The authors thank the DFG (Hu 997/2-2) for financial support. FS acknowledges the Hanns-Seidel-Stiftung (HSS). SKr was supported by the Elitenetzwerk Bayern in the framework of the doctorate program Material Science of Complex Interfaces. SKi thanks the SFB 863 for financial support.

참고 제제, 데이터 수집 및 데이터 분석 단계를 포함하는 공정 흐름의 개요에 대해도 2 참조. 1. 시약 설치 참고 : 모든 화학 물질 취급시주의해야하며, 따라서 실험실 코트, 장갑과 눈 보호가 사용되어야한다. 모든 작업은 실험실 후드에서 수행해야합니다. 특히, 특수 장갑 클로로포름 사용의 경우 착용해야합니다. <ol><li> 드라이 빠르게 클로로포름 및 저장 건조하지만 일주일 이상 이상으로 낮은 수분 함량과 화학 물질을 사용합니다. APTES ((3- 아미노 프로필) triethoxysilan가) 및 PEG (폴리에틸렌 글리콜) (표 1 참조) 때문에 -20 ℃에서 질소 또는 아르곤 가스 양쪽에서 화학 물질을 저장 흡습성과 PEG는 공기에 산화 될 수 있습니다. </li><li> 이상적으로 질소 atmosphe와 글러브 박스 시스템 내에서, 작은 분량을 준비, 대기 중 산소와 수분에 주식의 빈번한 노출을 방지하기 위해다시. </li></ol> 2. 장비 설치 주 : 가능한 교차 오염을 방지하기 위해, 각 단계에 대한 신선하고 깨끗한 혈관을 사용합니다. <ol><li> 면도 유리 및 60 ° C에서 초음파 조에서 30 분 동안 세제 용액 핀셋. </li><li> 헹군 후 초순수로 2 회 철저 2.1 단계에서 초음파 처리 장비. </li><li> RCA 용액 중의 단계 2.1로부터의 열의 장비 (초순수, 과산화수소 및 암모니아 (5 : 1 : 1))로 75 분 동안 45 ° C의 오븐이어서 초순수로 헹구고. </li><li> 마지막으로, 건조 질소의 흐름에 따라 또는 오븐 (100 ℃, 3 시간)에 유리와 핀셋을 건조. </li></ol> 3. 팁 기능화 참고 : 핀셋, 선박 등은 스테인레스 스틸, PTFE, 유리 또는 해당되는 경우 유기 용액에서 화학적으로 안정되어 다른 물질로했다. 달리 명시되지 않는 한, R의 모든 단계를 수행배양 용액의 양이 필요 T. 캔틸레버 칩의 수에 의존한다. 캔틸레버는 모든 시간에 각각의 솔루션에 몰입되어 있는지 확인합니다. 참고 : 유기 증기의 흡입을 피하기 위해 후드를 사용합니다. <ol><li> 캔틸레버 표면 ( &#39;활성화&#39;) (약 0.5 시간)에 OH-그룹의 형성 : <ol><li> 깨끗한 유리 슬라이드와 플라즈마 챔버 (100 W)에 넣어 (10 ~ 100 PN / 나노 : 죄 스프링 상수 재) 신선한 캔틸레버 칩을 배치 핀셋을 사용합니다. </li><li> 챔버 (~ 0.1 밀리바)을 대피. </li><li> 산소 가스와 홍수 챔버와 다시 대피. </li><li> (20 %, 시험 시간 : 15 분, 프로세스 압력 : 0.25 밀리바 전력) 플라즈마 처리를 활성화. </li></ol></li><li> 캔틸레버의 아미노 실란 화 (약 1 시간) : <ol><li> 플라즈마 공정 동안 이상적 이렇게 - APTES의 용액 2.5 ml를 준비 유리 페트리 접시 (표 1 참조). </li><li> Immediatel플라즈마 처리 후 Y는 아세톤에 1 초 동안 각 캔틸레버를 찍어 APTES 용액에 직후에 배치합니다. </li><li> 실온에서 15 분 동안 품어. </li><li> 조심스럽게 10 ml의 아세톤 한 번에 10 ml의 클로로포름에 두 번 캔틸레버 칩을 씻어. </li><li> 옵션 마지막 단계 : 깨끗한 유리 슬라이드에 이전 단계에서 장소 캔틸레버 칩과는 70 ° C에서 30 분 동안을 굽는다. 표면 활성화, 예를 들어, UV 처리 (12)에 대한 대안 전략도있다합니다. </li></ol></li><li> PEG 화 (약 2 시간) 참고 : 아미노 실란 화 동안 단계를 3.3.1-3.3.4 수행합니다. NHS 및 말레이 미드 그룹은 수성 환경에서 가수 분해 될 수 있으며 PEG 자체가 공기에 산화 될 수 있습니다. 따라서 (특히 단계들 사이에서) 타이밍 중요한 파라미터이다. 자세한 내용은 13를 참조하십시오. <ol><li> 클로로포름 용액 (표 1 참조)를 준비한다. </li><li> 결로를 방지하려면따뜻한 PEG은 분취 량을 열고 적절한 양을 계량하기 전에 RT까지 분말. </li><li> 폴리머 또는 아미노 그룹과 지질의 결합의 경우, 별도가 완전히 해결 될 때까지 그들을 텍싱하여 클로로포름 용액에 NHS-PEG-NHS (6 kDa의) 및 메틸 PEG-NHS (5 kDa의)를 해결한다. 농도는 표 1을 참조하십시오. <ol><li> 또한. 티올기를 갖는 중합체의 커플 링에 대해 개별적 클로로포름 용액 중에 부주의 NHS- PEG 및 메틸 - PEG-NHS를 해결한다. </li></ol></li><li> NHS- 또는 말레이 미드 및 메틸 아민 말단 PEG 분자 (: 500 전형적 1) 사이의 일정 수의 비율을 조정하기 위해 필요에 따라 솔루션을 섞는다. 이상적인 비율은 준비 - 실험 일련의 사이클에 반복적으로 결정되어야합니다. </li><li> 클로로포름의 증발을 방지하기 위해 포화 클로로포름 분위기 내에서 1 시간 동안 PEG 용액에 캔틸레버 칩 부화. </li></ol></li><li> 분자 결합을 프로브(&gt; 1 시간) : 참고 : 다음 3.4.1-3.4.3에서, AFM 팁에 서로 다른 프로브 분자의 공유 결합을위한 세 가지 예를 설명한다. 각각의 분자에 대한 프로토콜을 조정해야한다. 예 1 및 3-NHS 화학에서 실시 예 2에 티올 관능 화 된 중합체 PI- g의 -PS은 말레이 미드를 통해 화학 PEG에 결합되는 반면, 사용하는 것이 또한 참고. 세부 사항은 14를 참조하십시오. <ol><li> 폴리 (아미노산),​​ 폴리 D 티로신 (40 내지 100 kDa의) 미국 <ol><li> 1 M의 NaOH의 polytyrosine 결합 프로브 분자를 녹인다. 1 ㎎ / ㎖의 농도를 조정합니다. </li><li> 기능화 직전 스핀 탈염 칼럼 (7 kDa의 MWCO)를 사용 붕산 나트륨 완충액 (pH 8.1)에 대해 NaOH를 교환 </li><li> 에탄올 5 ㎖와 마지막 붕산 버퍼 5 ml의 클로로포름 5 ㎖, 먼저 캔틸레버를 씻어. </li><li> polytyrosine 보레이트 완충액에 1 시간 동안 캔틸레버 칩 부화 후 보레이트 완충액으로 씻어초순수. 측정 할 때까지 초순수에 저장합니다. </li></ol></li><li> 선형 골격 (폴리 이소프렌, 119 kDa의)을 갖는 그래프트 측쇄 (폴리스티렌, 88 kDa의) 14 중합체 <ol><li> 건조 클로로포름에 PI- g -PS을 녹여. 4 ㎎ / ㎖로 접합 용액의 농도를 조정. </li><li> 클로로포름 5 ㎖와 캔틸레버를 헹구고 활용 솔루션에 적어도 1 시간 동안 배양한다. </li><li> 클로로포름 5 ㎖에 다시 린스 클로로포름 포화 환경에서 클로로포름에서 측정까지 저장 (클로로포름 증발을 방지하기 위해). </li></ol></li><li> 지질 교황 <ol><li> 건조 클로로포름에 교황을 녹이고. 20 mm로 농도를 조절합니다. </li><li> 에탄올 5 ㎖ 및 지질 용액에서 1 시간 동안 인큐베이션 캔틸레버 전에 초순수 5 mL를 캔틸레버 헹군다. </li><li> 배양 후, 클로로포름 5 ㎖, 5 ㎖ 에타와 캔틸레버 린스L (이 순서대로) 따뜻한, 초순수 5 ml의 언 바운드 프로브 분자를 제거하고 클로로포름 잔류 없애. 즉시 작용 팁을 사용합니다. 필요할 때까지 또는 클로로포름에 저장합니다. </li></ol></li></ol></li></ol><img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52456/52456fig1.jpg" /> 도 1. (A) 회로도 NHS 화학의 예를 사용하여 팁 기능화 과정을 도시. 아미노기를 통해 팁 프로브 분자를 부착하기 위해 사용 (B) 화학 결합이. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52456/52456fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 4. 표면 처리 <ol><li> 자기 조립 단분자막 (SAM) 주 : 제로서, 예를 들면면, 자기 조립 단분자막이 선택되었다. 문학 (15)을 참조하십시오 </s자세한 내용은&gt;입니다. <ol><li> 각 30 분간 초음파 조에서 초순수 회 후 세제와 함께 청소 유리 슬라이드. 그런 다음, 추가 세척 단계로, 15 분 동안 75 ° C에서 RCA 솔루션 (단계 2.3 참조)에 배치합니다. </li><li> 코트 10 nm의 니켈 및 크롬 진공 코팅기 100 nm의 금 슬라이드. 그리고 바로 다음 단계로 넘어 가기 전에 RCA 용액에 다시 냉장고 청소에 저장합니다. </li><li> 12 시간 동안 2 mM의 1- 도데 칸 티올 / 에탄올 용액을 이전 단계에서의 슬라이드를 배양한다. 티올 그룹은 금 표면에 결합하여 소수성 단층 자기 조립. 질소 가스 스트림에 의해 에탄올과 초순수로 건조한 후 슬라이드를 헹군다. CCD 카메라 (10)와 각도계 정적 접촉각 측정과 준비된 표면의 소수성을 확인한다. </li></ol></li><li> 수소 종료 다이아몬드 참고 : 예를 들어 두 번째 표면은, 수소 종단 된 다이아몬드 선정. 앞서 설명한 바와 같이 16 같은 표면 처리가 수행되었다. </li><li> 지원 지질 이중층 주 : 마지막 예에서,지지 표면 지질 이중층 (SLB)이 표면으로 사용 하였다. 이러한 표면을 얻기 위해 POPC 인지질로 이루어진 대형 단층 라멜라 소포 (LUVs)의 용액 (0.1 ㎎ / ㎖) 압출 법에 의해 형성 하였다. 이어서 LUV 용액 50 μL 갓 절단 운모 시트 (A = 1 cm² 이상)에 넣어 30 분 동안 인큐베이션 하였다. 최종적으로 용액을 초순수 20 ㎖로 세정 하였다. SLB 수의 준비에 대한 자세한 설명은 17, 18를 참조하십시오. </li></ol> 5. 데이터 수집 주 : 실험을 위해, 액체에서 측정 할 수있는 기능을 제공 AFM을 사용한다. 데이터 수집 및 데이터 분석 절차에 관계없이 사용 AFM 모델을 적용 할 수있다. 또한, 일부 실험에서 그것을 그리고 온도를 제어 할 수있을 것이 유리하다액체 셀 내의 전자. 캔틸레버 휨은 레이저 빔 (19)에있어서의 편향을 통해 검출 하였다. 스프링 상수는 열잡음 방법 (20)로 측정 하였다. <ol><li> 유체의 측정에 적합 AFM 캔틸레버 홀더에 작용 캔틸레버를 삽입합니다. </li><li> (준비 위 참조) 표면을 넣어 AFM으로 샘플링하고 액체로 커버. 모두, 캔틸레버 표면은 이제 캔틸레버 팁이 표면을 향해 가리키는 액체에 몰두해야한다. 많은 경우에 액체의 드롭이 충분합니다. 임의의 경우 유체의 증발에 유체 밀폐 셀을 사용하여, 예를 들면, 피해야한다. </li><li> 해당되는 경우, 컨트롤러에 원하는 온도를 조정합니다. </li><li> 시스템은 적어도 반 시간 동안 평형하자. </li><li> 제동 효과를 어떤 표면을 배제하기 위해 멀리 표면으로부터 캔틸레버와, 캔틸레버의 열 잡음 스펙트럼을 기록한다. 참고 일반적으로 1 그0 이상의 스펙트럼은 충분한 신호 대 잡음비를 얻기 위해 축적되어야한다. </li><li> 표면에 접근. 팁 선단 형상 및 작용을 절약하기 위해 접근 방법이 신중하게 수행되어야 함을 유념. 이 들뜨는 모드에 접근, 예를 들어,에 의해 달성 될 수있다. </li><li> 나노 / 볼트에서 측정 된 역 광 레버 감도 (InvOLS)를 결정합니다. 하드 표면에 캔틸레버 끝을 눌러이 작업을 수행합니다. <ol><li> 포토 다이오드 전압의 변화 대 피에조 이동량의 기울기를 측정함으로써 InvOLS를 결정한다. 캔틸레버 팁이 표면과 접촉하는 힘 - 거리 곡선의 부분에 줄을 장착한다. 지질 이중층 같은 부드러운 표면을 포함하는 실험에서, 지질 이중층 ( &#39;결함 반점&#39;)에 적용되지 않는 지역에서이 단계를 수행한다. </li></ol></li><li> 열 잡음 스펙트럼에 고조파 발진기를 끼워 맞춤으로써 스프링 정수 (PN / 나노 미터)를 결정. 용도스프링 정수 결정을위한 자동화 된 소프트웨어 기능; 그렇지 않으면 문학 (20)를 참조하십시오. </li><li> 실험을 시작합니다. <ol><li> 각 실험 조건에서 녹음 다수의 힘 - 거리 곡선. 1 ㎛의 거리를 철회, 5 kHz에서, 1 ㎛ / 초 팁 속도의 샘플링 속도 : 일반적으로, 실험 매개 변수에 대해 다음 값을 사용합니다. 주 : 때로는 실험 연구의 역학에 따라, ( &#39;드웰 시간&#39;) 표면과 접촉 팁과 일정 시간을 기다려야 할 필요가있을 수도있다. 참고 : 실험은 특정 매개 변수는 위의 값에서 실질적으로 벗어날 수 있습니다. </li><li> 장기 측정시, 포토 다이오드의 위치를​​ 바꾸 때때로 포토 다이오드상의 레이저 위치를 제로. </li><li> 선택 사항 : 모든 힘 곡선 후, 다른 XY 위치로 AFM 팁을 변경합니다. </li><li> 실험의 끝에, 감도 및 스프링을 결정 정전류 회로시스템의 일관성과 안정성을 확인하기 위해 다시 NT. 주 : 실험 전 및 후에 스프링 정수와 감도를 비교하는 것은 상기 시스템의 특성 및 팁의 특성이 실험에 걸쳐 변하지 않도록하는 수단이다. 스프링 상수의 차이 (&lt;= 15 %)가 너무 크지 않으면 스프링 정수 결정 극한 불확실성은 또한 약 15 %이기 때문에, 그것들은 평균화 될 수있다. 큰 차이를 먼저 발견하고 추가 실험을 계속하기 전에 변경 명백한 스프링 정수에 대한 원인을 제거하는 것이 좋습니다. </li></ol></li></ol> 6. 데이터 준비 참고 : 일반적으로 뉴턴과 나노 미터뿐만 아니라 데이터가 설명되어 있습니다 해결하기 위해 단위를 변환 실험의 특정 유형의 독립적 수행이 절 일반 데이터 준비 단계에서. 실험 특정 데이터 분석은 BR 있습니다iefly는 각각의 대표적인 예 절에서보다 상세히 설명했다. <ol><li> 통상적으로, 모든 데이터 준비를 수행하고 분석 소프트웨어 IGOR 프로 6에 기초하여, 예를 들면 홈 기록 알고리즘에 의해 자동 단계. </li><li> InvOLS [나노 / V]와 스프링 정수 [윈 / 나노]로 곱하여 발효 원료 편향 신호 (Defl를) [V]로 변환합니다. </li><li> 표면 (언로드 캔틸레버)로부터 충분한 거리에서 캔틸레버에 힘이 0이되는 윈하는 방식으로 힘을 상쇄. </li><li> 실제의 선단 위치 고려 캔틸레버의 휘어짐을 얻어의 Z *, (표면에 대해 측정라고도 분리)을 계산한다 : <img alt="식 (1)" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/52456/52456eq1.jpg" /></li><li> * Z = 0면의 Z 방향 위치에 대응하는 방식으로 * Z의 오프셋. 참고 : 여기에서, F는 팁 때문에 굽힘에 작용하는 힘이다캔틸레버 (단계 6.2에서 결정.), z는 (직접 악기에 의해 주어진) k는 스프링 상수 (단계 5.8에서 결정)을 나타내는 측정 된 Z-센서 위치입니다이야. </li></ol><img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52456/52456fig2.jpg" /> 샘플 준비, 데이터 수집 및 데이터 분석을 보여주는 그림 2. 공정 흐름도. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52456/52456fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<ol>
	<li>Scheuring, S., Sapra, K., M&#252;ller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+Single+Membrane+Proteins+by+Atomic+Force+Microscopy.">Probing Single Membrane Proteins by Atomic Force Microscopy.</a> Handbook of Single-Molecule Biophysics. , 449-485 (2009).</li><li>Kodera, N., Yamamoto, D., Ishikawa, R., Ando, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video+imaging+of+walking+myosin+V+by+high-speed+atomic+force+microscopy.">Video imaging of walking myosin V by high-speed atomic force microscopy.</a> Nature. 468 (7320), 72-76 (2010).</li><li>Magonov, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+Force+Microscopy+in+Analysis+of+Polymers.">Atomic Force Microscopy in Analysis of Polymers.</a> Encyclopedia of Analytical Chemistry. , (2006).</li><li>Rief, M., Clausen-Schaumann, H., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-dependent+mechanics+of+single+DNA+molecules.">Sequence-dependent mechanics of single DNA molecules.</a> Nature Structural Biology. 6 (4), 346-349 (1999).</li><li>Li, H., Linke, W. a., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+engineering+of+the+giant+muscle+protein+titin.">Reverse engineering of the giant muscle protein titin.</a> Nature. 418 (6901), 998-1002 (2002).</li><li>Bustamante, C., Smith, S. B., Liphardt, J., Smith, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+studies+of+DNA+mechanics.">Single-molecule studies of DNA mechanics.</a> Current opinion in structural biology. 10 (3), 279-285 (2000).</li><li>Zhang, W., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+mechanochemistry+of+macromolecules.">Single molecule mechanochemistry of macromolecules.</a> Progress in Polymer Science. 28 (8), 1271-1295 (2003).</li><li>Hugel, T., Rief, M., Seitz, M., Gaub, H., Netz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Stretched+Single+Polymers:+Atomic-Force-Microscope+Experiments+Versus+Ab-Initio+Theory.">Highly Stretched Single Polymers: Atomic-Force-Microscope Experiments Versus Ab-Initio Theory.</a> Physical Review Letters. 94 (4), 048301 (2005).</li><li>Stetter, F. W. S., Cwiklik, L., Jungwirth, P., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lipid+Extraction+-+The+Anchoring+Strength+of+Cholesterol+in+Liquid+Ordered+and+Liquid+Disordered+Phases.">Single Lipid Extraction - The Anchoring Strength of Cholesterol in Liquid Ordered and Liquid Disordered Phases.</a> Biophysical journal. 107 (5), (2014).</li><li>Pirzer, T., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+mechanism+of+polypeptides+and+their+location+at+hydrophobic+interfaces.">Adsorption mechanism of polypeptides and their location at hydrophobic interfaces.</a> Chemphyschem. 10 (16), 2795-2799 (2009).</li><li>Butt, H. -. J., Cappella, B., Kappl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+measurements+with+the+atomic+force+microscope:+Technique,+interpretation+and+applications.">Force measurements with the atomic force microscope: Technique, interpretation and applications.</a> Surface Science Reports. 59 (1-6), 1-152 (2005).</li><li>Nash, M. A., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Adhesion+of+a+Copolymer+to+Gold.">Single-Molecule Adhesion of a Copolymer to Gold.</a> ACS NANO. 6 (12), 10735-10742 (2012).</li><li>Hermanson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioconjugate Techniques. , (1996).</li><li>Kienle, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+molecular+architecture+on+single+polymer+adhesion.">Effect of molecular architecture on single polymer adhesion.</a> Langmuir the ACS journal of surfaces and colloids. 30 (15), 4351-4357 (2014).</li><li>Folkers, J. P., Laibinis, P. E., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+monolayers+of+alkanethiols+on+gold:+comparisons+of+monolayers+containing+mixtures+of+short-+and+long-chain+constituents+with+methyl+and+hydroxymethyl+terminal+groups.">Self-assembled monolayers of alkanethiols on gold: comparisons of monolayers containing mixtures of short- and long-chain constituents with methyl and hydroxymethyl terminal groups.</a> Langmuir. 8 (5), 1330-1341 (1995).</li><li>Dankerl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diamond+Transistor+Array+for+Extracellular+Recording+From+Electrogenic+Cells.">Diamond Transistor Array for Extracellular Recording From Electrogenic Cells.</a> Advanced Functional Materials. 19 (18), 2915-2923 (2009).</li><li>Leonenko, Z. V., Carnini, A., Cramb, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supported+planar+bilayer+formation+by+vesicle+fusion:+the+interaction+of+phospholipid+vesicles+with+surfaces+and+the+effect+of+gramicidin+on+bilayer+properties+using+atomic+force+microscopy.">Supported planar bilayer formation by vesicle fusion: the interaction of phospholipid vesicles with surfaces and the effect of gramicidin on bilayer properties using atomic force microscopy.</a> Biochimica et biophysica acta. 1509 (1-2), 131-147 (2000).</li><li>Stetter, F. W. S., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nanomechanical+Properties+of+Lipid+Membranes+are+Significantly+Influenced+by+the+Presence+of+Ethanol.">The Nanomechanical Properties of Lipid Membranes are Significantly Influenced by the Presence of Ethanol.</a> Biophysical Journal. 104 (5), 1049-1055 (2013).</li><li>Putman, C. A. J., De Grooth, B. G., Hulst, N. F., Greve, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+detailed+analysis+of+the+optical+beam+deflection+technique+for+use+in+atomic+force+microscopy.">A detailed analysis of the optical beam deflection technique for use in atomic force microscopy.</a> Journal of Applied Physics. 72 (1), 6-12 (1992).</li><li>Hutter, J. L., Bechhoefer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calibration+of+atomic-force+microscope+tips.">Calibration of atomic-force microscope tips.</a> Review of Scientific Instruments. 64 (7), 1868 (1993).</li><li>Krysiak, S., Liese, S., Netz, R. R., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+desorption+kinetics+from+single+molecule+force+spectroscopy+studies.">Peptide desorption kinetics from single molecule force spectroscopy studies.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (2), 688-697 (2014).</li><li>Li, I. T. S., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interfacial+free+energy+governs+single+polystyrene+chain+collapse+in+water+and+aqueous+solutions.">Interfacial free energy governs single polystyrene chain collapse in water and aqueous solutions.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (18), 6530-6540 (2010).</li><li>Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theory,+analysis,+and+interpretation+of+single-molecule+force+spectroscopy+experiments.">Theory, analysis, and interpretation of single-molecule force spectroscopy experiments.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15755-15760 (2008).</li><li>Stetter, F. W. S., Cwiklik, L., Jungwirth, P., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lipid+Extraction:+The+Anchoring+Strength+of+Cholesterol+in+Liquid-Ordered+and+Liquid-Disordered+Phases.">Single Lipid Extraction: The Anchoring Strength of Cholesterol in Liquid-Ordered and Liquid-Disordered Phases.</a> Biophysical Journal. 107 (5), 1167-1175 (2014).</li><li>Horinek, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+adsorption+on+a+hydrophobic+surface+results+from+an+interplay+of+solvation,+surface,+and+intrapeptide+forces.">Peptide adsorption on a hydrophobic surface results from an interplay of solvation, surface, and intrapeptide forces.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (8), 2842-2847 (2008).</li><li>Ebner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionalization+of+probe+tips+and+supports+for+single-molecule+recognition+force+microscopy.">Functionalization of probe tips and supports for single-molecule recognition force microscopy.</a> Topics in current chemistry. 285 (April), 29-76 (2008).</li><li>Geisler, M., Balzer, B. N., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer+Adhesion+at+the+Solid-Liquid+Interface+Probed+by+a+Single-Molecule+Force+Sensor.">Polymer Adhesion at the Solid-Liquid Interface Probed by a Single-Molecule Force Sensor.</a> Small. 5 (24), 2864-2869 (2009).</li><li>Morfill, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity-matured+recombinant+antibody+fragments+analyzed+by+single-molecule+force+spectroscopy.">Affinity-matured recombinant antibody fragments analyzed by single-molecule force spectroscopy.</a> Biophysical journal. 93 (10), 3583-3590 (2007).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

지난 수십 년 동안, 단일 분자 실험은 분자 메커니즘에 새로운 통찰력을 제공하는 생명 과학 이후에 매우 중요한 접근 방법 드러났다. SMFS 실험 이상적으로 하나의 동일한 분자 실험의 전체 과정에 걸쳐 사용하고 의미에서 좋은 통계를 달성했다. 앙상블 분자의 실험과 대조적으로, 실험 SMFS 희귀 이벤트 및 숨겨진 분자 상태를 감지 할 수있다. 단일 분자 실험의 또 다른 장점은 분자 동력학 시뮬레?...

지난 30 년간, 원자력 현미경 (AFM)은 그것이 모든 입체적 분자 공간 해상도를 제공하고, 다양한 용매에서 동작 할 수 있기 때문에 생체 1,2- 합성 3 재료 및 표면을 연구하는 귀중한 영상 법 것으로 밝혀졌다 환경. 또한, AFM-단일 분자 힘 분광법 (SMFS)이 정권을 μN하기 위해 PN에 이르기까지 힘을 측정 할 수있게하고 4,5 단백질 층으로 예를 들어 전례없는 통찰력, 고분자 물리학 6 주신 - 8 및 단일 분자 표면의 상호 작용 (9) - 단일 분자보다는 분자의 앙상블을 공부 뒤에 12 국지적 인의 이론적 근거는 종종 드문 사건이나 숨겨진 분자 상태를 마스크 효과를 평균 방지하는 것입니다. 또한, 등 윤곽 길이, 쿤 길이, 접착 자유 에너지, 분자 매개 변수의 다수가 될 수 있습니다를 얻을. 이것은 아래의 예에서 자세히 설명되어 있습니다. 전형적인 AFM-SMFS 실험에서, 프로브 분자는 링커 분자를 통해 매우 날카로운 팁에 연결된다. 팁 자체가 굴곡 외팔보의 단부에 위치한다. 팁이 표면에 접촉되는 경우, 프로브 분자가이 표면과 상호 작용한다. 표면으로부터 분자를 분리하기 위해, 팁, 힘, 따라서 자유 에너지의 후퇴시에 캔틸레버의 편향을 관찰함으로써 결정될 수있다. 의미있는 통계를 가져, 소위 힘 - 거리 곡선 다수 획득되어야한다. 또한, 프로브 분자가 AFM 팁에 공유 적으로 결합되어야한다 (즉, 하나의 전체 실험 기간에 걸쳐 동일한 프로브를 사용하는 분자) 진정한 단일 분자 실험을 갖도록. 여기서, 공유 결합을 통해 단일 ​​분자로 기능화 캔틸레버 용 실험 프로토콜이 제시된다. 단일 분자가 하나 또는 아미노 티오 통해 연결될 수있다AFM 팁에 L 그룹. 접합 공정은 사용되는 중합체의 용 매화 특성에 대해 설명 할 (유기 및 수성) 용매의 광범위한 다양성으로 수행 될 수있다. 첫 번째 부분에서는 일반적인 프로토콜은 공유 설명 AFM 팁에 링커 분자를 통해 단일 ​​분자 ( &quot;프로브 분자&quot;)을 첨부합니다. 이를 위해, NHS- 유기 화학 또는 말레이 미드 13 사용된다. 세 개의 예시적인 분자 프로토콜과 함께, 데이터 수집 및 데이터 분석 프로세스를 설명하고 상기 판독 참조가 제공된다. 예 분자는 다음과 같습니다 (선형) 폴리머 티로신, 그라프 트 중합체 PI- g -PS 및 지질 교황. 예 공유 시스테인을 연결하는이 프로토콜의 약간의 변형을 포함한다. 또한, 섹션은 이러한 다이아몬드 표면, CH 3 - 자체 조립 단층 및 지질 이중층으로 다른 표면의 준비에 최선을 다하고 있습니다. 이러한 인터페이스는 잠을욕실은 좋은 참조 및 예제가 될 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hellmanex III alkaline liquid concentrate (detergent solution)</td>
			<td>Hellma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RCA (ultrapure water, hydrogen peroxide (35 %), ammonia (32%); 5:1:1(v/v/v))</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectabond reagent / APTES (3-Aminopropyl)triethoxysilane</td>
			<td>Vectorlabs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry acetone (&#60; 50 ppm H2O)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry chloroform (&#62; 99.9 %)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethylamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>Biochrom, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-sodium tetraborate (&#62; 99.5 %)</td>
			<td>Biochrom, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Biochrom, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monofunctional &#945;-methoxy-&#969;-NHS PEG, 5kDa, &#8220;methyl-PEG-NHS&#8221;</td>
			<td>Rapp, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heterobifunctional &#945;,&#969;-bis-NHS PEG, 6 kDa, &#8220;NHS-PEG-NHS&#8221;</td>
			<td>Rapp, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heterobifunctional &#945;-maleimidohexanoic- &#969;-NHS PEG, 5 kDa, &#8220;Mal-PEG-NHS&#8221;</td>
			<td>Rapp, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe molecule (polymer, lipid, etc.)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sufficient amount of glass crystallising dishes with spout (10 ml), glass petri dishes (500 &#181;l) and glass lids</td>
			<td>VWR International GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory oven model UF30</td>
			<td>Memmert, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controlled sonicator</td>
			<td>VWR International GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma system &#34;Femto&#34;, 100 W</td>
			<td>Diener, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One separate glass syringe for each organic solvent</td>
			<td>VWR International GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>VWR International GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes (0.5 ml or 1.5 ml)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes: 10-100 &#181;l, 50-200 &#181;l and 100-1000 &#181;l</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM with temperature controlled fluid cell (e.g. MFP-3D with BioHeater)</td>
			<td>Asylulm Research, Santa Barbara</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soft SiN cantilevers cantilever, typically made from silicon nitride (SiN) (spring constant less than 100 pN/nm, e.g. MLCT)</td>
			<td>Bruker AXS, Santa Barbara</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating single molecule adhesion by atomic force spectroscopy

원자 힘 분광법은 표면 및 계면의 분자를 연구하는 이상적인 도구입니다. 공유 AFM 팁 위에 몇 단일 분자의 큰 다양한 실험 프로토콜을 제시한다. 동시에 AFM 팁은 AFM 팁에 부착 된 단일 분자를 연구하기위한 필수 조건이다 팁과 기판 사이의 비특이적 인 상호 작용을 방지하기 위해 비활성화된다. 분석은 부착력, 접착 길이, 곧 발표되고 상기 판독을위한 외부 참조가 제공되는 고체 표면과 바이오 인터페이스에 대한 이들 분자의 자유 에너지를 결정한다. 예 분자는 폴리 (아미노산) polytyrosine이며, 그래프트 중합체 PI- g -PS 및 인지질 POPE (1- 팔미 토일 -2- oleoyl- SN -glycero -3- phosphoethanolamine). 이 분자는 CH 3 -SAMs 같은 다른 표면, 수소 종료 다이아몬드로부터 탈착 다양한 용매 조건에서 지질 이중층을 지원합니다. 마지막으로,힘 분광 단일 분자 실험의 장점은 진정한 단일 분자 실험에서 연구 된 경우 수단​​이 결정을 포함하여 논의된다.

이하, 상술의 결과는, 예를 분자, 즉 중합체 폴리 (아미노산)을 설명 polytyrosine, 그래프트 중합체 PI- g -PS 및 인지질 POPE가 제시된다. 우선 각 실시 예에 대해, 제공되는 데이터 수집 및 데이터 준비에 대한 특정 세부 사항을 실험. 그런 다음, 이러한 분자가 다른 표면에서 탈착 된 실험 실시 결과 (CH 3 -SAMs, 수소 종료 다이아몬드 및 지질 이중층)가 표시됩니다. 접착력, 접착 길이 및 자?...

Watch this Scientific Journal Video about Investigating Single Molecule Adhesion by Atomic Force Spectroscopy at JoVE.com

Investigating Single Molecule Adhesion by Atomic Force Spectroscopy

A protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. Procedures and examples to determine the adhesion force and free energy of these molecules on solid supports and bio-interfaces are provided.

원자 힘 분광학에 의해 단일 ​​분자 접착 조사

Atomic force spectroscopy is an ideal tool to study molecules at surfaces and interfaces. An experimental protocol to couple a large variety of single ...

investigating-single-molecule-adhesion-by-atomic-force-spectroscopy

Research

JoVE Journal

Engineering

10.2K 조회수.  Technische Universität München. A protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. Procedures and examples to determine the adhesion force and free energy of these molecules on solid supports and bio-interfaces are provided.

원자 힘 분광학에 의해 단일 ​​분자 접착 조사

원자 힘 분광학에 의해 단일 분자 접착 조사