침). 개체 목록에서 지금 확인되지 않은 항목의 볼륨 및 새로 생성 한 표면의 상자 것은보기 영역에 표시됩니다. </li><li> 통계를 내 보냅니다. 이제 능가보기에서 대상의 색상은 지역에 따라 보라색에서 빨간색으로 변화한다. 그리고 &#39;플롯 번호 영역&#39;표는 통계 정보 (예를 들어, ID 번호와 객체의 영역)를 보여줍니다. 클릭하여 Excel 파일을 사면 (1)의 모든 통계를 내 보냅니다 <img alt="아이콘" fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/52058/52058icon4.jpg" /> (저장). </li></ol>

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포유류 세포의 엔도 리소좀 시스템은 영양소 흡수, 호르몬 - 매개 신호 전달, 면역 감시 및 항원 제시 (17)과 같은 중요 생리 학적 과정을 제어한다. 지금, 마커의 다양한 세포 내 이입 경로 및 추적 연구의 표지에 사용 된 최대. 예를 들어, LysoTracker 프로브는 선택적으로 낮은 내부 pH가 세포 구획에 축적하고 효과적으로 나노 몰 농도 18 살아있는 세포에 레이블을 지정할 수 있습니다 ...

등의 금속 NP에, 양자점, NP는 폴리머, 실리카 NP는, 탄소 도트 포함한 형광 나노 입자 (NPS는), 지난 수십 년 동안 1,2- 상당한 주목을 받고있다. 기존의 유기 염료에 비해 형광 NPS는 이러한 강한 신호 강도 photobleaching에 저항과 높은 생체 적합성과 같은 3,4- 바람직한 화학적, 광학적 및 기계적 특성을 보여준다. 이러한 장점은 그 세포 내 감지 및 라이브 세포 이미징에 대한 선택의 방법합니다. 또한, 전자 밀도가 된 NP의 다양한 EM 5 초 미세 수준에서 광학 현미경 (LM)과 높은 해상도로 추적 라이브 셀의 조합을 할 수 있습니다 상관 현미경 분석에 대한 사용을 촉진, 전자 현미경 (EM)로 볼 수 있습니다. 예를 들어, 금 NPS는 효율적 민감한 진단 살아있는 세포뿐만 아니라 면역 표지 (6)의 분야에서 바이오 센서로서 사용 장시간왔다. 최근의tudies 다른 크기 및 형상 골드 NPS에서 세포주 많은 다양한 흡수는 일상적 엔도 좀 경로를 통해 운송, 따라서 큰 잠재력의 존재는 세포 내 소포 반송 추적 및 엔도 리소좀 시스템 라벨링 적용될 용이하게 할 수 있음을 나타내 7,8 . 살모넬라 엔테, 시겔 flexneri 및 리스테리아 균 등의 미생물 병원균, 비 식세포 숙주 세포 9 침입하는 다른 메커니즘을 개발했습니다. 내면화 한 후, 병원균, 중 세포질에 지역화 또는 막 결합 구획에 압수은, 자신의 호스트 환경과 상호 작용하고 자신의 생존 (10)를 선호하는 이들을 조절. 예를 들어, 살모넬라 엔테는 상주하며 세포 내 phagosomal 구획 감염 11시 살모넬라 함유 공포 (SCV)를 지칭 내에서 복제합니다. 성숙 SCV, 골지체으로 트래픽 세포 내 이입 경로와 지속적으로 상호 작용을 진행하고, 살모넬라 유도 된 필라멘트와 같은 광범위한 관상 구조, (SIF), 넥신 세관 정렬, 살모넬라 유도 된 분비 캐리어 막 단백질 3 (SCAMP3) 세관 등의 형성을 유도 . 12 ~ 14. 이러한 병원성 세균이 숙주 세포 경로를 조작하는 방법을 공부하는 것은 이해 감염성 질환에 필수적이다. 여기서, 금 BSA-로다 된 NP는 숙주 세포 엔도 리소좀 시스템에 라벨 유체 추적자로 사용하여, 인간의 위장관 병원체 살모넬라 엔테 혈청 형 티피 뮤 리움 (살모넬라)와 병원체의 상호 작용을 연구하는 모델 박테리아로서 사용 세포 내 이입 통로를 개최. WT 살모넬라 돌연변이 균주에 감염된 비감염 세포와 세포에서의 세포 내 금 BSA-NP에 로다는 공 초점 레이저 주사 현미경 (CLSM)에 의해 촬영 하였다.이어서 Imaris 소프트웨어는 살모넬라 감염 엔도 좀 / 리소좀 극단적 재 배열을 유도 나타내는 NPS에서의 분포를 정량화하는 데 사용되었다. 이 방법의 설명에 이어, 유사한 실험은 내재화 된 NP의 장기 거동을 추적 및 진핵 세포의 세포 내 이입 경로에 다양 외인성 또는 내인성 인자 물질의 영향을 조사하기 위해 설계 될 수있다.

<table><tbody><tr><td>Gold chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>520918</td><td></td></tr><tr><td>Tannic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>403040</td><td></td></tr><tr><td>Tri-sodium citrate</td><td>Sigma</td><td>C8532</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>NHS-Rhodamine</td><td>Pierce</td><td>46406</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Applichem</td><td>A1492</td><td></td></tr><tr><td>Kanamcyin</td><td>Roth</td><td>T832</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillin</td><td>Roth</td><td>6344</td><td></td></tr><tr><td>8-well chamber slides</td><td>Ibidi</td><td>80826</td><td>tissue culture treated, sterile</td></tr><tr><td>Imaris Software</td><td>Bitplane</td><td>version 7.6</td><td>various configurations available</td></tr></tbody></table>

application of fluorescent nanoparticles to study remodeling of the endo-lysosomal system by intracellular bacteria

바람직한 화학, 광학 및 기계적 특성을 가진 형광 나노 입자 (NPS는) 세포 내 소기관에 레이블 유망한 도구입니다. 여기서, 우리는 진핵 세포의 엔도 리소좀 시스템 라벨과 세포 내 병원체 살모넬라 엔테 의해 호스트 세포질 통로의 조작을 모니터링하기 위해 골드 - 로다 BSA NPS를 이용하는 방법을 소개한다. NPS는 용이 늦은 엔도 솜 / 리소좀으로 HeLa 세포에 의해 내부화 된 및 집중 하였다. 살모넬라 감염 Salmonella- 유도 막 구조체 및 소포 및 축적 된 NP의 재 배열을 유도. 우리는 공 촛점 현미경 이미지의 정량적 분석을 위해 Imaris 소프트웨어 패키지를 배포. 개체의 개수 및 비감염 세포에서 크기 분포가 매우 WT 살모넬라 엔도 리소좀 시스템의 개장 나타내는 살모넬라 -infected 세포들로부터 구별 하였다.

골드 NPS는 구연산과 타닌산에 의해 염화 금산의 감소를 통해 확립 된 방법을 통해 생성되었다. 도 2a에 도시 된 바와 같이, 합성 금 NPS는 약 10 nm의 크기와 모양에 준 구형이다. BSA 코팅 및 로다 민 - 라벨은 형태 나 크기 (그림 2B)에 영향을 미치지 않았다. 이것은 금 NP에 용이 다양한 포유 동물 세포에 의해 흡수 및 세포 내 이입 시스템 (7)에서 ?...

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Application of Fluorescent Nanoparticles to Study Remodeling of the Endo-lysosomal System by Intracellular Bacteria

이 문서에서는 합성 및 나노 입자의 형광 라벨 NPS ()하는 방법을 설명합니다. NPS는 진핵 세포의 엔도 - 리소좀 시스템에 레이블을 펄스 - 체이스 실험에 적용되었다. 세포 내 병원균 살모넬라 엔테의 활동에 의한 엔도 - 리소좀 시스템의 조작은 라이브 세포 이미징 및 정량화 따랐다.

형광 나노 입자의 응용 프로그램은 세포 내 세균에 의해 엔도 - 리소좀 시스템의 리모델링을 연구하기 위해

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.9K 조회수.  Universität Osnabrück.  이 문서에서는 합성 및 나노 입자의 형광 라벨 NPS ()하는 방법을 설명합니다. NPS는 진핵 세포의 엔도 - 리소좀 시스템에 레이블을 펄스 - 체이스 실험에 적용되었다. 세포 내 병원균 살모넬라 엔테의 활동에 의한 엔도 - 리소좀 시스템의 조작은 라이브 세포 이미징 및 정량화 따랐다. 

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Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells

Transport of proteins and membranes from the cell surface to the Golgi and beyond is essential for homeostasis, organelle identity and physiology. To study retrograde protein traffic, we have recently developed a versatile nanobody-based toolkit to analyze transport from the cell surface to the Golgi complex, either by fixed and live cell imaging, by electron microscopy, or biochemically. We engineered functionalized anti-green fluorescent protein (GFP) nanobodies &#8212; small, monomeric, high-affinity protein binders &#8212; that can be applied to cell lines expressing membrane proteins of interest with an extracellular GFP moiety. Derivatized nanobodies bound to the GFP reporters are specifically internalized and transported piggyback along the reporters&#39; sorting routes. Nanobodies were functionalized with fluorophores to follow retrograde transport by fluorescence microscopy and live imaging, with ascorbate peroxidase 2 (APEX2) to investigate the ultrastructural localization of reporter-nanobody complexes by electron microscopy, and with tyrosine sulfation (TS) motifs to assess kinetics of trans-Golgi network (TGN) arrival. In this methodological article, we outline the general procedure to bacterially express and purify functionalized nanobodies. We illustrate the powerful use of our tool using the mCherry- and TS-modified nanobodies to analyze endocytic uptake and TGN arrival of cargo proteins.

Retrograde transport of proteins from the cell surface to the Golgi is essential to maintain membrane homeostasis. Here, we describe a method to biochemically analyze cell surface-to-Golgi transport of recombinant proteins using functionalized nanobodies in HeLa cells.

배양된 세포에서 기능성된 Nanobodies를 사용 하 여 Trans Golgi 네트워크 Endocytic 통풍 관 및 역행의 분석

Transport of proteins and membranes from the cell surface to the Golgi and beyond is essential for homeostasis, organelle identity and physiology. To ...

연구

생화학

Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome maturation is the complex and tightly regulated process during which a nascent phagosome undergoes drastic transformation through well-orchestrated interactions with various cellular organelles and compartments in the cytoplasm. This process, which is essential for the physiological function of phagocytic cells by endowing phagosomes with their lytic and bactericidal properties, culminates in fusion of phagosomes with lysosomes and biogenesis of phagolysosomes which is considered to be the last and critical stage of maturation for phagosomes. In this report, we describe a live cell imaging based method for qualitative and quantitative analysis of the dynamic process of lysosome to phagosome content delivery, which is a hallmark of phagolysosome biogenesis. This approach uses IgG-coated microbeads as a model for phagocytosis and fluorophore-conjugated dextran molecules as a luminal lysosomal cargo probe, in order to follow the dynamic delivery of lysosmal content to the phagosomes in real time in live macrophages using time-lapse imaging and confocal laser scanning microscopy. Here we describe in detail the background, the preparation steps and the step-by-step experimental setup to enable easy and precise deployment of this method in other labs. Our described method is simple, robust, and most importantly, can be easily adapted to study phagosomal interactions and maturation in different systems and under various experimental settings such as use of various phagocytic cells types, loss-of-function experiments, different probes, and phagocytic particles.

라이브 식세포에 Phagolysosome 속생의 연구

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

면역학 및 감염병학

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and frequently of indigenous origin. The ability of some anaerobic pathogens to invade human cells gives them adaptive measures to escape innate immunity as well as to modulate host cell behavior. However, ensuring that the anaerobic bacteria are live during experimental investigation of the events may pose challenges. Porphyromonas gingivalis, a Gram-negative anaerobe, is capable of invading a variety of eukaryotic non-phagocytic cells. This article outlines how to successfully culture and assess the ability of P. gingivalis to invade human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Two protocols were developed: one to measure bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize bacteria interacting with host cells. These techniques necessitate the use of an anaerobic chamber to supply P. gingivalis with an anaerobic environment for optimal growth.
The first protocol is based on the antibiotic protection assay, which is largely used to study the invasion of host cells by bacteria. However, the antibiotic protection assay is limited; only intracellular bacteria that are culturable following antibiotic treatment and host cell lysis are measured. To assess all bacteria interacting with host cells, both live and dead, we developed a protocol that uses fluorescent microscopy to examine host-pathogen interaction. Bacteria are fluorescently labeled with 2&#39;,7&#39;-Bis-(2-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein acetoxymethyl ester (BCECF-AM) and used to infect eukaryotic cells under anaerobic conditions. Following fixing with paraformaldehyde and permeabilization with 0.2% Triton X-100, host cells are labeled with TRITC phalloidin and DAPI to label the cell cytoskeleton and nucleus, respectively. Multiple images taken at different focal points (Z-stack) are obtained for temporal-spatial visualization of bacteria. Methods used in this study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

This article presents two protocols: one to measure anaerobic bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize anaerobic bacteria interacting with host cells. This study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

숙주 세포와 혐기성 세균의 상호 작용을 평가하기위한 모델 생물로 포피 진지 발리

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, survival, and glial communications. To date, numerous studies have reported that defects in these systems cause various neuronal diseases. Thus, understanding the mechanisms underlying vesicle dynamics may provide influential clues that could aid in the treatment of several neuronal disorders. Here, we describe a method for quantifying vesicle motilities, such as motility distance and rate of movement, using a software plug-in for the ImageJ platform. To obtain images for quantification, we labeled neuronal endosome-lysosome structures with EGFP-tagged vesicle marker proteins and observed the movement of vesicles using a time-lapse microscopy. This method is highly useful and simplify measuring vesicle motility in neurites, such as axons and dendrites, as well as in the soma of both neurons and glial cells. Furthermore, this method can be applied to other cell lines, such as fibroblasts and endothelial cells. This approach could provide a valuable advancement of our understanding of membrane trafficking.

The investigation of membrane trafficking is crucial for understanding neuronal functions. Here, we introduce a method for quantifying vesicle motility in neurons. This is a convenient method that can be adapted to the quantification of membrane trafficking in the nervous system.

형광 프로브를 이용한 배양 된 뉴런의 엔도 좀과 리소좀 기능의 정량화

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

신경과학

Live-Cell Fluorescence Microscopy to Investigate Subcellular Protein Localization and Cell Morphology Changes in Bacteria

Investigations of factors influencing cell division and cell shape in bacteria are commonly performed in conjunction with high-resolution fluorescence microscopy as observations made at a population level may not truly reflect what occurs at a single cell level. Live-cell timelapse microscopy allows investigators to monitor the changes in cell division or cell morphology which provide valuable insights regarding subcellular localization of proteins and timing of gene expression, as it happens, to potentially aid in answering important biological questions. Here, we describe our protocol to monitor phenotypic changes in Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus using a high-resolution deconvolution microscope. The objective of this report is to provide a simple and clear protocol that can be adopted by other investigators interested in conducting fluorescence microscopy experiments to study different biological processes in bacteria as well as other organisms.

This article provides a step-by-step guide to investigate protein subcellular localization dynamics and to monitor morphological changes using high-resolution fluorescence microscopy in Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus.

박테리아의 세포 외 단백질 국소화 및 세포 형태 변화를 조사하는 살아있는 세포 형광 현미경 검사법

Investigations of factors influencing cell division and cell shape in bacteria are commonly performed in conjunction with high-resolution fluorescence ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and functions despite the intense interorganelle molecular traffic. The techniques described in this paper are powerful means of studying protein and lipid mobility and trafficking in vivo and in their physiological environment. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and fluorescence loss in photobleaching (FLIP) are widely used live-cell imaging techniques for studying intracellular trafficking through the exo-endocytic pathway, the continuity between organelles or subcompartments, the formation of protein complexes, and protein localization in lipid microdomains, all of which can be observed under physiological and pathological conditions. The limitations of these approaches are mainly due to the use of fluorescent fusion proteins, and their potential drawbacks include artifactual over-expression in cells and the possibility of differences in the folding and localization of tagged and native proteins. Finally, as the limit of resolution of optical microscopy (about 200 nm) does not allow investigation of the fine structure of the ER or the specific subcompartments that can originate in cells under stress (i.e. hypoxia, drug administration, the over-expression of transmembrane ER resident proteins) or under pathological conditions, we combine live-cell imaging of cultured transfected cells with ultrastructural analyses based on transmission electron microscopy.

We describe the imaging approaches we use to investigate the distribution and mobility of the transfected fluorescent proteins resident in the endoplasmic reticulum (ER) by means of the confocal imaging of living cells. We also ultrastructurally analyze the effect of their expression on the architecture of this subcellular compartment.

배양 된 세포의 소포체 하위 도메인의 시각화

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

생물학

Live Fluorescence, Inverse Imaging of Cell Ruffling, and Macropinocytosis

Macropinocytosis is a highly conserved but still incompletely understood process that is essential for the uptake and ingestion of fluid, fluid-phase nutrients and other material in cells. The dramatic extension of cell surface ruffles, their closure to form macropinosomes, and the maturation of internalized macropinosomes are key events in this pathway that can be difficult to capture using conventional confocal imaging based on tracking a bolus of fluorescent cargo. Fluorescent dextrans are commonly used experimentally as fluid phase markers for macropinosomes and for other endocytic pathways. A method the lab has adopted to optimize the imaging of dextran uptake involves using live imaging of cells bathed in high concentrations of fluorescent dextran in the medium, with the unlabeled cells appearing in relief (as black). The cell ruffles are highlighted to visualize ruffle closure, and internalized macropinosomes appear as fluorescent vacuoles in the cell interior. This method is optimal for visualizing macropinosome features and allows for easy segmentation and quantification. This paper describes dual-labeling of pathways with different sized dextrans and the co-expression of lipid probes and fluorescent membrane proteins to demark macropinosomes and other endosomes. The detection of internalized dextran at an ultrastructural level using correlative light and electron microscopy (CLEM) is also demonstrated. These cell processes can be imaged using multiple live imaging modalities, including in 3D. Taken together, these approaches optimize macropinosome imaging for many different settings and experimental systems.

This protocol demonstrates dextran imaging in live cells using continuous uptake and inverse images to optimize visualization of ruffling, macropinosome maturation, and analysis of dextran and other cell labelings.

Macropinocytosis is a highly conserved but still incompletely understood process that is essential for the uptake and ingestion of fluid, fluid-phase ...

The Microscopy-Based Assay to Study and Analyze the Recycling Endosomes using SNARE Trafficking

Recycling endosomes (REs) are tubular-vesicular organelles generated from early/sorting endosomes in all cell types. These organelles play a key role in the biogenesis of melanosomes, a lysosome-related organelle produced by melanocytes. REs deliver the melanocyte-specific cargo to premature melanosomes during their formation. Blockage in the generation of REs, observed in several mutants of Hermansky-Pudlak syndrome, results in hypopigmentation of skin, hair, and eye. Therefore, studying the dynamics (refer to number and length) of REs is useful to understand the function of these organelles in normal and disease conditions. In this study, we aim to measure the RE dynamics using a resident SNARE STX13.

Recycling endosomes are part of the endosomal tubular network. Here we present a method to quantify the dynamics of recycling endosomes using GFP-STX13 as an organelle marker.

SNARE 인신매매를 사용하여 재활용 내시경을 연구하고 분석하는 현미경 기반 분석

Recycling endosomes (REs) are tubular-vesicular organelles generated from early/sorting endosomes in all cell types. These organelles play a key role in ...

An Introduction to Endocytosis and Exocytosis

Cells can take in substances from the extracellular environment by endocytosis and actively release molecules into it by exocytosis. Such processes involve lipid membrane-bound sacs called vesicles. Knowledge of the molecular architecture and mechanisms of both is key to understanding normal cell physiology, as well as the disease states that arise when they become defective. This video will first briefly review a few pivotal discoveries in the history of endo- and exocytosis research. Next, some key questions will be examined, followed by a discussion of the prominent methods used to investigate these problems, including cell labeling, fusion assays, and fluorescence imaging. Finally, it will explore current research being conducted by scientists in the field today.

Endocytosis and Exocytosis; Clathrin Coated Pits and SNAREs

내표작용 및 세포외배출 소개

Cells can take in substances from the extracellular environment by endocytosis and actively release molecules into it by exocytosis. Such processes ...

교육

JoVE Science Education

심화생물학

세포생물학

Visualization of Vesicle Motilities in Neurons Using Fluorescence Imaging

Source: Tsuruta, F., et al. <a href="https://app.jove.com/v/55488">Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates how neuronal vesicles are labeled with specific fluorescent proteins to visualize their movement. First, a plasmid coding for a fluorescent protein is incubated with a transfection agent and then introduced into a culture of neurons. Subsequently, images of the neurons are acquired and analyzed to track the vesicles&#39; movement.

Visualization of Vesicle Motilities in Neurons Using Fluorescence Imaging(형광 이미징을 사용한 뉴런의 소포 운동성 시각화)

1. Imaging Vesicle Motility

	Prepare the plasmids that will label each type of vesicle. For instance, use EGFP-Rab5 for early endosomes, EGFP-Rab7 for ...

형광 나노 입자의 응용 프로그램은 세포 내 세균에 의해 엔도 - 리소좀 시스템의 리모델링을 연구하기 위해

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